外泌体负载的miR-520a-5p对胎鼠宫内生长受限妊娠结局的改善作用及其机制

Effect of exosomes loaded with miR-520a-5p on pregnancy outcomes in fetal mice with intrauterine growth restriction and its mechanism

摘要

目的 探讨外泌体（Exos）负载的微小RNA-520a-5p（miR-520a-5p）对胎鼠宫内生长受限（FGR）妊娠结局的影响，并阐明其作用机制。 方法 体外培养小鼠胎盘间充质干细胞（MSCs），并利用miR-520a-5p腺病毒载体（Ad-miR-520a-5p）转染获得高负载miR-520a-5p的Exos（miR-520a-5p-MSCs-Exos）并进行鉴定。C57BL/6小鼠按照雌雄2∶1的比例合笼交配成功妊娠，将40只怀孕小鼠分为对照组、FGR组、NC-MSCs-Exos组和miR-520a-5p-MSCs-Exos组，每组10只。除对照组外，其余组小鼠采用孕期过度暴露地塞米松（DEX）诱发妊娠期母体小鼠的FGR模型。检测胎鼠出生体质量和生后1、2、3及4周体质量，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组小鼠胎盘组织中miR-520a-5p、DNA甲基转移酶3b（DNMT3b）和血管内皮生长因子（VEGF）mRNA表达水平，Western blotting法检测各组小鼠胎盘组织中DNMT3b和VEGF蛋白表达水平，甲基化特异性PCR（MSP）分析各组小鼠胎盘组织中VEGF启动子甲基化率，双荧光素酶报告基因实验验证miR-520a-5p与DNMT3b之间的靶向关系。 结果 透射电子显微镜（TEM）和纳米粒子追踪分析（NTA）分析，Exos呈球形，粒径集中在100 nm附近；Western blotting法，Exos表面生物标志物CD63和CD81均呈阳性表达；RT-qPCR法，与NC-MSCs-Exos和Ad-NC-MSCs-Exos比较，Ad-miR-520a-5p-MSCs-Exos中miR-520a-5p表达水平升高（P<0.001）。4组子代小鼠出生体质量和生后1、2及3周体质量比较差异均有统计学意义（F=36.084，F=19.851，F=77.755，F=103.223；P<0.001）。与对照组比较，FGR组子代小鼠出生体质量和生后1、2及3周体质量均降低（P<0.05）；与FGR组和NC-MSCs-Exos组比较，miR-520a-5p-MSCs-Exos组子代小鼠出生体质量和生后1、2及3周体质量均升高（P<0.05）。单因素方差分析，4组小鼠胎盘组织中miR-520a-5p、DNMT3b和VEGF mRNA表达水平比较差异有统计学意义（F=103.224，F=856.460，F=214.563；P<0.001）；组间两两比较，与对照组比较，FGR组小鼠胎盘组织中miR-520a-5p和VEGF mRNA表达水平降低（P<0.05），DNMT3b mRNA表达水平升高（P<0.05）；与FGR组和NC-MSCs-Exos组比较，miR-520a-5p-MSCs-Exos组小鼠胎盘组织中miR-520a-5p和VEGF mRNA表达水平升高（P<0.05），DNMT3b mRNA表达水平降低（P<0.05）。单因素方差分析，4组小鼠胎盘组织中DNMT3b和VEGF蛋白表达水平比较差异有统计学意义（F=245.601，F=149.360；P<0.001）；组间两两比较，与对照组比较，FGR组小鼠胎盘组织中DNMT3b蛋白水平升高（P<0.05），VEGF蛋白表达水平降低（P<0.05）；与FGR组和NC-MSCs-Exos组比较，miR-520a-5p-MSCs-Exos组小鼠胎盘组织中DNMT3b蛋白表达水平降低（P<0.05），VEGF蛋白表达水平升高（P<0.05）。单因素方差分析，4组小鼠胎盘组织中VEGF启动子甲基化率比较差异有统计学意义（F=687.096，P<0.001）；组间两两比较，与对照组比较，FGR组小鼠胎盘组织中VEGF启动子甲基化率升高（P<0.05）；与FGR组和NC-MSCs-Exos组比较，miR-520a-5p-MSCs-Exos组小鼠胎盘组织中VEGF启动子甲基化率降低（P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验，与miR-NC组比较，miR-520a-5p组DNMT3b-WT报告载体细胞的荧光素酶活性明显降低（P<0.05）；与miR-NC组比较，miR-520a-5p组DNMT3b-MUT报告载体细胞的荧光素酶活性无明显改变，差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 高负载miR-520a-5p的MSCs来源的Exos可能通过靶向下调DNMT3b表达，抑制VEGF甲基化，促进VEGF表达，改善FGR胎鼠妊娠结局。

Abstract

Objective To discuss the effect of exosomes （Exos） loaded with microRNA-520a-5p（miR-520a-5p） on the pregnancy outcomes in fetal mice with intrauterine growth restriction （FGR）， and to clarify its mechanism. Methods The mouse placental mesenchymal stem cells （MSCs） were cultured in vitro and transfected with miR-520a-5p adenovirus vector （Ad-miR-520a-5p） to obtain the Exos with high miR-520a-5p load （miR-520a-5p-MSCs-Exos）， which were then identified. The C57BL/6 mice were mated in cages at a female∶male ratio of 2∶1 to achieve successful pregnancy. Forty pregnant mice were divided into control group， FGR group， NC-MSCs-Exos group， and miR-520a-5p-MSCs-Exos group， with 10 mice in each group. Except for control group， the mice in other groups were exposed to excessive dexamethasone （DEX） during pregnancy to induce FGR models in the pregnant mice. The body weights of the fetal mice at birth and at 1， 2， 3， and 4 weeks after birth were detected； real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） method was used to detect the expression levels of miR-520a-5p， DNA methyltransferase 3b（DNMT3b）， and vascular endothelial growth factor（VEGF） mRNA in placenta tissue of the mice in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of DNMT3b and VEGF proteins in placenta tissue of the mice in various groups； methylation-specific PCR （MSP） was used to analyze the methylation rates of VEGF promoter in placenta tissue of the mice in various groups； dual-luciferase reporter gene assay was used to verify the targeting relationship between miR-520a-5p and DNMT3b. Results The results of transmission electron microscope（TEM） and nanoparticle tracking analysis（NTA） showed that the Exos were spherical with particle size concentrated near 100 nm； the Western blotting method results showed that the surface biomarkers CD63 and CD81 of Exos were positively expressed. The RT-qPCR results showed that compared with NC-MSCs-Exos and Ad-NC-MSCs-Exos， the expression level of miR-520a-5p in Ad-miR-520a-5p-MSCs-Exos was increased （P<0.001）. The differences in birth body weight and the body weights at 1， 2， and 3 weeks after birth of the fetal mice among four groups were statistically significant （F=36.084， F=19.851， F=77.755， F=103.223； P<0.001）. Compared with control group， the birth body weight and the body weights at 1， 2， and 3 weeks after birth of the fetal mice in FGR group were decreased （P<0.05）； compared with FGR group and NC-MSCs-Exos group， the birth body weight and the body weights at 1， 2， and 3 weeks after birth of the fetal mice in miR-520a-5p-MSCs-Exos group were increased （P<0.05）. The One-way ANOVA results showed that the differences in the expression levels of miR-520a-5p， DNMT3b， and VEGF mRNA in placenta tissue of the mice among four groups were statistically significant （F=103.224， F=856.460， F=214.563； P<0.001）. The pairwise comparison between groups showed that compared with control group， the expression levels of miR-520a-5p and VEGF mRNA in placenta tissue of the mice in FGR group were decreased （P<0.05）， and the expression level of DNMT3b mRNA was increased （P<0.05）； compared with FGR group and NC-MSCs-Exos group， the expression levels of miR-520a-5p and VEGF mRNA in placenta tissue of the mice in miR-520a-5p-MSCs-Exos group were increased （P<0.05）， and the expression level of DNMT3b mRNA was decreased （P<0.05）. The One-way ANOVA results showed that the differences in the expression levels of DNMT3b and VEGF proteins in placenta tissue of the mice among four groups were statistically significant （F=245.601， F=149.360； P<0.001）. The pairwise comparison between groups showed that compared with control group， the expression level of DNMT3b protein in placenta tissue of the mice in FGR group was increased （P<0.05）， and the expression level of VEGF protein was decreased （P<0.05）； compared with FGR group and NC-MSCs-Exos group， the expression level of DNMT3b protein in placenta tissue of the mice in miR-520a-5p-MSCs-Exos group was decreased （P<0.05）， and the expression level of VEGF protein was increased （P<0.05）. The One-way ANOVA results showed that the difference in the methylation rate of VEGF promoter in placenta tissue of the mice among four groups was statistically significant （F=687.096， P<0.001）. The pairwise comparison between groups showed that compared with control group， the methylation rate of VEGF promoter in placenta tissue of the mice in FGR group was increased （P<0.05）； compared with FGR group and NC-MSCs-Exos group， the methylation rate of VEGF promoter in placenta tissue of the mice in miR-520a-5p-MSCs-Exos group was decreased （P<0.05）. Dual-luciferase reporter gene assay results showed that compared with miR-NC group， the luciferase activity in the cells containing DNMT3b-WT reporter vector in miR-520a-5p group was decreased （P<0.05）； compared with miR-NC group， the luciferase activity in the cells containing DNMT3b-MUT reporter vector in miR-520a-5p group had no change， no significant difference was observed （P>0.05）. Conclusion The MSCs-derived Exos highly loaded with miR-520a-5p may improve the pregnancy outcomes of FGR fetal mice by targeting and down-regulating the expression of DNMT3b， inhibiting VEGF methylation， and promoting VEGF expression.

Graphical abstract

关键词

胎儿宫内生长受限 / 外泌体 / 间充质干细胞 / 微小RNA-520a-5p / DNA甲基转移酶3b / 血管内皮生长因子

Key words

Fetal growth restriction / Exosome / Mesenchymal stem cell / MicroRNA-520a-5p / DNA methyltransferase 3b / Vascular endothelial growth factor

胎儿宫内生长受限（fetal growth restriction，FGR）也称为胎儿宫内生长迟缓，是指胎儿在子宫内的生长未达到其遗传潜能，通常表现为胎儿体质量低于同孕龄平均体质量的第10百分位^［1］。研究^［2］显示：FGR的发生可能与表观遗传学改变有关，包括DNA甲基化模式异常。DNA甲基化是调控基因表达最重要的表观遗传机制之一，可通过影响基因的表达和功能，参与调控胎儿生长和发 育 过 程^［3-4］。DNA 甲 基 转 移 酶 3b（DNA methyltransferase 3b，DNMT3b）是哺乳动物体内的DNA重新甲基化酶之一，主要负责“从头甲基化”，其异常表达或功能改变可能导致DNA甲基化模式的紊乱，进而影响基因表达，调控胎儿生长和发育过程^［5-6］。

微小RNA（microRNA，miR）作为一类重要的表观遗传调控因子，在胎盘发育和功能调控中发挥重要作用，可用于早期诊断和治疗FGR及其相关并发症^［7］。miR-520a来自人miR-520家族，该家族定位于人第19号染色体中，在多种肿瘤中发挥抑癌作用。研究^［8］显示：FGR妊娠的孕妇在孕早期即出现血清外泌体（exosomes， Exos） miR-520a-5p表达水平下调。此外，有研究^［9］显示：表观调控异常引起的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）启动子的高甲基化与FGR的发生有密切关联。本课题组前期采用miRNA目标基因预测软件发现miR-520a-5p与DNMT3b存在结合位点，提示DNMT3b可能是miR-520a-5p的下游潜在靶基因；据此推测miR-520a-5p可能通过调控胎盘内DNMT3b的影响胎盘生长发育和血管形成，进一步影响胎儿宫内发育，导致FGR发生。干细胞分泌的Exos包含的miRNA在调节细胞增殖代谢有一定作用，且不会出现排斥反应^［10-11］。本研究利用miR-520a-5p腺病毒载体（Ad-miR-520a-5p）转染间充质干细胞（mesenchymal stem cells， MSCs），获得高负载miR-520a-5p的Exos，探讨其在FGR中的作用机制。

1 材料与方法

1.1　动物、主要试剂和仪器

50只雌性和25只雄性SPF级C57BL/6小鼠，8~10周龄，体质量30~40 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0004，无病原体条件下饲养在温度和湿度受控的房间内，保持12 h光照/12 h黑暗循环。地塞米松（dexamethasone，DEX）注射液（国药准 字 H31021298，上 海 通 用 药 业），小 鼠 胎 盘MSCs（武汉普诺赛公司），miR-520a-5p腺病毒载体（Ad-miR-520a-5p）及其对照空载体（Ad-NC）（上海Genechem 公司），兔源一抗CD63、CD81、DNMT3b和VEGF（美国Thermo Scientific公司），Exos提取试剂盒和双荧光素酶报告基因检测试剂盒（北京百奥莱博公司），逆转录试剂盒（日本TaKaRa公司），EZ DNA甲基化试剂盒（美国ZYMO RESEARCH 公司）。 Coulter Optima^TM L-80XP超速离心机（美国Beckman公司），Hitachi H-600透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）（日本Hitachi公司），纳米粒子追踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）仪（英国Malvern Panalytical公司），Synergy LX多功能酶标仪（美国BioTek公司），7500实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）仪（美国Applied Biosystems公司）。

1.2　MSCs来源Exos的提取和鉴定

1.2.1　 miR-520a-5p腺病毒转染

取生长状况良好的第4代小鼠胎盘MSCs（调整细胞浓度为1×10⁵ mL^-1），接种于6孔细胞培养板中，待生长至80%融合时，将含10%胎牛血清的完全培养基更换为含有miR-520a-5p腺病毒载体（Ad-miR-520a-5p）及其对照空载体（Ad-NC）的培养基。孵育12 h 后，更换为含10%胎牛血清的完全培养基，48 h后采用含2 mg·L^-1嘌呤霉素的培养基筛选稳定转染细胞。

1.2.2　Exos的提取

收集稳定转染Ad-miR-520a-5p、Ad-NC和正常培养的MSCs的细胞培养液，4 ℃、300 g离心10 min和2 000 g离心10 min，去除死细胞和细胞碎片。2 000 g离心30 min收集上清；20 000 g离心60 min取上清，然后在超速离心机中以100 000 g离心60 min收集沉淀物。将沉淀物重新悬浮在2 mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）中，并 在 超 速 离 心 机 中 以100 000 g再次超速离心60 min。最后，将沉淀物重悬于200 μL PBS缓冲液中，即为Ad-miR-520a-5p-MSCs-Exos、 Ad-NC-MSCs-Exos和NC-MSCs-Exos，在-80 ℃下保存用于后续实验。

1.2.3　Exos的鉴定

①TEM和NTA观察Exos形态表现，测量Exos的浓度和尺寸。②Western blotting法检测Exos表面标志物CD63和CD81表达。采用蛋白质分离试剂盒提取Exos中蛋白质，BCA法测定Exos中蛋白质浓度，然后在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）上分离等量蛋白，并转膜，室温下封闭膜2 h后，在4 ℃下与一抗CD63和CD81孵育过夜，加入二抗（1∶5 000）孵育1 h。采用Image J软件定量分析Exos表面CD63和CD81表达水平。

1.3　模型制备和分组

将雌性小鼠与雄性小鼠按照2∶1的比例合笼交配。次日清晨对雌性小鼠进行阴道涂片，并置于显微镜下观察，若镜下可见阴栓，则为受孕成功，记为妊娠第0.5天。将40只怀孕小鼠分为对照组、FGR组、NC-MSCs-Exos组和miR-520a-5p-MSCs-Exos组，每组10只。除对照组外，其余组小鼠采用孕期过度暴露DEX诱发妊娠期母体小鼠的FGR模型^［12-13］：怀孕小鼠于妊娠14.5 d时连续5 d腹腔注射DEX（1 mg·kg^-1·d^-1）；对照组小鼠于相同时间给予相同量生理盐水腹腔注射。miR-520a-5p-MSCs-Exos组和NC-MSCs-Exos组小鼠在妊娠第13天时分别给予0.2 mL负载miR-520a-5p的MSCs来源Exos（Ad-miR-520a-5p-MSCs-Exos）悬液和正常培养的MSCs来源Exos（NC-MSCs-Exos）腹腔注射，连续7 d。

1.4　妊娠结局

在妊娠第19.5天，剖宫产获取胎鼠及其胎盘组织；称量胎鼠体质量，小鼠出生后每周称量体质量至出生后4周。

1.5　RT-qPCR法检测各组小鼠胎盘组织中miR-520a-5p、 DNMT3b和VEGF mRNA表达水平

使用TRIzol试剂从胎盘中提取总RNA。使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。使用SYBR Green预混液在RT-qPCR仪上对cDNA进行扩增检测靶基因的表达。收集靶基因的循环阈值（Ct）值并将其标准化为U6或β-actin的循环阈值，采用2^-ΔΔCt法计算目的基因表达水平。引物序列见表1。

1.6　Western blotting法检测各组小鼠胎盘组织中DNMT3b和VEGF蛋白表达水平

使用预冷的RIPA裂解缓冲液从胎盘组织中分离总蛋白，并使用二辛可宁酸法进行定量分析。采用10%SDS-PAGE分离蛋白质（30 µg）并转移到PVDF膜上，然后用5%脱脂牛奶在室温下封闭2 h。随后，将膜与一抗DNMT3b、VEGF（1∶1 000稀释）和β-actin（1∶2 000稀释）在4 ℃下孵育过夜。孵育12 h后，将膜进一步在室温下与HRP标记的二抗（1∶5 000稀释）孵育1 h。最后，使用增强化学发光法 （enhanced chemiluminescence， ECL） 对免疫印迹进行可视化，采用Image J（v1.8.0.112）软件进行定量分析，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/β-actin蛋白条带灰度值。1.7　甲基化特异性PCR（methylation specific PCR，MSP）分析各组小鼠胎盘组织中VEGF启动子甲基化率

采用DNA提取试剂盒从胎盘组织中分离总DNA。采用甲基化试剂盒对DNA进行亚硫酸氢盐处理，采用PCR扩增1 μg修饰DNA。甲基化和非甲基化DNA引物由上海吉凯基因医学科技股份有限公司合成。DNA扩增反应体系为25 μL：5 μL 10×PCR缓冲液、15 μL 25 mmol·L^-1 MgCl₂、2.5 μL 25 mmol·L^-1脱氧核苷酸三磷酸、正反向引物各1 μL（300 mg·L^-1）和0.5 μL DNA聚合酶。PCR在热循环仪中进行35个循环（95 ℃变性1 min，56 ℃退火2 min，72 ℃延伸1 min），然后72 ℃延伸10 min。PCR产物在2%琼脂糖凝胶中分离，凝胶成像系统成像，使用BioQ软件分析各组小鼠胎盘组织中VEGF启动子甲基化程度，并计算甲基化率。甲基化率=（甲基化样本荧光信号值/未甲基化样本荧光信号值）×100%。

1.8　双荧光素酶报告基因实验验证miR-520a-5p与DNMT3b之间的靶向关系

将含有miR-520a-5p结合位点的野生型（WT）DNMT3b 3'-UTR片段和突变型（MUT）DNMT3b 3'-UTR片段插入psiCHECK2荧光素酶报告载体，得到DNMT3b-WT和DNMT3b-MUT报 告 载 体。在 报 告 基 因 检 测 中， 使 用Lipofectamine^® 2000将产生的WT或MUT报告载体和miR-520a-5p mimics/NC共转染到HEK293T细胞中，转染后细胞分为miR-NC组和miR-520a-5p组。2 d后使用双荧光素酶报告分析系统检测2组细胞荧光素酶活性。荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。

1.9　统计学分析

采用SPSS 25.0和GraphPad Prism 8.0统计软件进行统计学分析。各组小鼠出生体质量，生后1、2和3周体质量，小鼠胎盘组织中miR-520a-5p、DNMT3b和VEGF mRNA表达水平，胎盘组织中DNMT3b和VEGF蛋白表达水平及胎盘组织中VEGF启动子甲基化率均符合正态分布和方差齐性，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　MSCs-Exos表征和miR-520a-5p表达

TEM和NTA分析结果显示：Exos呈球形，粒径集中在100 nm附近。见图1A和1B。Western blotting检测结果显示：Exos表面生物标志物CD63和CD81均呈阳性表达。见图1C。RT-qPCR检测结果显示：与NC-MSCs-Exos（1.00±0.12）和Ad-NC-MSCs-Exos （1.02±0.14） 比 较，Ad-miR-520a-5p-MSCs-Exos中miR-520a-5p表达水平（8.07±0.21）明显升高（P<0.001）。

2.2　各组小鼠妊娠结局

单因素方差分析结果显示：4组子代小鼠出生体质量和生后1、2及3周体质量比较差异均有统计学意义（F=36.084，F=19.851，F=77.755，F=103.223； P<0.001）。与对照组比较，FGR组子代小鼠出生体质量和生后1、2及3周体质量均降低（P<0.05）；与FGR组和NC-MSCs-Exos组比较，miR-520a-5p-MSCs-Exos组子代小鼠出生体质量和生后1、2及3周体质量均升高（P<0.05）。见表2。

2.3　各组小鼠胎盘组织中miR-520a-5p、DNMT3b和VEGF mRNA表达水平

单因素方差分析结果显示：4组小鼠胎盘组织中miR-520a-5p、DNMT3b和VEGF mRNA表达水平比较差异有统计学意义（F=103.224，F=856.460，F=214.563；P<0.001）。组间两两比较结果显示：与对照组比较，FGR组小鼠胎盘组织中miR-520a-5p和VEGF mRNA表达水平降低（P<0.05），DNMT3b mRNA表达水平升高（P<0.05）；与FGR组和NC-MSCs-Exos组比较，miR-520a-5p-MSCs-Exos组小鼠胎盘组织中miR-520a-5p和VEGF mRNA表达水平升高（P<0.05），DNMT3b mRNA水平降低（P<0.05）。见表3。

2.4　各组小鼠胎盘组织中DNMT3b和VEGF蛋白表达水平

单因素方差分析显示：4组小鼠胎盘组织中DNMT3b和VEGF蛋白表达水平比较差异有统计学意义（F=245.601，F=149.360；P<0.001）；组间两两比较显示：与对照组比较，FGR组小鼠胎盘组织中DNMT3b蛋白表达水平升高（P<0.05），VEGF蛋白表达水平降低（P<0.05）；与FGR组和NC-MSCs-Exos组比较，miR-520a-5p-MSCs-Exos组小鼠胎盘组织中DNMT3b蛋白水平降低（P<0.05），VEGF蛋白表达水平升高（P<0.05）。见图2。

2.5　各组小鼠胎盘组织中VEGF启动子甲基化率

单因素方差分析显示：4组小鼠胎盘组织中VEGF启动子甲基化率比较差异有统计学意义（F=687.096，P<0.001）。组间两两比较显示：与对照组比较，FGR组小鼠胎盘组织中VEGF启动子甲基化率升高（P<0.05）；与FGR组和NC-MSCs-Exos组比较，miR-520a-5p-MSCs-Exos组小鼠胎盘组织中VEGF启动子甲基化率降低（P<0.05）。见图3。

2.6　 miR-520a-5p与DNMT3b之间的靶向关系

利用在线软件TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert_72/）搜索miRNA对于靶基因DNMT3b的作用位点，预测的miR-520a-5p与DNMT3b互补结合序列（7个结合位点）见图4。

双荧光素酶实验结果显示：与miR-NC组（1.00±0.09）比较，miR-520a-5p组DNMT3b-WT报告载体细胞的荧光素酶活性（0.41±0.07）明显降低（P<0.05）；与miR-NC组（1.01±0.12）比较，miR-520a-5p组DNMT3b-MUT报告载体细胞的荧光素酶活性（0.98±0.10）无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨 论

FGR是妊娠的主要并发症，也是围产期死亡和发病的最重要原因之一^［14］。胎盘是胎儿与母体之间物质交换的重要器官，胎儿在子宫中发育依靠胎盘从母体获取营养，胎盘也负责合成多种激素、酶和细胞因子等以维持正常妊娠^［15］。Exos是一种可通过多种途径介导细胞间物质及信息传导的微型囊泡，通过胞吐作用从细胞内分泌到细胞外环境并稳定存在。研究^［16-17］显示：母体循环中存在胎盘来源的Exos，调控母体全身器官妊娠期的功能改变，以适应妊娠需求，若这一调控过程发生异常，则会引起妊娠疾病的发生，包括FGR。因此，深入研究Exos及其与FGR的关系，有望为FGR早期诊断、预防和治疗提供新思路。

MSCs具有多向分化、免疫调节、抗炎、抗凋亡和促血管生成等生物学特性，在组织修复及免疫调控等方面发挥重要作用。Exos是MSCs功能发挥的重要途径之一，其由MSCs分泌，包含多种蛋白质、mRNA、miRNA和脂质等活性成分，能够在细胞间传递信息，调节细胞功能^［18］。研究^［19］显示：miRNA在FGR的发病过程中扮演重要角色，miRNA的异常表达可能通过调控与胎儿生长相关的基因表达，影响胎盘发育、胎儿营养摄取和代谢过程，从而导致FGR。研究^［20-21］显示：miR-520a-5p在胎盘滋养细胞中特异性表达，FGR患者妊娠早期血清胎盘Exos中的miR-520a-5p表达水平低于正常妊娠孕妇，其对于在妊娠早期预测FGR具有较高的准确性，有望成为FGR新的生物预测标志物。本研究结果显示：FGR孕鼠胎盘组织中miR-520a-5p表达低于正常孕鼠。本研究通过miR-520a-5p腺病毒载体（Ad-miR-520a-5p）转染MSCs获得高负载miR-520a-5p的Exos，观察其对FGR胎鼠妊娠结局影响，结果显示：高负载miR-520a-5p的MSCs来源Exos可增加FGR子代小鼠的出生体质量和出生后1、2及3周体质量，说明高负载miR-520a-5p的MSCs来源Exos可改善FGR胎鼠妊娠结局。

miRNA主要通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA降解或者抑制其翻译，从而对基因转录后表达进行调控。DNA甲基化是一种可遗传的表观遗传过程，可以调节胎盘发育。研究^［22-23］显示：DNA甲基化在FGR发育过程中高度失调，异常的DNA甲基化模式可能会改变基因表达，进而导致FGR。为了进一步研究miR-520a-5p在FGR发生中的潜在分子机制，本研究通过生物信息学分析预测到DNMT3b可能是miR-520a-5p的下游靶基因。研究^［24］显示：DNMT3b在子痫前期孕妇胎盘组织中呈高表达，且胎盘组织中DNMT3b mRNA表达水平与子痫前期孕妇新生儿体质量呈负相关关系^［24］。本研究结果显示：FGR孕鼠胎盘组织中DNMT3b mRNA和蛋白表达水平均升高；高负载miR-520a-5p的MSCs来源Exos干预孕鼠后，胎盘组织中DNMT3b mRNA和蛋白表达水平均降低，且双荧光素酶报告基因分析证实miR-520a-5p可直接靶向DNMT3b的3'-UTR，提示高负载miR-520a-5p的MSCs来源Exos可能通过靶向下调DNMT3b的表达改善FGR胎鼠妊娠结局。

VEGF是参与胎盘血管生成的重要因子，对胚胎和胎儿的发育起重要作用，其能够促进血管内皮细胞增殖和迁移及血管形成，从而维持正常妊娠过程。研究^［25-26］显示：FGR孕妇血清中VEGF水平较健康孕妇降低，与FGR的发生呈负相关关系，对FGR具有一定的预测价值。研究^［27］显示：妊娠Balb/c小鼠感染伯氏疟原虫可导致胎盘细胞凋亡增多及VEGF表达降低，从而造成FGR，提示VEGF水平降低可能与FGR发生发展有关。研究^［9］显示：VEGF的DNA甲基化水平与FGR胎儿出生体质量呈负相关关系，与FGR妊娠呈正相关关系。本研究结果显示：FGR孕鼠胎盘组织中VEGF启动子的DNA甲基化率升高，VEGF mRNA和蛋白表达水平均降低；高负载miR-520a-5p的MSCs来源Exos干预孕鼠后，胎盘组织中VEGF mRNA和蛋白表达水平均升高，且VEGF启动子的DNA甲基化率降低，提示高负载miR-520a-5p的MSCs来源Exos可能通过靶向下调DNMT3b表达，抑制VEGF甲基化，促进VEGF表达，改善FGR胎鼠妊娠结局。

综上所述，高负载miR-520a-5p的MSCs来源Exos可能通过靶向下调DNMT3b表达抑制VEGF甲基化，促进VEGF表达，改善FGR胎鼠妊娠结局。本研究为FGR治疗提供了新思路。然而，目前关于Exos与FGR关系的研究仍处于初步阶段，需要更多的基础和临床研究来进一步验证和完善相关理论。

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基金资助

陕西省科技厅自然科学基础研究计划项目(2022JQ-804)

陕西省西安市科技局医学研究一般项目(24YXYJ0197)