白细胞介素33对恶性脑胶质瘤发生发展影响的生物信息学分析及其实验验证

Bioinformatics analysis on effect of interleukin-33 on occurrence and development of malignant brain glioma and its experimental validation

摘要

目的 利用生物信息学技术分析白细胞介素33（IL-33）在胶质瘤发生发展中的作用及其相关机制，并通过组织病理学实验进行验证，探讨IL-33作为脑胶质瘤诊治辅助标志物的可能性。 方法 从UCSC XENA数据库下载多形性胶质母细胞瘤/低级别胶质瘤（GBMLGG）病例数据，包括689例胶质瘤样本数据、5例癌旁样本数据和1 152例正常脑组织样本数据。使用Mann-Whitney U检验分析GBMLGG样本和正常脑组织中IL-33 mRNA的表达差异。根据GBMLGG组织中IL-33的表达水平，将肿瘤样本分为IL-33低表达组和IL-33高表达组，使用人类蛋白质图谱（HPA）验证IL-33在GBMLGG样本中的蛋白表达差异，使用R语言DESeq2功能包对GBMLGG肿瘤病例样本进行差异表达基因（DEGs）筛选。使用基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析对DEGs进行通路分析，同时利用基因集富集分析（GSEA）探讨IL-33在GBMLGG组织中显著富集的通路，使用GSVA功能包分析GBMLGG样本中的免疫浸润情况，采用survival数据包及survminer数据包分析IL-33表达水平对GBMLGG不同临床亚组患者生存期的影响，利用单因素和多因素Cox比例风险回归模型分析IL-33表达与GBMLGG患者临床病理特征的关系。收集GBMLGG和对照组织样本，采用免疫组织化学染色法检测GBMLGG和正常脑组织样本中IL-33及其受体致癌性抑制基因2（ST2）的表达水平。 结果 GBMLGG组织中IL-33 mRNA和蛋白表达水平较正常脑组织明显升高。IL-33低和高表达组共有634个DEGs，包括283个上调DEGs和351个下调DEGs。GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析，DEGs与激活补体经典途径、免疫球蛋白复合物形成和介导免疫球蛋白受体结合等生物学行为有关。GBMLGG病程发展中，IL-33高表达可以降解缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，诱导柠檬烯和蒎烯降解，促进丙酸代谢，同时激活利什曼病菌感染通路、Not样受体信号通路和异体移植排斥通路。IL-33高表达组树突状细胞（DC）和肥大细胞浸润水平高于IL-33低表达组，嗜酸性粒细胞、辅助性T细胞和中央记忆型T细胞（Tcm）浸润水平低于IL-33低表达组。IL-33表达水平与γδT细胞（Tgd）、辅助性T细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、Tcm和效应记忆T细胞（Tem）浸润呈正相关关系（P<0.05）；与DC、自然杀伤细胞（NK）、CD8+T细胞和CD56高表达的NK细胞浸润水平呈负相关关系（P<0.05）。IL-33高表达组和IL-33低表达组的GBMLGG患者总生存期（OS）、疾病特异性生存期（DSS）及无疾病间隔（DFI）比较差异无统计学意义（P>0.05）。临床亚组分析，少突神经细胞瘤组织中IL-33表达水平低于星形胶质细胞瘤和少突-星形细胞瘤，胶质母细胞瘤组织中IL-33表达水平高于少突神经胶质瘤。世界卫生组织（WHO）分期和年龄是影响GBMLGG患者预后的危险因素，IDH突变和主要治疗效果是影响患者预后的独立保护因素。免疫组织化学染色，与正常脑组织比较，恶性脑胶质瘤组织中IL-33及其受体ST2蛋白表达水平明显升高（P<0.05），且两者表达水平在正常脑组织和恶性胶质瘤组织中均呈正相关关系（P<0.05）。 结论 胶质瘤组织中IL-33表达水平明显升高，IL-33高表达可能是胶质瘤患者预后不良的潜在因素。

Abstract

Objective To analyze the role of interleukin-33 （IL-33） in the occurrence and development of glioma and its related mechanism by bioinformatics technology， and to validate it through histopathological experiments， and to discuss the possibility of IL-33 as an auxiliary marker for the diagnosis and treatment of brain glioma. Methods The glioblastoma multiforme/lower grade glioma（GBMLGG） case data were downloaded from the UCSC XENA database， including data of 689 glioma samples， 5 paracancerous samples， and 1 152 normal brain tissue samples； Mann-Whitney U test was used to analyze the difference in the expression of IL-33 mRNA between the GBMLGG samples and the normal brain tissues； according to the expression level of IL-33 in GBMLGG tissue， the tumor samples were divided into IL-33 low expression group and IL-33 high expression group； the Human Protein Atlas （HPA） was used to validate the difference in the protein expression of IL-33 in the GBMLGG samples； the R language DESeq2 （v.1.36.0） package was used to screen the differentially expressed genes （DEGs） in the GBMLGG tumor case samples； Gene Ontology （GO） functional enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） signaling pathway enrichment analysis were used to perform pathway analysis on the DEGs； Gene Set Enrichment Analysis （GSEA） was used to discuss the pathways significantly enriched by IL-33 in the GBMLGG tissues； GSVA package was used to analyze the immune infiltration in the GBMLGG samples； survival package and survminer package were used to analyze the effect of IL-33 expression level on the survival of the patients in different clinical subgroups of GBMLGG； univariate and multivariate Cox proportional hazards regression models were used to analyze the relationship between IL-33 expression and the clinicopathological characteristics of the GBMLGG patients； the GBMLGG and control tissue samples were collected； immunohistochemical staining was used to detect the expression levels of IL-33 and its receptor suppression of tumorigenicity 2 （ST2） in the GBMLGG and normal brain tissue samples. Results The expression levels of IL-33 mRNA and protein in the GBMLGG tissues were significantly increased compared with those in normal brain tissues； there were 634 DEGs in total between the IL-33 low and high expression groups， including 283 up-regulated DEGs and 351 down-regulated DEGs； the GO functional enrichment analysis and KEGG signaling pathway enrichment analysis results showed that the DEGs were associated with biological behaviors such as activation of the classical pathway of complement， immunoglobulin complex formation， and mediated immunoglobulin receptor binding； in the course of GBMLGG development， high expression of IL-33 could degrade valine， leucine， and isoleucine， induce limonene and pinene degradation， promote propanoate metabolism， and simultaneously activate the Leishmania infection pathway， NOD-like receptor signaling pathway， and allograft rejection pathway； the infiltration levels of dendritic cell （DC） and mast cell in the IL-33 high expression group were higher than those in IL-33 low expression group； the infiltration levels of eosinophil， helper T cell， and central memory T cell （Tcm） were lower than those in IL-33 low expression group； the expression level of IL-33 was positively correlated with the infiltration of γδT cell （Tgd）， helper T cell， macrophage， eosinophil， Tcm， and effector memory T cell （Tem） （P<0.05）； it was negatively correlated with the infiltration levels of DC， natural killer cell （NK）， CD8+T cell， and CD56bright NK cell （P<0.05）. There were no significant differences in the overall survival （OS）， disease-specific survival （DSS）， and disease-free interval （DFI） of the GBMLGG patients between IL-33 high expression group and IL-33 low expression group （P>0.05）； the clinical subgroup analysis results showed that the expression level of IL-33 in oligodendrocytoma tissues was lower than those in astrocytoma and oligoastrocytoma tissues， and the expression level of IL-33 in glioblastoma tissues was higher than that in oligodendroglioma tissues. World Health Organization （WHO） stage and age were risk factors affecting the prognosis of the GBMLGG patients， and IDH mutation and primary treatment effect were protective factors affecting the prognosis； The immunohistochemical staining results showed that compared with normal brain tissues， the expression levels of IL-33 and its receptor ST2 proteins in the malignant glioma tissues were significantly increased （P<0.05）， and their expression levels were positively correlated in both normal brain tissues and malignant glioma tissues （P<0.05）. Conclusion The expression level of IL-33 in the glioma tissue is significantly increased， and high expression of IL-33 may be a potential factor for poor prognosis in the glioma patients.

Graphical abstract

关键词

胶质瘤 / 白细胞介素33 / 免疫微环境 / 预后标志物 / 生物信息学

Key words

Glioma / Interleukin-33 / Immune microenvironment / Prognostic marker / Bioinformatics

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性实体恶性 肿 瘤^［1-2］。世 界 卫 生 组 织（World Health Organization，WHO）将成人弥漫性胶质瘤分为星形胶质细胞瘤（2、3或4级）、少突胶质细胞瘤（2或3级）和胶母细胞瘤（glioblastoma，GBM，4级）^［3］。胶质瘤的早期诊断非常困难，一旦出现较明显的临床症状往往预示病情较严重，治疗难度大，治愈希望渺茫。目前，临床上常采用手术联合放射线疗法及化学药物疗法治疗胶质瘤，但这些常规治疗手段并未有效改善胶质瘤患者的预后情况，患者经治疗后复发的概率较高，生存期相对较短^［4］。因此，寻求疗效更佳的胶质瘤治疗方法十分重要。近年来，免疫治疗和靶向治疗已成为肿瘤治疗领域的研究热点与重要发展方向。免疫疗法中，诸如树突状细胞（dendritic cell，DC）输注、树突细胞疫苗（如DCVax-L）及溶瘤病毒等创新手段，在肝癌和肺癌等多种恶性肿瘤的临床应用中展现出良好潜力，取得了较好的治疗效果^［5-6］，这也给胶质瘤的治疗带来新的曙光^［7-9］。

免疫细胞可分泌多种细胞因子，在胶质瘤发生发展过程中发挥重要作用。白细胞介素33（interleukin-33，IL-33）作为体内重要的促炎细胞因子，近年来在肿瘤研究中备受关注。IL-33是白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）细胞因子超家族的重要成员，IL-33与其受体致癌性抑制基因2（suppression of tumorigenicity 2，ST2）结合后发挥多种生理功能，如IL-33进入细胞核后与染色体结合，可直接调控生长因子和其他细胞因子的转录过程，在先天性免疫和适应性免疫等领域发挥重要作用，在肿瘤免疫微环境中参与疾病发生发展^［10-11］。研究^［12-13］显示：胶质瘤组织中IL-33的表达与钙结合蛋白1（ionized calcium-binding adapter molecule 1，Iba-1）阳性的小胶质细胞呈正相关关系，动物实验证实胶质瘤细胞分泌到胞外的IL-33可明显缩短动物的生存期，但作用于胞核的IL-33则使胶质瘤的免疫微环境发生明显变化，IL-33表现出明显的抗胶质瘤效应。目前尚未有文献阐明IL-33调控胶质瘤病程进展的具体机制。本研究利用生物信息学分析和免疫组织化学染色法探讨IL-33与胶质瘤病程发展的潜在关联及其具体机制，为IL-33作为胶质瘤诊治标志物的研究奠定基础。

1 资料与方法

1.1　数据来源及处理

从UCSC XENA数据库（https：//xenabrowser.net/datapages/）下载泛癌中IL-33的RNAseq表达数据并使用Toli^［14］流程进行统一处理，将所得数据格式由FPKM转化为TPM格式。以方便后续数据的统计与分析，对基因表达数据进行Log₂处理。

1.2　IL-33在胶质瘤和癌旁组织中的表达差异及差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）的筛选

本研究下载689例多形性胶质母细胞瘤/低级别胶质瘤（glioblastoma multiforme/lower grade glioma，GBMLGG）病例数据、5例癌旁样本数据和1 152例正常脑组织样本数据。所有数据经Toli流程统一处理后转换为TPM格式的RNAseq数据。使用Mann-Whitney U检验分析IL-33 mRNA在肿瘤组织和癌旁组织中表达的差异，以P<0.05为差异有统计学意义。以689例GBMLGG样本中IL-33表达水平的中位数作为临界值，将肿瘤组织样本分为IL-33低表达组和IL-33高表达组。使用R语言 （v4.2.1） 的DESeq2功能包 （v1.36.0）^［15］，计算差异倍数（fold change，FC），以|log₂FC|>1且P<0.05为标准，筛选IL-33低表达组和高表达组的组间DEGs，基于DEGs的筛选结果，使用Cytoscape （v3.7.2） 软件绘制蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。使用人类蛋白图谱（Human Protein Atlas，HPA）数据库分析并验证IL-33蛋白在胶质瘤及正常脑组织中的表达差异。

1.3　DEGs的富集分析

使用R语言clusterProfiler功能包（v4.4.4）^［16］对组间DEGs进行基因本体-京都基因与基因组百科全书（Gene Ontology-Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，GO-KEGG）功能和信号通路富集分析，以P<0.05为显著富集的评价标准。使用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）探讨IL-33在GBMLGG组织中显著富集的通路，以伪发现率（false discovery rate，FDR）<0.05作为通路存在显著富集的评价依据。

1.4　GBMLGG中IL-33水平与免疫浸润的相关性分析

使用R语言GSVA功能包（v1.46.0）^［17］提供的ssGSEA算法分析IL-33表达水平与24种免疫细胞浸润数量的相关性^［18］，运用Spearman分析法进行统计，并利用ggplot2（v3.3.6）工具进行结果可视化。

1.5　IL-33与胶质瘤患者预后的关系

运用survival包（v3.3.1）和survminer包（v0.4.9）进行GBMLGG患者的生存期分析^［19］，使用ggplot2工具绘制IL-33低表达组和IL-33高表达组GBMLGG患者总生存期（overall survival，OS）、疾病特异性生存期（disease-specific survival，DSS）及无疾病生存期（disease-free interval，DFI）的生存曲线。

使用单因素和多因素Cox回归比例风险模型分析IL-33在不同GBMLGG亚型中的预后价值，使用ggplot2工具分析相关结果，绘制森林图对结果进行可视化，以P<0.05为差异有统计学意义。根据多因素分析结果将WHO分级、IDH突变、主要治疗效果、患者年龄和IL-33表达水平纳入临床预后列线图的预测因素，并绘制预后校准曲线对临床预后列线图的预测水平进行评价。

1.6　临床资料

收集吉林医药学院附属医院的脑组织样本104例，其中恶性脑胶质瘤样本85例，正常脑组织样本19例（包括7例脑外伤患者样本和12例癌旁组织样本）。正常脑组织样本来源患者年龄为29~72岁，平均年龄（49.90±3.28）岁，其中男性14例，女性5例；恶性脑胶质瘤患者年龄为30~80岁，平均年龄（56.70±5.31）岁，其中男性58例，女性27例。胶质瘤患者纳入标准：①经手术切除并诊断为原发性恶性胶质瘤；②患者未经放化疗和其他药物治疗。排除标准：①患者临床信息不全；②患者被诊断为非原发性恶性脑胶质瘤患者；③患者术前经放化疗或其他药物治疗。所有患者均自愿签署患者知情同意书，且本研究获吉林医药学院附属医院伦理委员会批准（伦理审批号：2021-KJT012），符合赫尔辛基协定。

1.7　主要试剂和仪器

兔抗IL-33（bs-2633R）和兔抗ST2（bs-23758R）购自北京博奥森生物公司，辣根过氧化物酶标记的PV-9000二抗和DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物公司。光学显微镜购自日本奥林巴斯公司，电子天平购自中国上海圣科仪器设备有限公司，灭菌锅购自中国广州康迈医疗器械有限公司，移液枪购自德国艾本德生命科学公司，pH计购自山东潍坊精鹰医疗器械有限公司，阳离子载玻片购自北京中杉金桥生物公司。

1.8　HE染色法观察2组临床样本脑组织形态表现

将石蜡切片放入二甲苯和梯度酒精中脱蜡脱水；使用苏木素染色剂对切片的细胞核进行染色；将染色后的切片捞出并浸入1%的盐酸酒精中分化2~3 s，自来水冲洗10 min复蓝；将复蓝后的切片置入95%乙醇溶液中脱水15 s后浸入伊红染色剂染色30 s；捞出切片经梯度乙醇脱水后封片，显微镜下观察脑组织病理形态表现。

1.9　免疫组织化学染色法检测2组临床样本脑组织中IL-33和ST2蛋白表达情况

石蜡切片经二甲苯和梯度酒精进行常规脱蜡脱水；将取出的切片用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗3次，每次3 min；冲洗后的切片放入高压锅中，修复液液面超过切片组织，待高压修复结束后冷却至常温。将冷却后的组织切片捞出，再用PBS缓冲液冲洗3次，每次3 min；将新配置的3%过氧化氢溶液滴加到切片组织上，放入湿盒封闭30 min；取出切片后使用PBS缓冲液冲洗3次，每次3 min，冲洗后滴加一抗并将其放入4 ℃冰箱过夜。将切片由冰箱中取出，使用PBS缓冲液冲洗3次，每次3 min，洗掉切片上的一抗试剂后滴加通用型二抗，30 min后使用PBS缓冲液冲洗3次，每次3 min。使用DAB显色试剂盒进行显色，当镜下棕黄色颗粒染色深度超过背景时，将切片放入自来水中终止反应；使用苏木素试剂对切片组织细胞核进行染色，染色后将切片取出放入1%盐酸乙醇分化2~3 s；自来水冲洗1.5 h后经梯度乙醇脱水封片。

由2位经验丰富的病理科医生对切片进行双盲阅片，使用Image J软件计算2组临床样本脑组织中IL-33和ST2蛋白阳性表达率。目的蛋白阳性表达率=目的蛋白阳性染色强度/阳性面积×100%。

1.10　统计学分析

使用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析。临床样本脑组织中IL-33和ST2蛋白阳性表达率符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较使用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　GBMLGG组织中IL-33 mRNA和蛋白表达情况

IL-33 mRNA在泛癌和GBMLGG组织中表达分析结果见图1A和1B。在膀胱癌（bladder urothelial carcinoma，BLCA）、乳 腺 癌（breast invasive carcinoma，BRCA）、 宫 颈 癌 （cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma，CESC）、胆管癌（cholangiocarcinoma，CHOL）、食管癌（esophageal carcinoma，ESCA）、头颈鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma， HNSC）、肾 嫌 色 细 胞 癌（kidney chromophobe，KICH）、肾乳头状细胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP）、肝细胞肝癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）、肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）、 肺 鳞 癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（pheochromocytoma and Paraganglioma，PCPG）、前列腺癌（prostate adenocarcinoma，PRAD）、胃癌（stomach adenocarcinoma，STAD）、甲状腺癌（thyroid carcinoma，THCA）和子宫内膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC）中，IL-33 mRNA表达水平低于正常组织（P<0.05）；在结肠癌（colon adenocarcinoma，COAD）、多形性胶质细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）和肾透明细胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）组织中，IL-33 mRNA表达水平高于正常组织（P<0.05）。

HPA数据库中脑组织免疫组织化学染色结果显示：正常脑组织中IL-33蛋白表达水平较低，在GBMLGG组织中IL-33蛋白表达水平较高（图1C~图1H）。

2.2　DEGs筛选及PPI网络构建

以IL-33在GBMLGG组织中表达水平的中位数为临界值，将肿瘤样本分为IL-33低表达组和IL-33高表达组，对2组样本进行差异分析共得到624个DEGs，其中包括283个上调DEGs和351个下调DEGs（图2A），将35个差异最显著DEGs绘制成共表达热图（图2B）。使用Cytoscape绘制全部DEGs的PPI网络图（图2C），利用MCODE插件对DEGs进行分析，得到14个Hub基因并绘制共表达热图（图2D和2E）。

2.3　DEGs的功能富集分析

对634个DEGs进行GO-KEGG关键通路分析，结果显示：DEGs与激活补体经典途径、免疫球蛋白复合物形成和介导免疫球蛋白受体结合等生物学行为有关，在神经活性配体与受体的相互作用、钙离子信号传导途径和苯丙胺成瘾通路中发挥重要作用。GSEA结果表明：IL-33高表达相关基因显著富集在缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、柠檬烯和蒎烯降解、促进丙酸代谢、利什曼病菌感染、Not样受体信号通路及异体移植排斥等通路。见图3。

2.4　IL-33在GBMLGG中免疫浸润分析

免疫细胞浸润分析结果显示：IL-33高表达组树突状细胞（dendritic cell，DC）和肥大细胞浸润水平高于低表达组（P<0.05）；嗜酸性粒细胞、辅助性T细胞和中央记忆型T细胞（T central memory cell，Tcm）浸润水平低于IL-33低表达组（P<0.05）（图4A）。IL-33表达水平与γδT细胞（T gamma delta，Tgd）、辅助性T细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、Tcm和效应记忆T细胞（T effector memory，Tem）浸润呈正相关关系（P<0.05）；与DC、自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）、CD8+T细胞和CD56高表达的NK细胞浸润水平呈负相关关系（P<0.05）（图4B~4L）。

2.5　不同IL-33表达水平GBMLGG患者生存期

生存分析结果显示：IL-33高表达组和IL-33低表达组GBMLGG患者OS、DSS及DFI比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图5。各亚组人群分析结果显示：不同人种GBMLGG患者IL-33表达水平对OS无明显影响（P>0.05）；IL-33水平对发生与未发生1p/19q共缺失GBMLGG患者OS无明显影响（P>0.05）；无论GBMLGG患者年龄是否超过60岁，IL-33表达水平对患者的OS均无明显影响（P>0.05）；出现异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）突变的患者中，IL-33高表达水平患者OS明显延长（P<0.05），未出现IDH突变的患者IL-33表达水平对患者OS无明显影响（P>0.05）。见图6。

2.6　不同临床特征GBMLGG患者肿瘤组织中IL-33表达水平

临床特征分析结果显示：>60岁和≤60岁GBMLGG患者IL-33表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）；未出现1p/19q共缺失的患者IL-33表达水平高于1p/19q共缺失的患者（P<0.05）；IDH突变与IDH未突变GBMLGG患者IL-33表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）；WHO各分级患者IL-33表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）；男性GBMLGG患者IL-33表达水平明显高于女性患者（P<0.05）；不同治疗效果GBMLGG患者IL-33水平比较差异无统计学意义（P>0.05）；白种人及黑种人和美籍黑人患者IL-33表达水平高于亚洲患者（P<0.05）；少突神经细胞瘤中IL-33表达水平低于星形胶质细胞瘤和少突-星形细胞瘤（P<0.05）；胶质母细胞瘤中IL-33表达水平高于少突神经胶质瘤（P<0.05）。见图7。

2.7　临床预后模型的构建和分析

采用Cox比例风险回归分析多种临床病理因素对GBMLGG患者预后的影响，结果显示：WHO分期、IDH突变、1p/19q共表达缺失、主要治疗效果和年龄是影响GBMLGG患者预后的重要因素。多因素Cox比例风险回归分析显示：WHO分期和年龄是影响GBMLGG患者预后的独立危险因素，IDH突变和主要治疗效果是影响患者预后的独立保护因素。将多因素Cox比例风险回归分析结果中的独立影响因素及IL-33表达水平纳入临床预后列线图的评价指标，并构建预后校准曲线评估预后列线图的准确性。预后校准曲线图C指数为0.866，说明该模型预测效果较好。见图8。

2.8　IL-33及其受体ST2在2组脑组织临床样本中表达

HE染色结果显示：间变型星形母细胞瘤组织镜下可见局部肿瘤细胞数目增多且异型性增强，胞核大小形状不一，肿瘤组织周围血管内皮轻微增生。见图9A。弥漫型星形细胞瘤组织镜下可见星形细胞数目增多，细胞体积轻度增大，肿瘤细胞在脑组织中弥漫性浸润生长。见图9B。胶质母细胞瘤组织镜下可见星形细胞分化程度较低，多形性明显，细胞核形态异常，局部组织出血和囊变。见图9C。

免疫组织化学染色结果显示：IL-33蛋白阳性染色颗粒呈棕黄色，主要表达于小胶质细胞，在胶质瘤细胞和血管内皮细胞中也有少量表达。正常脑组织中IL-33蛋白阳性表达率为 （11.67±2.62）%，恶性脑胶质瘤组织中IL-33蛋白阳性表达率为（22.43±2.60）%。与正常脑组织比较，恶性脑胶质瘤组织中IL-33蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。见图9D~9F。

ST2蛋白阳性颗粒呈棕黄色，主要在小胶质细胞和胶质瘤细胞中表达。正常脑组织中ST2蛋白阳性表达率为（8.90±1.81）%，恶性脑胶质瘤组织中ST2阳性表达率为（18.41±2.40）%。与正常脑组织比较，恶性胶质瘤组织中ST2蛋白表达水平明显升高。见图9G~9I。

将不同患者脑组织样本中IL-33与其受体ST2蛋白表达水平进行相关性分析，结果发现：在正常脑组织中，IL-33水平与ST2蛋白表达水平呈正相关关系（r=0.47，P<0.05），在恶性脑胶质瘤组织中IL-33水平与ST2蛋白表达水平呈正相关关系（r=0.30，P<0.05）。见图9J~9L。

3 讨 论

GBMLGG发病率占脑部肿瘤的80%，是最常见的原发性颅内肿瘤，也可见于中枢神经组织其他部位^［20］。胶质瘤发病机制尚不明确，一般认为炎症反应过度激活可以促进胶质瘤细胞的迁移和侵袭^［21-23］，但并非所有炎性细胞因子均具有加快GBMLGG发生发展的作用。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha， TNF-α）、白细胞介素6（interleukin-6， IL-6） 和白细胞介素8（interleukin-8，IL-8）高表达可有效破坏肿瘤细胞的DNA结构，诱导细胞凋亡；基质细胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）、转 化 生 长 因 子 β（transforming growth factor-β，TGF-β）和白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）等则具有促进胶质瘤细胞增殖、延长细胞存活时间及增强细胞侵袭性等效应^［24］。

IL-33作为一种重要的炎症细胞因子，在多种肿瘤组织中发挥重要作用。研究^［25］显示：鳞状细胞 癌 中 核 因子-E2 相 关 因 子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，NRF2）促进IL-33表达及分泌，进而激活IL-33/ST2/NF-κB通路诱导肿瘤出现耐药性。SHANI等^［26］研究发现：在自发性乳腺癌转移模型小鼠和乳腺癌肺转移患者体内，IL-33在成纤维细胞中表达水平升高并诱发炎症，加快乳腺癌肺转移。DIXIT等^［27］研究表明：胰腺癌中巨噬细胞可以通过分泌TNF-α促进多种细胞分泌IL-33以增强DC和细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）的活性，激活抗肿瘤免疫反应。白成霞等^［28］研究显示：前列腺癌组织中IL-33表达水平较正常组织降低，且随着Gleason分级升高， IL-33表达水平逐级降低。LIU等^［29］研究发现：卵巢癌组织中，IL-33通过下调细胞表面死亡受体、p27和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体1［tumor necrosis factor （TNF）- related apoptosis-inducing ligand receptor 1，TRAILR1］促进癌细胞增殖并抑制细胞凋亡。但IL-33在GBMLGG发生发展过程中的作用尚未见报道。本研究采用生物信息学和免疫病理技术，探讨IL-33在GBMLGG发生发展中的作用，为GBMLGG的诊治标志物筛选及靶向治疗提供理论依据。

本研究利用生物信息学技术探讨IL-33与胶质瘤关系发现：GBMLGG组织中IL-33 mRNA和蛋白表达水平均明显高于正常脑组织；以IL-33在GBMLGG组织中表达水平中位数为临界值，将IL-33高表达组和低表达组肿瘤样本进行差异分析，共得到283个上调DEGs和351个下调DEGs，从中筛选出14个Hub基因，分别为MAP3K19、AKAP14、WDR38、CAPSL、FAM216B、STOML3、MORN5、C1orf194、TEKT1、ARMC3、RSPH4A、RBFOX3、CALB1和TTC29。进一步探讨上述差异基因发现：磷酸化CAPSL通过缩短细胞周期促进GBMLGG细胞的增殖^［30］；STOML3是蛋白质编码基因，促进胶质瘤的发生发展；TEKT1与成人脊髓室管膜瘤发生密切相关；RBFOX3是神经节细胞瘤的重要调控因子。

对634个DEGs进行关键通路富集分析发现：DEGs与激活补体经典途径、免疫球蛋白复合物形成和介导免疫球蛋白受体结合等生物学行为有关。研究^［31］证实：在不同级别胶质瘤中，较高水平的C1q表达与患者不良预后之间存在正相关关系。研究^［32-33］显示：免疫球蛋白重链γ标志物等位基因和内源性白细胞相关免疫球蛋白样受体1（leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor-1，LAIR1）高表达是胶质瘤恶性进展的重要因素。钙离子信号传导途径在胶质瘤发生中也发挥重要作用，其机制可能是谷氨酸能和钙信号通过代谢重编程及基因转换加速胶质瘤进展，形成促进胶质瘤的正反馈通路。研究^［34］表明：细胞骨架蛋白上调和细胞中Ca²⁺水平升高可增加谷氨酸释放，促进微环境中肿瘤细胞与周围细胞形成突触样连接，而上调的谷氨酸能神经元活动反之刺激胶质瘤的生长和信号传导；细胞内Ca²⁺升高可激活一氧化氮合酶活性，产生一氧化氮，进而促进胶质瘤的发生；核苷酸结合寡聚化结构域（nucleotide‑binding oligomerization domain，NOD）样受体信号通路激活可促进胶质瘤组织血管生成^［35］，而IL-33具有促进NOD样受体信号转导的作用，血管周围的一氧化氮合酶也可激活Notch信号通路^［36］。

免疫细胞浸润分析结果显示：IL-33促进DC细胞和肥大细胞浸润，但一定程度抑制嗜酸性粒细胞、辅助性T细胞和Tcm细胞浸润。DC细胞作为机体功能最强的抗原提呈细胞，在先天性和适应性免疫过程中发挥重要作用，但在胶质瘤组织中其功能受到明显抑制，因此增强肿瘤微环境中DC细胞活性可能是治疗胶质瘤的重要策略^［37］。临床研究^［38］发现：嗜酸性粒细胞与胶质瘤临床分级呈负相关关系，辅助性T细胞也具有抑制胶质瘤增殖的作用。

本研究结果显示：GBMLGG组织中IL-33表达水平与巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和Tem细胞浸润呈正相关关系，提示IL-33作为炎症因子可驱动外周巨噬细胞迁移到肿瘤组织中发生分化并促进胶质瘤进展^［39］。GBMLGG患者术后研究^［40］发现：Tem浸润升高可导致术后肿瘤复发，并损伤患者中枢神经，造成相应的功能障碍。一项GBMLGG患者生存分析^［41］发现：嗜酸性粒细胞浸润水平升高与GBMLGG患者生存期缩短有关联。

IDH催化异柠檬酸氧化脱羧，在Krebs循环和细胞稳态中发挥关键作用。编码IDH的基因在多种恶性肿瘤中发生突变，包括胶质瘤、急性髓性白血病、胆管癌、软骨肉瘤和甲状腺癌等。胶质瘤细胞IDH突变可促进氧化应激反应，进而造成DNA损伤及脂质过氧化反应增强，是胶质瘤恶性转化及进展的重要机制之一^［42］。本研究结果显示：少突神经细胞瘤中IL-33表达水平低于星形胶质细胞瘤，而胶质母细胞瘤中IL-33表达水平高于少突神经胶质瘤，说明随着胶质瘤病理分级恶性程度增加，IL-33表达水平明显升高，证实IL-33可能具有促进胶质瘤发生发展作用。

多因素Cox比例风险回归分析结果显示：WHO分期和年龄是影响GBMLGG患者预后的危险因素，IDH突变和良好的治疗效果是影响患者预后的保护因素。本研究所构建的列线图预测GBMLGG效果较好，预后校准曲线图C指数为0.866，说明IL-33高表达可作为GBMLGG患者预后复发或诊治的辅助标志物之一。

为了验证IL-33对胶质瘤的作用，本研究采用免疫组织化学染色法检测脑恶性胶质瘤组织和正常脑组织中IL-33及其受体ST2的表达情况，结果显示：IL-33和ST2在恶性脑胶质瘤组织中的表达水平较正常脑组织明显升高，结合生物信息学分析结果，提示IL-33是影响恶性脑胶质瘤病程发展的重要因子，IL-33高表达可能与患者的不良预后有密切关联。

本研究尚存在不足之处，仅使用生物信息学技术探究IL-33对GBMLGG发生发展的影响及其潜在作用机制，缺少体外细胞实验和体内动物实验对结论的支撑与验证，在后续实验中将通过体内外实验进一步研究IL-33在GBMLGG发生发展中的作用，为将IL-33作为GBMLGG临床诊治和预后复发的标志物提供科学依据。

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基金资助

吉林省科技厅基础研究项目(YDZJ202201ZYTS144)

吉林省教育厅科研资助项目(JJKH20220466KJ)