LAMP联合CRISPR/Cas12a系统检测副溶血性弧菌tlh基因方法的建立及其评价

Establishment of LAMP combined with CRISPR/Cas12a system for detecting tlh gene of Vibrio parahaemolyticus and its evaluation

摘要

目的 建立环介导等温扩增（LAMP）和簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白12a（Cas12a）（CRISPR/Cas12a）系统相结合的病原微生物快速检测方法，并评价其检测副溶血性弧菌（Vp）不耐热溶血毒素（tlh）基因的效果。 方法 以Vp的tlh基因作为靶基因，设计LAMP引物和CRISPR RNA（crRNA），构建并优化LAMP-CRISPR检测体系各成分最佳浓度配比，以蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌为对照组，建立快速检测Vptlh基因的LAMP-CRISPR/Cas12a方法，并对该方法的特异性、灵敏度、重复性和阳性符合率进行评价。 结果 该方法能特异性检出Vp，蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均为阴性结果。Vp DNA提取浓度为190.67 mg·L^-1时吸光度（A）（260）/A（280）比值为1.84。在定量PCR（qPCR）仪37 ℃、80个循环、40 min反应条件下，LAMP-CRISPR/Cas12a体系中Cas12a蛋白和crRNA的浓度为50 nmol·L^-1时肉眼亮度及相对荧光强度峰高，检测Vp DNA浓度灵敏度可达10^-6 mg·L^-1；重复性试验表明，不同实验人员在不同实验环境、不同时间重复检测结果一致。 结论 建立的LAMP-CRISPR/Cas12a方法可以快速检测Vp的tlh基因，其灵敏度高、特异度强，可实现现场短时间的可视化检测。

Abstract

Objective To establish a rapid detection method for pathogenic microorganisms by combining loop-mediated isothermal amplification （LAMP） and clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR-associated protein 12a（Cas12a） （CRISPR-Cas12a） system， and to evaluate its efficacy for detecting the thermolabile hemolysin （tlh） gene of Vibrio parahaemolyticus（Vp）. Methods Using the tlh gene of Vp as the target gene， LAMP primers and CRISPR RNA（crRNA） were designed to construct and optimize the optimal concentration ratio of each component in the LAMP-CRISPR detection system. Bacillus cereus， Staphylococcus aureus， and Escherichia coli were used as control groups， and the specificity， sensitivity， reproducibility and positive conformity rate were verified to establish a rapid LAMP-CRISPR/Cas12a method for detecting the tlh gene of Vp. Results The method specifically detected Vp， while Bacillus cereus， Staphylococcus aureus， and Escherichia coli yielded negative results. The DNA extraction concentration of Vp was 190.67 mg·L^-1 with an A（260）/（A280） ratio of 1.84. Under the reaction conditions of 37 ℃ with 80 cycles for 40 min using quantitative PCR （qPCR） method， when the concentrations of Cas12a protein and crRNA in the LAMP-CRISPR/Cas12a system were 50 nmol·L^-1， the visual brightness and relative fluorescence intensity peaks were high. The sensitivity of LAMP CRISPR/Cas12a for detecting Vp DNA concentration could reach 10^-6 mg·L^-1. The reproducibility test results showed that different experimenters had consistent results in different experimental environments and times. Conclusion The established LAMP-CRISPR/Cas12a method can rapidly detect the tlh gene of Vp with high sensitivity and specificity， and can achieve short-term visual detection in the field.

Graphical abstract

关键词

副溶血性弧菌 / CRISPR-Cas12a系统 / tlh基因 / 环介导等温扩增 / 核酸检测

Key words

Vibrio parahaemolyticus / CRISPR-Cas12a system / tlh gene / Loop-mediated isothermal amplification / Nucleic acid test

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）是一种常见的食源性病原体，主要存在于海产品和盐渍食品^［1］；该菌可引发食物中毒并导致急性肠胃炎，患者病情发展迅速，不及时诊断干预有致死风险^［2-3］。Vp基因包括不耐热溶血毒素（tlh）基因、耐热直接溶血素（tdh）基因和溶血相关溶血素（trh）基因，其中tlh基因为该菌特有基因，是被广泛用于检测Vp的靶基因^［4］。目前，用于检测Vp引起食物中毒的国家标准方法为平板培养法^［5］，然而该方法检测周期长、操作繁琐且对工作人员专业性要求较高。其他快速检测技术包括质谱法^［6］、分子生物学法^［7］和免疫学法^［8］，但均具有一定局限性。近年新兴的簇状规则间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR相关（CRISPR-associated，Cas）系统已成为病原微生物核酸检测技术的研发热点，相关诊断方法日渐普及，包括重组酶聚合酶扩增 （recombinase polymerase amplification，RPA）- CRISPR联用技术和环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）-CRISPR联用技术^［9］等。其中LAMP-CRISPR法因其较低的酶依赖性，具有更高效和灵敏的特点^［10］。本研究对传统LAMP-CRISPR方法进行改良，建立一种LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法，可快速精准检测Vp的tlh基因，为食品安全监控和公共卫生管理提供依据。

1 材料与方法

1.1　实验菌株、主要试剂和仪器

Vp菌株ATCC17802购自广东环凯微生物有限公司，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌均为北华大学医学技术学院病原微生物检验研究室保存菌种。2×Taq PCR Master Mix购自北京天根生化科技有限公司，10×LbCas12a裂解缓冲液、 1 μmol·L^-1 LbCas12a核酸酶、 500 nmol·L^-1 crRNA和1 μmol·L^-1 DNA报告分子均购自广州艾迪基因科技有限责任公司，通用型等温扩增PCR混合液购自生工生物工程（上海）股份有限公司。生物安全柜（浙江苏净净化设备有限公司），细菌培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），BSA124S电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司），ETC811 PCR扩增仪（苏州东胜兴业科学仪器有限公司），DS-11FX+微量核酸蛋白检测仪 （美国Denovix公司），UV752N紫外透射仪（上海佑科仪器仪表有限公司）。

1.2　煮沸法提取菌株DNA

复苏Vp、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌，取50 μL ddH₂O于EP管中，用接种环挑取标准菌株，紧贴管壁于液面处研磨，至液体浑浊，形成菌液。轻微振荡混匀后放置金属浴100 ℃加热10 min，于4 ℃静置10 min，12 000 g离心10 min，弃去沉淀，分离上清，即为目的DNA，依次分装，-20 ℃保存备用。煮沸法提取DNA，检测260和280 nm处吸光度（A）值，微量核酸蛋白检测仪测定提取DNA的浓度和纯度，以A（260）/A（280）的比值代表DNA纯度。

1.3　引物和探针设计

以Vp的tlh基因为靶基因设计LAMP特异性引物和CRISPR RNA（crRNA）及单链DNA（single-stranded DNA，ssDNA）探针，LAMP引物由生工生物工程技术服务（上海）股份有限公司合成，crRNA及ssDNA探针由广州艾迪基因科技有限责任公司合成。引物和探针序列见表1。

1.4　LAMP-CRISPR反应体系优化

LAMP 实 验 设 置 温 度 梯 度，分 别 为 56 ℃、58 ℃、60 ℃和62 ℃；设置内、外引物4种浓度，即1∶1、2∶1、4∶1和8∶1；设置反应体系中Bst DNA聚合酶的不同加入量依次为0.5、1.0和1.5 μL。对每个优化项目设置1个空白基因对照组，以确定最适宜的反应体系。

待LAMP扩增产物后，分别加入Cas12a蛋白、crRNA和ssDNA探针，37 ℃反应5 min。逐步调整crRNA和Cas12a蛋白的浓度，分别为20、30、40和50 nmol·L^-1，通过电泳条带和荧光信号强度优化反应体系。确定LAMP-CRISPR反应体系后，在LAMP扩增产物中加入10×裂解缓冲液、1 μmol·L^-1 Cas12a、 500 nmol·L^-1 crRNA、 2 μmol·L^-1 ssDNA 和 一 定 量 的 DEPC H₂O， 在 定 量 PCR（quantitative PCR， qPCR）仪37 ℃、 80个循环、反应40 min后，观察电泳条带和荧光信号强度来评价LAMP-CRISPR方法^［11］。

1.5　LAMP-CRISPR方法学评价

1.5.1　特异性评价

依次将提取的Vp、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和蜡样芽孢杆菌DNA原液稀释至10 mg·L^-1，按照“1.4”步骤中的最佳反应体系进行LAMP-CRISPR反应，采用琼脂糖凝胶电泳与紫外透视仪的实时荧光数据评价特异性。

1.5.2　灵敏度评价

将Vp的DNA模板分别稀释8个不同浓度梯度（10^-8 mg·L^-1~10² mg·L^-1），按照“1.4”步骤中的最佳反应体系进行LAMP-CRISPR反应，采用琼脂糖凝胶电泳与紫外透视仪的实时荧光数据评价灵敏度。

1.5.3　重复性评价

分别在3个不同实验室由3名不同检测人员操作的条件下，按照“1.4”步骤中的最佳反应体系进行LAMP-CRISPR反应，采用琼脂糖凝胶电泳与紫外透视仪的实时荧光数据评价重复性。

1.5.4　阳性符合率检验

按照“1.4”中的最佳反应体系进行LAMP-CRISPR反应检测模拟标本，并将检测结果与实时荧光qPCR（real-time fluorescence qPCR，RT-qPCR）检测结果进行对比，计算阳性符合率。阳性符合率=［真阳性数/（真阳性数+假阴性数）］×100%。

2 结 果

2.1　菌株DNA提取纯度和浓度

提取菌株基因组DNA的A（260）/A（280）比值均在1.8~2.0，且DNA浓度均超过150 mg·L^-1。见表2。满足PCR等扩增实验要求。

2.2　LAMP-CRISPR实验最佳条件和反应体系

LAMP实验结果显示：反应温度为60 ℃时条带最清晰（图1）；内、外引物比例为4∶1和8∶1时可见清晰条带（图2）；Bst DNA聚合酶加入量为0.5、1.0和1.5 μL时均可见清晰条带（图3）。因此最佳实验条件确定为反应温度60 ℃，内、外因引物比例为4∶1且Bst DNA聚合酶加入量为0.5 μL。后续LAMP实验总反应体系（25 μL）设定为：2×LAMP Mix 12.5 μL，外引物F3和B3各0.5 μL，内引物FIP和BIP各2 μL，DNA 2 μL，Bst DNA聚合酶0.5 μL，DEPC水5 μL。

LAMP-CRISPR反应体系优化结果显示：Cas12a蛋白和crRNA浓度设定为50 nmol·L^-1时，320 nm紫外光下肉眼荧光亮度和荧光仪检测相对荧光强度值均最高。见图4和5。基于优化结果，LAMP-CRISPR最佳反应体系设定见表3。

2.3　LAMP-CRISPR方法学评价

2.3.1　特异性评价

对不同菌株开展LAMP-CRISPR反应方法检测，仅Vp显示出清晰电泳条带和较强荧光信号，其他菌株和空白对照均无电泳条带及荧光信号，证明该方法对Vp检测具有良好特异性。见图6。

2.3.2　灵敏度评价

将Vp的基因组DNA进行倍比稀释，结果显示：DNA浓度稀释至10^-6 mg·L^-1时，琼脂糖凝胶电泳仍可观察到清晰目的条带，且紫外光下肉眼可见荧光。见图7。

2.3.3　重复性评价

由3名实验操作人员在不同实验室采用LAMP-CRISPR/Cas12a检测Vp阳性标本，检测结果一致，琼脂糖凝胶电泳均可观察到清晰目的条带，且紫外光下肉眼可见荧光，证明该方法重复性较好。见图8。

2.3.4　阳性符合率分析

分别使用建立的LAMP-CRISPR/Cas12a方法和RT-qPCR方法对临床疑似Vp病例进行检测，比较2种方法的检测结果并分别计算阳性符合率，结果显示：LAMP-CRISPR/Cas12a方法的阳性符合率和RT-qPCR法的阳性符合率结果一致，准确率一致，证明LAMP-CRISPR方法可行。见表4。

3 讨 论

食源性致病菌Vp引发的食物中毒事件呈现逐年增长趋势，严重威胁人类健康。目前，检测Vp的国家标准方法是平板培养法，该方法为Vp检测的金标准^［12］。传统检测时效性差，无法有效应对食源性疾病突发情况下快速鉴定的需求。因此，研发快速、精确的Vp定量检测技术迫在眉睫^［13］。分子学方法相对来说更适合食源性致病菌的检测，近年来国内外学者^［14］积极研发快速检测手段，如PCR-凝胶电泳技术、RT-qPCR、基因指纹图谱识别法以及ELISA法等，其各有独特的优点但同时有一定的局限性。PCR-凝胶电泳法快速且成本效益高，但仍因步骤繁琐以及易产生气溶胶并成为显著污染源而受到限制，且其灵敏度相对有限。RT-qPCR技术虽然具备高度特异性和灵敏度，但仍面临检测费用昂贵和荧光探针储存期短的问题。基因指纹图谱分析法因试剂盒成本高^［15］而受限。

LAMP是一种创新的分子生物学鉴定手段，具备显著的高效性、高灵敏度和高度特异性^［16］，是一种独特的核酸等温扩增技术。与传统核酸扩增手段相比，该技术特别设计了针对目标DNA序列的6个特定区域的4组独特引物。只需将样品DNA在60 ℃~65 ℃的环境下，配合引物、高效链置换DNA聚合酶以及dNTPs等试剂，单一步骤即可实现核酸的迅速扩增，无需依赖复杂的热循环设备，显著提升了操作的简易性。LAMP也有一定的缺点，容易污染，结果呈现假阳性，针对如何通过优化引物设计、改良实验流程及开发新型检测手段，以实现对扩增产物源头的特异性识别，仍需深入研究^［17］。CRISPR系统，特指细菌和古菌中的一种适应性免疫机制，基于该系统开发的CRISPR/Cas技术是近几年新兴的基因编辑技术。近年来Cas12、Cas13和Cas14蛋白不仅展现出针对特定靶序列的高效顺式核酸内切酶性能，而且还表现出对非特异性ssDNA和单链RNA的反向切割特性^［18］，研究者可使用高灵敏度的Cas变体（如Cas12a或Cas13a）改进引导RNA（guide RNA，gRNA）设计，增强靶标识别效率。其中Cas12a蛋白具有相对较小的尺寸，有利于其高效地进入细胞内部，且其对广泛的邻间隔基序（protospacer adjacent motif，PAM）具有高度识别能力。Vp的相关检测主要利用Cas12a或Cas13a蛋白的反式切割活性，crRNA与目标DNA（如tdh基因或trh基因）互补配对，结合Cas蛋白形成复合体。Cas12a在切割靶标双链DNA（顺式切割）后，激活ssDNA反式切割活性，切断荧光标记（如FAM-BHQ1）的探针，从而释放荧光信号达成可视化的效果。检测流程分为核酸提取、恒温扩增和CRISPR反应，将扩增产物与Cas12a-crRNA复合体及荧光探针混合，通过荧光强度判断结果。该技术的优势为具有高灵敏度与特异性，检测时间缩短至1 h内，远快于传统培养法。同时具有现场适用性，免疫层析试纸条或便携式荧光仪支持现场检测，适用于港口和养殖场等场景。但其也有一定的局限性，需精准设计靶向基因的crRNA。CRISPR基因编辑技术为Vp的检测与防控提供了高精度工具^［19］；其核心优势在于快速、灵敏的靶标识别能力，但需进一步解决活菌检测、设备成本及标准化问题。未来研究可聚焦于多技术联用（如CRISPR-LAMP-微流控）和跨学科整合（如One Health策略），推动从实验室到产业化的转化。

本研究建立一种新兴的LAMP-CRISPR/Cas12a方法检测Vp的tlh基因，检测体系在恒温37 ℃反应20~40 min即可完成检测，结果现场可视化，该方法具有简单、快速和可视化等优点。该系统还可与便携式恒温加热器一起使用，无需昂贵复杂的设备和技术成熟的专业人员。但Cas蛋白会切割反应体系中作为扩增模板的靶标基因，导致该方法无法实现精确有效检测。在核酸检测方面，未来可以选择次优的crRNA，利用耐热性更佳的Cas蛋白，优化扩增缓冲液和酶切缓冲液以实现两者兼容，令扩增反应和酶切反应同步进行，从而缩短反应时间，提高检测效率^［20］。

综上所述，本研究建立了LAMP-CRISPR/Cas12a方法用于检测Vp的tlh基因，为进出口食品中Vp的快速检测提供了简便高效的新方法，有助于行业工作者对产品的即时筛查，具有广阔的应用潜力。

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基金资助

吉林省科技厅科技发展计划项目(20230204085YY)

吉林省科技厅科技发展计划项目(20230202059NC)

北华大学研究生创新计划项目([2023]071)