表面表达PD-L1纳米抗体的细菌外膜囊泡的生物学特性及其对PD-1/PD-L1信号通路的阻断作用

Biological properties of bacterial outer membrane vesicles surface-displaying PD-L1 nanobodies and their disrupting effects on PD-1/PD-L1 signaling pathway

摘要

目的 制备表面表达程序性细胞死亡配体1（PD-L1）纳米抗体的细菌外膜囊泡（OMV），探讨其结构特性、细胞相容性、细胞内分布及其对程序性细胞死亡受体1（PD-1）/PD-L1信号轴的阻断效果。 方法 构建pET28a-ClyA-PD-L1nb原核表达载体，转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，通过超速离心法从转化PD-L1nb表达载体的BL21（DE3）单克隆菌落中分离OMV，利用组氨酸（His）标签进行蛋白纯化。采用透射电子显微镜和纳米粒径分析仪对OMV进行分析鉴定。将转化PD-L1nb表达载体的BL21（DE3）单克隆菌落所分离的OMV作为实验组，以未转化的BL21（DE3）单克隆菌落所分离的OMV作为对照组，采用Western blotting 法检测2组OMV中ClyA-PD-L1nb融合蛋白表达情况，采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测OMV处理后小鼠巨噬细胞RAW264.7、小鼠三阴性乳腺癌细胞4T1和人胚胎肾细胞HEK293T活性，应用荧光成像技术观察OMV的肿瘤细胞内吞情况，采用流式细胞术检测PBS组、OMV-PD-L1nb组和aPD-L1＋OMV-PD-L1nb组OMV与肿瘤细胞表面PD-L1的结合效果。 结果 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），大肠杆菌诱导后在预计相对分子质量（约49 000）附近出现明显加粗的蛋白条带，ClyA-PD-L1nb蛋白成功表达，纯化后泳道中无明显杂蛋白存在。利用超速离心法分离得到尺寸约120 nm的OMV-PD-L1nb，透射电子显微镜下呈现为尺寸均一的圆球形结构。Western blotting法，实验组OMV中检测到ClyA-PD-L1nb特异性条带。CCK-8法，经不同浓度OMV处理后，RAW 264.7细胞、4T1细胞和HEK293T细胞活性均接近100%。荧光成像，OMV-PD-L1nb被4T1细胞内吞后分散在细胞质中。与OMV-PD-L1nb组比较，aPD-L1＋OMV-PD-L1nb组细胞中平均荧光强度明显降低（P<0.001）。 结论 成功制备并分离了表面表达PD-L1nb的OMV即OMV-PD-L1nb，其在小鼠巨噬细胞、肿瘤细胞和人胚胎肾细胞上显示出良好的相容性，可被肿瘤细胞内吞并成功阻断PD-1/PD-L1信号通路。

Abstract

Objective To prepare the bacterial outer membrane vesicles （OMV） that can express programmed death ligand 1（PD-L1） nanobody on surface， and to discuss its structural characteristics， cell compatibility， intracellular distribution， and its blocking effect on the programmed cell death protein-1（PD-1）/PD-L1 signaling axis. Methods The pET28a-ClyA-PD-L1nb prokaryotic expression vector was constructed and transformed into Escherichia coli BL21 （DE3） competent cells； the OMV was isolated from the BL21 （DE3） monoclonal colonies transformed with the PD-L1nb expression vector by ultracentrifugation； the protein purification was performed using the histidine （His） tag； transmission electron microscope and nanoparticle size analyzer were used to analyze and identify the OMV； the OMV isolated from the BL21 （DE3） monoclonal colonies transformed with the PD-L1nb expression vector was used as experimental group； the OMV isolated from the untransformed BL21 （DE3） monoclonal colonies was used as control group； Western blotting method was used to detect the expression levels of ClyA-PD-L1nb fusion protein in the OMV in two groups； cell counting kit-8 （CCK-8） assay was used to detect the activities of mouse macrophage RAW 264.7 cells， mouse triple-negative breast cancer 4T1 cells， and human embryonic kidney HEK293T cells after treated with OMV； fluorescence imaging technology was used to observe the tumor cell endocytosis of OMV； flow cytometry was used to detect the binding effect of OMV to the PD-L1 on surface of the tumor cells in PBS group， OMV-PD-L1nb group， and aPD-L1+OMV-PD-L1nb group. Results The sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） results showed that after induction of Escherichia coli， significantly thickened protein bands appeared near the predicted relative molecular mass （about 49 000）， and after purification， no obvious impurity proteins existed in the lanes； the OMV-PD-L1nb with a size of about 120 nm was isolated by ultracentrifugation， and it presented a uniform spherical structure under transmission electron microscope； the Western blotting results showed that the specific band of ClyA-PD-L1nb was detected in the OMV in experimental group； the CCK-8 assay results showed that after treated with different concentrations of OMV， the viabilities of the RAW 264.7 cells， 4T1 cells， and HEK293T cells were all close to 100%； the fluorescence imaging results showed that OMV-PD-L1nb was endocytosed by 4T1 cells and dispersed in the cytoplasm； compared with OMV-PD-L1nb group， the average fluorescence intensity in the cells in aPD-L1+OMV-PD-L1nb group was significantly decreased （P<0.001）. Conclusion The OMV surface-displaying PD-L1nb， OMV-PD-L1nb， is successfully prepared and isolated； OMV-PD-L1nb shows good compatibility on mouse macrophage cells， tumor cells， and human embryonic kidney cells， can be endocytosed by tumor cells， and successfully blocks the PD-1/PD-L1 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

细菌外膜囊泡 / 程序性细胞死亡受体1 / 程序性细胞死亡配体1 / 纳米抗体 / 免疫检查点阻断

Key words

Bacterial outer membrane vesicles / Programmed cell death protein-1 / Programmed cell death ligand 1 / Nanobody / Immune checkpoint blockade

免疫检查点是一类表达于免疫细胞表面的受体分子，具有负性免疫调控功能^［1-2］，其在生理状态下起到防止免疫反应过度以避免自身组织受损的作用。然而，在肿瘤发生发展过程中，肿瘤细胞通过高表达免疫检查点的配体分子，逃避免疫系统的识别与攻击^［3-6］。

程序性细胞死亡受体1（programmed cell death protein-1，PD-1）主要表达于活化的T细胞、B细胞、NK细胞、活化的单核细胞和树突状细胞等免疫细胞表面^［7-8］。程序性细胞死亡配体1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）是PD-1的配体。PD-L1与T细胞表面PD-1受体结合后，可诱导T细胞衰竭，防止免疫系统过度激活^［9］。研究^［10-11］显示：PD-L1分子在多种恶性肿瘤细胞表面呈高水平表达，肿瘤细胞表达的PD-L1与PD-1结合后，可抑制T细胞增殖和细胞因子分泌，削弱靶向肿瘤的免疫应答。因此，靶向干扰PD-1/PD-L1信号通路已成为恶性肿瘤免疫治疗的重要策略之一^［12-14］。目前国内外已开发出多种靶向PD-1或PD-L1的单克隆抗体，通过阻断PD-1/PD-L1信号通路激活抗肿瘤免疫应答，发挥免疫治疗作用^［15-16］。

细胞膜囊泡是一类由细胞分泌或人工合成的新型药物递送载体，近年来在肿瘤、炎症和自身免疫性疾病等多种疾病治疗领域取得重要进展。细菌外膜囊泡（outer membrane vesicle，OMV）是由革兰阴性菌外膜起泡或爆炸裂解而生成的一类球状结构，其直径为10~250 nm。因其来源于天然生物膜材料，所以OMV具有良好的生物相容性，利用减毒菌株或益生菌制备的OMV免疫原性较低，近年来已成为肿瘤治疗中常用的药物递送载体^［17-19］。此外，通过基因工程技术对细菌外膜蛋白基因进行改造，可制备表面表达功能性蛋白的OMV，从而拓展其靶向递送、免疫调控和肿瘤杀伤等功能。

本研究利用基因工程制备了表面表达PD-L1纳米抗体的OMV，即OMV-PD-L1nb，探讨OMV-PD-L1nb的结构特性、细胞相容性、细胞内分布及其对PD-1/PD-L1信号通路的阻断效果，为制备和开发新型免疫检查点抑制剂提供参考。

1 材料与方法

1.1　质粒、细胞、主要试剂和仪器

pET28a-ClyA-PD-L1nb质粒由苏州金唯智生物科技有限公司合成。BL21（DE3）感受态细胞购自北京博迈德基因技术有限公司，小鼠三阴性乳腺癌4T1细胞由北华大学医学技术学院临床检验系实验室细胞库提供。1%青-链霉素溶液、蛋白质相对分子质量标准品、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）抗体、组氨酸（histidine，His）标签蛋白纯化试剂 盒、极 超 敏 增 强 化 学 发 光 法 （enhanced chemiluminescence， ECL） 试剂盒、二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒和细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8，CCK-8）检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术公司，酵母提取物、胰蛋白胨、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、苯甲 基 磺 酰 氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、硫 酸 卡 那 霉 素、改 良 Eagle 培 养 基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）和 胎 牛 血 清（fetal bovine serum，FBS）均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。超声波粉碎机购自上海净信实业发展有限公司，POWERPAC型电泳仪购自美国Bio-Rad公司，JEM1200EX透射电子显微镜购自日本JEOL公司，酶标仪购自瑞士TECAN公司，FV3000激光扫描共聚焦显微镜购自日本Olympus公司，Delsa^TM NanoC纳米粒径分析仪和CytoFLEX LX流式细胞仪均购自美国Beckman Coulter公司。

1.2　十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法检测ClyA-PD-L1nb蛋白原核表达

将pET28a-ClyA-PD-L1nb质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，菌液均匀涂布于含卡那霉素LB固体培养基上，37 ℃过夜培养。挑取单个菌落于LB液体培养基中，37 ℃振荡过夜。扩大培养至波长600 nm处吸光度A（600）达到0.6~0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol·L^-1，16 ℃继续培养16 h。离心收集菌体沉淀，用TEN缓冲液溶解沉淀后加入蛋白酶抑制剂PMSF（终浓度1 mmol·L^-1），超声破碎菌体。离心后取上清液进行SDS-PAGE分析。若在预计相对分子质量附近出现明显加粗蛋白条带，提示ClyA-PD-L1nb蛋白表达成功。

1.3　SDS-PAGE法检测ClyA-PD-L1nb蛋白纯化

利用ClyA-PD-L1nb蛋白中的His标签进行亲和层析以纯化目的蛋白。将混合均匀的50%His标签树脂装入亲和层析柱空柱管中，洗涤3次后加入细菌裂解液上清，收集流出液。用洗涤液洗柱5次，洗脱液洗脱目的蛋白6~10次。收集洗脱组分，采用SDS-PAGE电泳分析目的蛋白纯度。

1.4　OMV-PD-L1nb制备

将表达ClyA-PD-L1nb融合蛋白的工程菌置于LB培养基中过夜培养。次日扩大培养至菌液A（600）达到0.6~0.8时，加入IPTG诱导蛋白表达，16 ℃培养16 h，4 ℃、5 000 g条件下离心10 min，收集上清。依次使用0.45 µm过滤器过滤，截留相对分子质量为100 000的超滤管浓缩，再经0.22 µm过滤器过滤浓缩液。于4 ℃、52 000 r·min^-1超速离心180 min。弃上清，吸取适量磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）重悬沉淀，获得含有OMV-PD-L1nb悬液，分装后于-80 ℃保存。

1.5　OMV-PD-L1nb表征与鉴定

使用纳米粒径分析仪检测OMV粒径分布，使用透射电子显微镜观察其显微结构。采用BCA法测定分离OMV蛋白质浓度。采用Western blotting法鉴定OMV-PD-L1nb。以His抗体（1∶4 000）作为一抗，4 ℃孵育过夜；次日TBST洗涤3次后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1 000），洗涤后加入ECL底物显影并拍照。在相对分子质量约49 000处出现特异性清晰条带视为阳性，提示ClyA-PD-L1nb融合蛋白在OMV上成功表达。

1.6　CCK-8法检测不同浓度OMV-PD-L1nb作用后各组细胞活性

将RAW 264.7细胞、4T1细胞和HEK293T细胞分别以每孔5 000个细胞的密度接种于96孔细胞培养板，培养24 h后弃去旧培养基，更换终浓度分别为10、20、40、80和100 mg·L^-1的100 µL OMV-PD-L1nb完全培养基，每个浓度设置5个复孔。孵育48 h后，每孔加入10 µL CCK-8溶液，孵育3 h。使用酶标仪测定3种细胞在450 nm处A值，计算细胞活性。细胞活性=（实验孔A值-空白孔A值）/（阴性对照孔A值-空白孔A值）×100%。

1.7　荧光成像技术观察OMV-PD-L1nb肿瘤细胞摄取情况

将无菌细胞爬片置于24孔细胞培养板底部，以每孔6×10⁴个细胞的密度接种4T1细胞，置于37 ℃、5%CO₂培养24 h。弃去培养基，每孔加入100 mg·L^-1 DiI荧光染料标记OMV-PD-L1nb，孵育4 h。弃去培养基，PBS缓冲液洗涤3次。加入4%多聚甲醛，37 ℃条件下固定细胞30 min。弃去多聚甲醛，PBS缓冲液洗涤3次。加入DAPI染色液（10 mg·L^-1），37 ℃避光染核10 min。弃去DAPI染色液，PBS缓冲液清洗3次，抗荧光淬灭封片液封片后，使用激光扫描共聚焦显微镜观察各组细胞摄取情况。

1.8　流式细胞术检测OMV-PD-L1nb与肿瘤细胞表面PD-L1结合情况

将4T1细胞以每孔2×10⁵个细胞的密度接种于12孔细胞培养板中，每组设5复孔，随机分为PBS组、OMV-PD-L1nb组和aPD-L1+OMV-PD-L1nb组，过夜培养。次日，弃去aPD-L1+OMV-PD-L1nb组培养基，加入终浓度为20 mg·L^-1 PD-L1抗体aPD-L1，孵育4 h。随后将3组培养基全部弃去，PBS组加入新鲜完全培养基，OMV-PD-L1nb组和aPD-L1+OMV-PD-L1nb组均加入终浓度为100 mg·L^-1 DiI荧光染料标记OMV-PD-L1nb，孵育4 h。消化各组细胞并收集细胞悬液，PBS缓冲液洗涤2次。使用流式细胞仪检测3组细胞中DiI荧光强度，以荧光强度评估OMV-PD-L1nb与4T1细胞表面PD-L1的结合情况。

1.9　统计学分析

采用GraphPad Prism 9.4.1统计软件进行统计学分析。各组细胞活性和细胞中DiI荧光强度均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　ClyA-PD-L1nb蛋白的原核表达和纯化

将转化pET28a-ClyA-PD-L1nb质粒的大肠杆菌裂解后取上清，SDS-PAGE分析结果显示：上清中在相对分子质量49 000附近出现明显增粗蛋白条带，提示ClyA-PD-L1nb在大肠杆菌中成功表达。使用His标签蛋白纯化试剂盒进行了蛋白纯化，结果显示：纯化后蛋白泳道中杂蛋白极少，提示获得较高纯度ClyA-PD-L1nb蛋白。见图1。

2.2　细菌OMV-PD-L1nb制备和表征

基于大肠杆菌BL21（DE3）成功表达ClyA-PD-L1nb，检测OMV分泌情况。采用超速离心法从表达ClyA-PD-L1nb融合蛋白的大肠杆菌分泌液中制备工程化囊泡。动态光散射结果显示：OMV-PD-L1nb平均粒径为120 nm。透射电子显微镜图像显示：所制备OMV-PD-L1nb呈现近似圆球形囊泡结构。见图2。

采用Western blotting法检测融合蛋白ClyA-PD-L1nb在OMV表面的表达情况，结果显示：OMV-PD-L1nb泳道在预期相对分子质量位置检测到单一清晰条带，空白OMV泳道未检测到对应蛋白条带，提示成功制备了表达ClyA-PD-L1nb蛋白的OMV。见图3。

2.3　OMV-PD-L1nb的细胞相容性分析

采用CCK-8法检测不同浓度OMV-PD-L1nb作用后3种细胞活性，结果显示：在不同浓度作用下，各组OMV-PD-L1nb细胞活性比较差异均无统计学意义（P>0.05），表明OMV-PD-L1nb具有良好的细胞相容性。见图4。

2.4　OMV-PD-L1nb在4T1细胞中摄取情况

激光扫描共聚焦显微镜检测结果显示：OMV-PD-L1nb与4T1细胞共孵育4 h后，细胞核周围胞浆区域内出现集中分布的点状红色荧光，证明OMV-PD-L1nb可被4T1细胞高效摄取并内吞。见图5。

2.5　OMV-PD-L1nb与4T1细胞表面PD-L1结合情况

流式细胞术结果显示：与OMV-PD-L1nb组比较，aPD-L1+OMV-PD-L1nb组细胞中DiI平均荧光强度明显降低（P<0.001），提示OMV-PD-L1nb通过PD-1/PD-L1信号通路与4T1细胞结合。见图6。

3 讨 论

免疫检查点抑制剂阻断疗法在治疗癌症领域取得重要进展。该疗法通过将免疫检查点抑制剂与细胞外免疫检查点结合，阻断抑制性信号通路同时刺激免疫细胞，继而杀灭肿瘤细胞。免疫检查点抑制剂为晚期肿瘤患者提供了新的治疗选择，展示出良好的临床效果。然而在实际应用中，传统递送平台无法有效将免疫检查点抑制剂递送到肿瘤微环境，因此迫切需要开发新型靶向递送载体。

OMV作为药物递送载体，在靶向阻断PD-1/PD-L1信号通路的研究中展现出独特优势。JIN等^［20］利用OMV共同递送胚胎干细胞衍生的肿瘤相关抗原和免疫检查点抑制剂PD-L1抗体，取得了良好的肿瘤治疗效果。CUI等^［21］研究显示：使用涂有OMV-PD1的分子筛咪唑骨架8 （zeolitic imidazolate framework-8，ZIF-8）制备高效miRNA纳米递送系统并担载miR-34a，可协同OMV-PD1进一步触发免疫激活和检查点抑制，从而增强肿瘤治疗效果。SU等^［22］设计了一种基因工程转铁蛋白受体介导的溶酶体靶向嵌合体，并将其融合至OMV表面靶向PD-L1，通过阻断PD-1/PD-L1通路抑制肿瘤生长。

OMV是革兰阴性细菌分泌的天然纳米颗粒，含有大量来自亲本细菌外膜和周质成分，因此具有强免疫原性，是一种理想的先天免疫刺激剂和疫苗载体^［23］。本研究成功制备并分离了表达ClyA-PD-L1nb的OMV，其通过阻断PD-1/PD-L1信号通路来刺激免疫细胞肿瘤浸润，激发全身抗肿瘤免疫应答。OMV-PD-L1nb不仅可以结合肿瘤细胞上PD-L1，还可与肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophage，TAM）上的Toll样受体结合，从而通过经典激活途径使TAM敏感，同时阻断PD-1/PD-L1免疫检查点，增强免疫细胞介导的抗肿瘤免疫效应^［24］。

综上所述，本研究成功制备并分离了表面表达PD-L1nb的OMV，即OMV-PD-L1nb，其具有良好的生物相容性，可被4T1细胞高效内吞并分散于细胞质中。OMV-PD-L1nb可有效阻断PD-1/PD-L1信号通路，破坏PD-L1介导的免疫抑制肿瘤微环境。应用OMV-PD-L1nb介导的免疫联合治疗具有广阔的临床转化前景。

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基金资助

吉林省教育厅科研项目(JJKH20180370KJ)

浙江省科技厅自然科学基金探索一般项目(LY23C100001)

浙江省台州市科技局科技发展计划项目(22gya03)