敲低KIF3B基因通过抑制Shh信号通路对小鼠胚胎腭突间充质细胞自噬的促进作用

Prometive effect of knockdown of KIF3B gene on autophagy in mouse embryonic palatal mesenchymal cells by inhibiting Shh signaling pathway

摘要

目的 探讨敲低小鼠胚胎腭突间充质细胞（mEPMCs）初级纤毛（PC）重要组件驱动蛋白家族成员3B（KIF3B）基因对细胞自噬水平的作用，并阐明其作用机制。 方法 收集体外培养孕龄14.5 d C57BL/6J小鼠的mEPMCs，根据是否敲低KIF3B基因和使用平滑因子受体激动剂（SAG）激活音猬因子（Shh）信号通路及其下游共受体Smo，分为对照组（给予生理盐水）、空载病毒转染细胞组（sh-NC组）（给予慢病毒转染）、敲低KIF3B组（sh-KIF3B组）（给予KIF3B基因敲低）、敲低KIF3B加入SAG组（sh-KIF3B+SAG组）（给予KIF3B基因敲低后加入SAG），每组5只大鼠。透射电镜观察各组mEPMCs中自噬小体/自噬溶酶体形态表现及数量，Western blotting法检测各组mEPMCs中自噬相关蛋白苄氯素1（Beclin-1）和p62及Shh信号通路中Shh和Smo蛋白表达水平。 结果 透射电镜观察，与对照组比较，sh-KIF3B组mEPMCs中自噬小体/自噬溶酶体数量明显增加（P<0.05）；与sh-KIF3B组比较，sh-KIF3B+SAG组mEPMCs中自噬小体/自噬溶酶体数量明显减少（P<0.05）。Western blotting法检测，与对照组比较，sh-KIF3B组mEPMCs中Beclin-1蛋白表达水平明显升高 （P<0.05），KIF3B、p62、Shh和Smo蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）；与sh-KIF3B组比较，sh-KIF3B+SAG组mEPMCs中Shh、Smo和p62蛋白表达水平明显升高（P<0.01），Beclin-1蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。 结论 敲低KIF3B基因可促进mEPMCs自噬，其机制可能与其抑制Shh信号通路有关。

Abstract

Objective To discuss the effect of knock down of gene of kinesin family member 3B （KIF3B）， an important component of primary cilia （PC） of in mouse embryonic palatal mesenchymal on the autophagy level of cells （mEPMCs） cells， and to clarify its mechanism. Methods The mEPMCs from gestational day 14.5 C57BL/6J mice cultured in vitro were collected and divided into control group （administered normal saline）， empty lentivirus transfected cell group （sh-NC group） （administered lentivirus transfection）， KIF3B knockdown group （sh-KIF3B group） （administered KIF3B gene knockdown）， and KIF3B knockdown plus Smoothened receptor agonist （SAG） group （sh-KIF3B+SAG group） （administered KIF3B gene knockdown followed by SAG addition）， based on whether the KIF3B gene was knocked down and whether the SAG was used to activate the sonic hedgehog （Shh） signaling pathway and its downstream coreceptor Smo， with 5 rats in each group. Transmission electron microscope was used to observe the morphology and the number of autophagosomes/autolysosomes in the mEPMCs in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of autophagy-related proteins Beclin-1 and p62， and the Shh signaling pathway proteins Shh and Smo in the mEPMCs in various groups. Results The transmission electron microscope observation results showed that compared with control group， the number of autophagosomes/autolysosomes in sh-KIF3B group was significantly increased （P<0.05）； compared with sh-KIF3B group， the number of autophagosomes/autolysosomes in the mEPMCs in sh-KIF3B+SAG group was significantly decreased （P<0.05）. The Western blotting results showed that compared with control group， the Beclin-1 protein expression level in the mEPMCs in sh-KIF3B group was significantly increased （P<0.05）， and the KIF3B， p62， Shh， and Smo protein expression levels were significantly decreased （P<0.01）； compared with sh-KIF3B group， the Shh， Smo， and p62 protein expression levels in the mEPMCs in sh-KIF3B+SAG group were significantly increased （P<0.01）， and the Beclin-1 protein expression level was significantly decreased （P<0.01）. Conclusion Knockdown of KIF3B gene can promote autophagy of the mEPMCs， and the mechanism may be related to its inhibition of the Shh signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

唇腭裂 / 驱幼蛋白家族成员3B / 初级纤毛 / 音猬因子信号通路 / 细胞自噬

Key words

Cleft lip and palate / Kinesin family member 3B / Primary cilia / Sonic hedgehog signaling pathway / Autophagy

唇腭裂（cleft lip and palate，CL/P）是最常见的颌面部畸形之一，CL/P在全世界的发病率约为1/700，而在中国的发病率可达1.82/1 000^［1-2］。CL/P病因极其复杂，目前研究^［3］认为其致病原因为遗传及环境因素单独或联合共同作用，但确切的病因尚未完全阐明。由于CL/P对患者身心、家庭乃至整个社会都会造成不良影响，故探讨其发病机制和预防该疾病发生仍然十分重要。

音猬因子（sonic hedgehog，Shh）信号通路参与了许多组织和器官的发生，包括四肢、神经系统和牙齿等^［4］。Shh信号通路的异常调节可能导致多种神经系统疾病和畸形，如无前脑畸形（holoprosencephaly， HPE）和面中部发育不良，包括CL/P、扁平鼻并发鼻中隔发育不良，以及眼眶变形、颌面不对称及基底细胞癌综合征（nevoidbasal cell carcinoma syndrome，NBCCS）等疾病^［4-7］。已有研究^［8-11］证实：Shh信号通路不但可以影响小鼠胚胎腭突间充质细胞（mouse embryo palatal mesenchymal cells，mEPMCs）增殖和凋亡，而且还能够调控细胞自噬，同时经典的Shh信号通过细胞上的初级纤毛（primary cilia，PC）传递，而PC也会影响细胞自噬发生。研究^［13］证实刺猬因子（hedgehog，Hh）信号通路可以抑制实验用HeLa细胞和肝癌细胞中自噬小体形成，而在小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）及肾上皮细胞（renal epithelial cell，REC）中的Hh信号通路可以诱导自噬小体形成，以上相互矛盾的结果或许可以说明在不同类型的细胞中，Hh信号通路与自噬之间的关系不尽相同。因此，mEPMCs自噬水平的改变，可能会依赖于PC的Shh途径。本研究敲减PC重要组件驱动蛋白家族成员3B（kinesin family member 3B，KIF3B）基因后，检测mEPMCs自噬水平和Shh信号因子表达水平及激活Shh信号后mEPMCs自噬水平的变化，明确Shh信号对mEPMCs自噬的影响及PC重要组件KIF3B的作用，为小鼠腭部发育机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1　实验动物、病毒、主要试剂和仪器

40只SPF级C57BL/6J小鼠（其中30只雌鼠，10只雄鼠），购于遵义医科大学实验动物中心［动物使用合格证号：SYXK（黔）2021-0004］。本实验实施过程符合遵义医科大学伦理委员会要求（伦审〔2021〕2-504号）。慢病毒构建由上海（江西）中洪博元生物技术有限公司负责。平滑因子受体激动剂（smoothened agonist，SAG）购自美国MCE公司，p62、波形蛋白（Vimentin）和细胞角蛋白（pan-cytokeratin，P-CK）抗体均购自英国Abcam公司，苄氯素1（Beclin-1）和GAPDH抗体购自美国Proteintech公司，KIF3B基因购自美国Santa公司，Shh信号通路下游共受体Smo购自中国ABclona公司，Shh抗体购自美国Affinity公司，胎牛血清和1%青-链霉素双抗购自美国BI公司，DMEM/F12培养基购自美国Gibco公司。超净工作台购自浙江金净环境技术有限公司，体式显微镜购自德国Leica公司，透射电镜JEM-F200购自德国SIMENS公司，精密电子秤购自日本Tokyo公司，垂直电泳槽、电泳仪和凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad公司。

1.2　mEPMCs的获取和培养

按照文献［14］的方法，给予吸入麻醉后处死全部孕龄14.5 d的孕鼠，取出胚胎后置于体视显微镜下，获取胎鼠双侧腭突组织，用中性蛋白酶处理后4 ℃的冰箱里过夜消化。次日终止中性蛋白酶消化后低速离心5 min，弃上清液后加入2 mL含有EDTA的胰蛋白酶（0.25%胰酶）孵育至管内呈浑浊液体，然后再次离心5 min后弃上清，加入1 mL培养基后吹打，计数后转移至T25培养瓶中，于5% CO₂、37 ℃培养箱常规培养。利用P-CK和Vimentin单克隆抗体对同一批次培养的细胞进行鉴定，显微镜下显示P-CK阴性（细胞无荧光表达），Vimentin阳性（细胞呈绿色荧光），提示培养的细胞为mEPMCs，继续培养用于后续实验研究。

1.3　慢病毒载体的构建、细胞转染和分组

将KIF3B目标序列和空载序列分别整合于质粒载体中，扩增纯化后进行慢病毒包装，慢病毒浓缩纯化后分装后-80℃保存备用。KIF3B目标序列CCTGTCTCTGCTGTGG GATACAAGA，空载序列TTCTCCGAACGTGTCACG TAA；KIF3B沉默序列：R 5'-GATCCGCCTGTCTCTGCTG-TGGGATACAAGACTCGAGTCTTGTATCCCA-CAGCAGAGACAGGTTTTTT-3'，F 5'-AATT-CAAAAAACCTGTCTCTGCTGTGGGATACA-AGACTCGAGTCTTGTATCCCACAGCAGAG-ACAGGCG-3'；空载序列：R 5'-GATCCGTTCT-CCGAACGIGTCACGTAATTCAAGAGATTAC-GIGACACGTTCGGAGAATTTTTTC-3'，F 5'-AA-TTGAAAAAATTCTCCGAACGIGICACGTAA-TCTCTTGAATTACGIGACACGTTCGGAGAA-CG-3'。采用相应序列慢病毒进行细胞转染，筛选出聚凝胺最佳浓度=5 mg·L^-1，感染复数（multiplicity of infection，MOI）=50。选取状态最佳的细胞，以5×10⁵个的密度接种至T25细胞培养瓶内，加入所需体积的病毒液及助转剂，于细胞孵箱内继续培养转染细胞，48~72 h后细胞呈现明亮绿色荧光且荧光强度约占视野下80%时，视为转染成功，继续扩大培养以用于后续实验。

为验证mEPMCs自噬水平提高是否发生在沉默KIF3B基因后，将小鼠的mEPMCs按照不加入药物给予生理盐水、给予慢病毒转染、敲低KIF3B和敲低KIF3B后加入SAG，分为对照组、空载病毒转染细胞组（sh-NC组）、敲低KIF3B组（sh-KIF3B组）、敲低KIF3B加入SAG组（sh-KIF3B+SAG组），每组5只大鼠。

1.4　透射电镜观察各组mEPMCs中自噬小体/自噬溶酶体形态表现和数量

慢病毒转染后的各组细胞根据分组给予不同干预后再培养24 h，然后将细胞置于2%戊二醛中，在4 ℃条件下固定约3 h，然后磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗后用1%锇酸固定，随后梯度乙醇脱水、包埋、切片，铀铅双染色透射电镜观察摄片。透射电镜下可见自噬小体/自噬溶酶体，内含线粒体及内质网碎片，且包浆成分尚在的双层或多层膜结构为自噬小体；内源性物质的囊泡融合或细胞质已遭到吞噬，包浆成分已降解的单层膜结构为自噬溶酶体^［15］。自噬小体/自噬溶酶体出现在自噬发生的中到晚期，二者均可代表自噬发生。采用高分辨率透射电镜进行拍摄，5 000~20 000倍镜下选择清晰可见为多层或单层膜样的自噬结构进行细胞计数。

1.5　Western blotting法检测各组mEPMCs中Shh信号通路及自噬蛋白表达水平

将慢病毒转染后的各组细胞根据分组给予不同干预措施后再培养24 h，然后提取各组细胞总蛋白，BCA法检测各组蛋白浓度，并调整各组蛋白浓度为1 g·L^-1，加入适量5×SDS上样缓冲液后，100 ℃水浴10 min变性蛋白，将各组蛋白样品上样到配置好的电泳凝胶后进行电泳、转膜、各目的蛋白一抗4 ℃孵育过夜，KIF3B（1∶1 000）、Beclin-1（1∶5 000）、p62（1∶5 000）、GADPH（1∶5 000）、Shh（1∶1 000）和Smo（1∶1 000），二抗室温孵育1 h，TBST溶液洗涤后用ECL显色。采用Image J软件检测蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.6　统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。各组小鼠mEPMCs中自噬小体/自噬溶酶体数量及KIF3B、Shh、Smo、Beclin-1和p62蛋白表达水平符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　各组mEPMCs中自噬小体/自噬溶酶体形态表现和数量

各组细胞在电镜下均可见双层或单层膜样结构的自噬小体及自噬溶酶体。与对照组比较，sh-NC组mEPMCs中自噬小体/自噬溶酶数量差异无统计学意义（P>0.05），sh-KIF3B组mEPMCs中自噬小体/自噬溶酶体数量明显增加 （P<0.05）。与sh-KIF3B组比较，sh-KIF3B+SAG组mEPMCs中自噬小体/自噬溶酶体数量明显减少（P<0.05）。见图1和表1。

2.2　各组mEPMCs中KIF3B、 Beclin-1、 p62、 Shh和Smo蛋白表达水平

与 对 照 组 比 较， sh-NC 组 mEPMCs中KIF3B、Beclin-1、p62、Shh和Smo蛋白表达水平差异无统计学意义（P<0.05），sh-KIF3B组mEPMCs中Beclin-1蛋白表达水平明显升高（P<0.05），KIF3B、p62、Shh和Smo蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）。见图2和3。与sh-KIF3B组比较，sh-KIF3B+SAG组mEPMCs中Shh、Smo和p62蛋白表达水平明显升高（P<0.01），Beclin-1蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。见图4。

3 讨 论

本课题组在前期研究^［16］发现：PC存在mEPMCs中。通过干扰PC中转运系统内关键蛋白纤毛内的转运系统122（intraflagella transport，IFT122）后，可以导致PC的生长缺陷与功能受损，影响细胞增殖，最终导致口面部出现裂隙^［17］。KIF3B在PC转运系统中承担着协助细胞内转运蛋白复合体顺向转运蛋白的重要工作，对PC形成、发生及定位于PC的信号通路传递至关重要^［17-18］。本研究结果显示：与对照组比较，sh-KIF3B组mEPMCs中自噬小体/自噬溶酶体数量明显增加，Beclin-1蛋白表达水平明显升高和p62等自噬相关蛋白表达水平明显降低，证实敲低KIF3B基因后mEPMCs将出现自噬水平升高的情况。

Shh信号通路的传递受到干扰后，mEPMCs增殖水平产生一定变化^{［13，19］}，这是因为对细胞生长发育中起到重要作用的Shh信号通路中的大部分组件都定位在PC上。Shh信号通路主要是由其相应配体Shh、跨膜受体（Patched，Ptch）、共受体Smo和转录因子（Gli）家族组成^［21］。Shh信号通路正常情况下，即无细胞外配体Shh存在时，细胞膜上的Ptch1受体与Smo结合，以抑制Smo向下游传递信号。当Shh出现时，Ptch1与Shh结合，使Smo得以释放至PC上，激活下游细胞转录因子Gli家族进入细胞核中，调控细胞周期蛋白Cyclin家族，促进细胞进入细胞周期、促进增殖^［22］。本研究 结 果 显 示： 与 对 照 组 比 较， sh-KIF3B 组mEPMCs中Shh和Smo蛋白表达水平明显降低，进一步说明敲低KIF3B基因后，PC功能受损对Shh信号通路产生了抑制作用。

目前已有文献^［23］报道：Shh信号通路在哺乳动物腭部发育中，在调节胚胎腭突上皮-间质转化和细胞凋亡的活动中起直接或间接作用，但mEPMCs的PC因KIF3B受损是否会阻碍Shh信号通路传导，进而影响细胞自噬尚不清楚。本研究结果显示：sh-KIF3B组mEPMCs在敲低KIF3B基因后出现大量的自噬小体/自噬溶酶体，表明纤毛功能受损促进了mEPMCs自噬；Shh信号通路中关键蛋白Smo的激动剂SAG干预后，sh-KIF3B+SAG组mEPMCs的自噬小体/自噬溶酶体数量明显减少，表明在激活Shh下游信号因子后，mEPMCs的自噬水平得到了一定程度恢复，但未能完全恢复，提示敲低KIF3B基因促进mEPMCs自噬是通过抑制Shh信号通路得以实现。

除Shh的经典通路外，Shh信号通路的非典型传导的3种不同的亚型：①单独激活Hh，不依赖Gli行使功能，其也可细分为Smo依赖型和Smo非依赖型；②诱导Gli活性的替代机制；③绕过Shh-Ptch-Smo途径，对Gli进行异常活化，例如丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase，AKT）-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamicin，mTOR）、转 化 生 长 因 子β（transforming growth factor-β，TGF-β）等信号通路，能够让Gli被直接转录活化^［24-25］，也表明Shh的传导与其他信号通路联系紧密。YAO等^［13］研究发现：在小鼠肝脏细胞中，Hh通路经Smo活化-磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）依赖的AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK），促进AML12细胞自噬。研究^［26］表明：Shh可不依赖于mTOR信号途径，直接活化AKT调控人和动物的血管生成。由于自噬在多种细胞中的不同表现，且存在着多种可以与Shh信号通路相互作用的其他通路，因此在mEPMCs中，细胞自噬-Shh信号通路-PC之间的关系仍有待深入研究。

综上所述，mEPMCs中KIF3B基因缺失会抑制Shh信号通路，激活mEPMCs自噬，通过SAG对Shh下游信号的激活，可以部分恢复被抑制的Shh信号通路，并且同时也降低mEPMCs的自噬水平。mEPMCs中PC与细胞自噬之间的直接关系及Shh信号非典型传导通路与细胞自噬之间的相互关系有待进一步研究。

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基金资助

国家自然科学基金地区科学基金项目(82160176)

贵州省科技厅科技计划项目（黔科合基础-ZL〔2023〕一般583）

遵义医科大学省级大学生创新创业项目(ZYDC2022064)

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