CHRNA5在胰腺癌发生发展过程中的作用及其机制

Effect of CHRNA5 in occurrence and development of pancreas cancer and its mechanism

摘要

目的 通过生物信息学方法和细胞实验探讨烟碱型乙酰胆碱受体α5亚基（CHRNA5）对胰腺导管腺癌（PDAC）侵袭和增殖的影响，并分析其调控通路，为寻找新的胰腺癌治疗靶点提供依据。 方法 自癌症基因组图谱（TCGA）和基因型组织表达（GTEx）数据库等公共数据库下载泛肿瘤和正常组织的转录组、基因变异和临床数据，利用Wilcoxon检验比较CHRNA5 mRNA在泛肿瘤患者与健康个体中的表达水平。通过基因表达综合数据库（GEO）中的数据集进一步比较胰腺癌和癌旁组织中CHRNA5 mRNA的表达水平，并采用三分法按照CHRNA5 mRNA的不同表达量将数据分为CHRNA5高表达、中表达和低表达组，对CHRNA5高表达和低表达组样本进行生存分析，以评估CHRNA5对胰腺癌预后的影响。采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和免疫组织化学法检测CHRNA5在肿瘤组织、癌旁组织、肿瘤细胞和正常细胞中mRNA和蛋白表达情况。对转录组数据进行差异分析和标志基因（Hallmark）与反应组数据库（Reactome）富集分析。基于转录组数据对PDAC进行免疫细胞浸润分析，同时进行肿瘤突变负荷（TMB）分析、单核苷酸变异（SNV）和拷贝数目变异（CNV）分析。将小干扰RNA（si）-NC和si-CHRNA5转染至MIA PaCa-2和Capan-2细胞，作为NC组、siRNA-1组和siRNA-2组，采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测在乙酰胆碱（ACh）（10 μmol·L^-1）和非ACh条件下各组细胞的增殖活性，采用Western blotting法检测各组细胞中c-Myc蛋白表达情况。 结果 与正常组织比较，包括胰腺癌在内的28种肿瘤组织中CHRNA5 mRNA表达水平升高（校正后P<0.05）。RT-qPCR和免疫组织化学法检测，与癌旁组织和正常胰腺导管细胞比较，CHRNA5在肿瘤组织和PDAC细胞中高表达。生存分析，高表达CHRNA5的PDAC患者较低表达患者预后差。在PDAC和对照样本中鉴定出994个差异表达基因（DEGs），其中上调基因381个，下调基因613个。基因集富集分析（GSEA），CHRNA5与氧化磷酸化、细胞增殖、免疫浸润和细胞周期高度有关。免疫分析，高表达CHRNA5的样本较低表达CHRNA5的样本免疫浸润更差。与CHRNA5低表达组比较，CHRNA5高表达组胰腺癌进展相关基因KRAS、TP53和SMAD4基因突变率更高。细胞实验，与NC+Ach组比较，siRNA-1+Ach组和siRNA-2+Ach细胞增殖活性明显降低（P<0.05）。Western blotting法检测，与NC组比较，siRNA-1组和siRNA-2组细胞中c-Myc蛋白表达量降低。 结论 CHRNA5通过髓细胞瘤病毒癌基因（MYC）家族调控细胞周期，从而影响胰腺肿瘤细胞的增殖，促进PDAC的进展，表明CHRNA5是治疗胰腺癌的潜在靶点。

Abstract

Objective To investigate the effects of cholinergic receptor nicotinic alpha 5 subunit（CHRNA5） on the invasion and proliferation of pancreatic ductal adenocarcinoma （PDAC） using bioinformatics approaches and cellular experiments， and to analyze its regulatory pathways and provide foundation for the identification of novel therapeutic targets for pancreatic cancer. Methods Transcriptome， gene variation， and clinical data of pan-tumor and normal tissues were downloaded from public databases including The Cancer Genome Atlas （TCGA） and Genotype-Tissue Expression （GTEx）. The expression levels of CHRNA5 mRNA between pan-tumor patients and healthy individuals were compared using Wilcoxon test. The expression levels of CHRNA5 mRNA between PDAC and para-cancer tissues were further compared using datasets from the Gene Expression Omnibus （GEO） database. The data were divided into three groups according to the different expression levels of CHRNA5 mRNA using tertile method： CHRNA5 high expression group， CHRNA5 medium expression group， and CHRNA5 low expression group. Survival analysis was performed in CHRNA5 high expression and low expression groups to assess the impact of CHRNA5 in prognosis of pancreas cancer. Real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） and immunohistochemistry methods were used to detect the expressions of CHRNA5 mRNA and protein in tumor tissue， paracancer tissue， tumor cells and normal cells. Differential analysis of the transcriptome data and enrichment analysis of Hallmark genes and Reactome pathways were then conducted. Immune cell infiltration analysis was performed on PDAC based on transcriptome data. Tumor mutation burden （TMB） analysis， single nucleotide variation （SNV）， and copy number variation （CNV） analysis were also conducted. The small interfering RNA （si）-NC and si-CHRNA5 were transfected into the MIA PaCa-2 and Capan-2 cells， and the samples were divided into NC， siRNA-1 and siRNA-2 groups according to the transfected siRNA. The proliferation activities of the cells in various groups under acetylcholine （Ach） and non-ACh conditions were detected using cell counting kit-8 （CCK-8） method， and the expression of c-Myc protein in the cells in various groups were detected using Western blotting method. Results Compared with normal tissue， the expression levels of CHRNA5 mRNA were elevated in 28 types of tumor tissues， including pancreatic cancer （adjusted P<0.05）. The results of RT-qPCR and immunohistochemistry revealed that CHRNA5 was highly expressed in tumor tissue and pancreatic ductal adenocarcinoma （PDAC） cells compared with paracancer tissue and normal pancreatic ductal cells. The survival analysis showed that the PDAC patients with high expression of CHRNA5 had worse prognosis compared with those with low expression of CHRNA5. A total of 994 differentially expressed genes （DEGs） were identified between PDAC and control samples， with 381 up-regulated genes and 613 down-regulated genes. The gene Set Enrichment Analysis （GSEA） results indicated that CHRNA5 was highly associated with oxidative phosphorylation， cell proliferation， immune infiltration， and cell cycle. The immune analysis results showed that the samples with high expression of CHRNA5 had poorer immune infiltration compared with those with low expression of CHRNA5. Compared with CHRNA5 low expression group， the mutation rates of pancreatic cancer progression-related genes KRAS， TP53， and SMAD4 in CHRNA5 high expression group were increased. In cell experiments， compared with NC+Ach group， the proliferation activities of the cells in siRNA-1+Ach group and siRNA-2+Ach group were significantly decreased （P<0.05）. The results of Western blotting revealed that the expression amounts of c-Myc protein in siRNA-1 and siRNA-2 groups were significantly lower than those in NC group. Conclusion CHRNA5 modulates the cell cycle via myelocytomatosis viral oncogene （MYC） family， thereby influencing the proliferation of pancreas cancer cells and promoting the progression of PDAC， suggesting that CHRNA5 is a potential therapeutic target for pancreas cancer.

Graphical abstract

关键词

胰腺导管腺癌 / 烟碱型乙酰胆碱受体α5亚基 / 神经递质 / 细胞周期 / 肿瘤进展

Key words

Pancreatic ductal adenocarcinoma / Cholinergic receptor nicotinic alpha 5 subunit / Neurotransmitter / Cell cycle / Tumour progression

胰腺癌是一种恶性程度极高的消化道肿瘤，以其隐匿的起病和较强的侵袭性而著称。近年来，胰腺癌的发病率逐渐上升，位于肿瘤相关死亡率排名的第三位，其中胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）占所有胰腺癌的90%以上，是胰腺癌的主要病理类型^［1］。目前对于PDAC有效的主要治疗方法是手术切除，但由于其起病隐 匿，80%~85%的患者在确诊时已失去手术机 会^［2］。 此 外， PDAC 肿 瘤 微 环 境（tumor microenvironment， TME） 高度纤维化和异质性强的特征限制了治疗药物的渗透和免疫治疗的效果^［3］。在我国，PDAC患者5年生存率仅为7.2%^［4］。因此，深入研究PDAC发生发展的分子机制，并开发新的诊断方法和有效的治疗策略至关重要。

随着癌症神经学这一新兴学科的发展，研究者发现神经系统与肿瘤之间存在着复杂的相互作用。中枢神经系统通过下丘脑-垂体-肾上腺轴释放糖皮质激素，影响肿瘤细胞和免疫系统，促进肿瘤生长^［5］。此外，交感神经系统通过释放肾上腺素和去甲肾上腺素，调节免疫反应或直接影响肿瘤细胞，影响肿瘤的发生发展过程^［6］。周围神经浸润（perineural invasion，PNI）指肿瘤细胞侵入神经空间或者包围神经周径三分之一以上的现象，其在PDAC中发生率极高^［7］。神经细胞释放的趋化因子招募肿瘤细胞，而肿瘤细胞通过轴突生长因子刺激神经轴突向肿瘤组织内生长，为肿瘤提供物质支持，促进肿瘤细胞的增殖和扩散^［8-9］。目前，针对神经递质及其受体的靶向治疗策略在PDAC治疗领域中逐渐显露其研究潜力。

烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptor，nAChR）是一种重要的神经递质受体，属于配体门控离子通道家族，位于细胞膜上，通过调节乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）的释放和信号传递，影响神经兴奋性和肌肉收缩^［10］。烟碱型乙酰胆碱受体α5亚基（cholinergic receptor nicotinic alpha 5 subunit，CHRNA5）基因编码nAChR的α5亚基，在多种细胞中发挥作用，其在神经系统中的作用是多方面的，包括神经信号传递、调节认知功能和神经保护等^［11-12］。而CHRNA5的功能不仅限于神经系统，其在肿瘤发展中的作用也日益受到关注。CHRNA5通过Notch1信号通路促进黑色素瘤的形成^［13］，并在肺癌中通过介导Ca²⁺内流激活血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路，促进肿瘤的进展^［14-15］。另有研究^［16］发现：利用ACh激动剂多杀菌素阻断CHRNA5与上皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的相互作用，有效抑制了肺癌细胞的增殖。此外，有研究者^［17］发现：肝内胆管癌细胞中CHRNA5通过调控细胞内Ca²⁺水平影响细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）以及脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的释放，从而影响细胞的侵袭能力和肿瘤神经微环境。然而，针对CHRNA5在PDAC中作用和机制的研究还相对有限。

本研究利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库和基因型组织表达（Genotype-Tissue Expression，GTEx）数据库，比较CHRNA5在泛肿瘤和健康样本中的表达情况，探讨了该基因对预后生存、TME和突变特征的影响，旨在研究CHRNA5促进PDAC进展的分子机制，为胰腺癌患者的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1　公共数据来源

从TCGA数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov）下载泛肿瘤转录组、基因变异和生理指标数据，从GTEx数据库（https：//gtexportal.org/home）下载健康对照样本的转录组数据。从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载4个胰腺癌GEO数据集（GEO Series，GSE）（GSE16515、GSE28735、GSE62165和GSE71729）。

1.2　细胞、主要试剂和仪器

人胰腺癌细胞AsPc-1、BxPC-3、Capan-1、Capan-2、MIA PaCa-2、PANC-1、Patu-8988和SW1990以及正常人胰腺导管细胞hTERT-HPNE来源于中国科学院细胞库。胎 牛 血 清（fetal bovine serum，FBS）、 马 血 清、1%青-链霉素、DMEM培养基以及RPMI 1640培养 基 购 自 美 国 ThermoFisher 公 司，TRIzol、PrimeScript^TM RT Master Mix和SYBR Green定量检测试剂盒购于日本TaKaRa公司，RIPA裂解液、超敏ECL试剂液、3，3'-二氨基联苯胺 （3，3'- diaminobenzidine，DAB）、苏木素和5×SDS上样缓冲液购于苏州新赛美生物科技有限公司，转染试剂jetPRZME Buffer和jetPRIME Ragent购自法国PolyPlus-transfection公司，4%多聚甲醛、EDTA盐、Tris缓冲的Tween-20缓冲液（Tris buffered saline with Tween 20，TBST）、过氧化氢和脱脂奶粉购于武汉塞维尔生物科技有限公司，细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8，CCK-8）溶液购自上海圣尔生物科技有限公司，ACh购于美国MCE公司，鼠抗CHRNA5单克隆抗体和鼠抗β-actin单克隆抗体购于武汉三鹰生物科技有限公司，兔抗c-Myc购于美国Abcam公司，山羊抗鼠二抗和山羊抗兔二抗购自美国Immunoway公司。引物序列和小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）由和元（上海）生物科技有限公司合成和构建。蛋白电泳仪和成像系统购于美国伯乐公司，LEICA Aperio GT450智能数字病理扫描仪购于德国LEICA公司。

1.3　细胞培养

本研究细胞培养标准遵循美国模式菌种保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC） 的 要 求， 其 中 AsPc-1 和BxPC-3细胞采用含10% FBS和1%青-链霉素的RPMI 1640培养基培养，MIA PaCa-2采用含2.5%马血清、10% FBS和1%青-链霉素的RPMI 1640培养基培养，Capan-1、Capan-2、hTERT-HPNE、PANC-1、Patu-8988和SW1990细胞采用含10% FBS和1%青-链霉素的DMEM培养基培养。培养箱内CO₂浓度为5%，温度设置为37 ℃。

1.4　差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）鉴定

对TCGA和GTEx数据库以及GEO数据库的基因表达数据，利用Wilcoxon test检验CHRNA5高和低表达组中每个基因的差异，并对P值进行多重检验校正错误发现率（false discovery rate，FDR），采用ggplot2 3.4.2绘制箱线图。差异倍数（fold change，FC）变化>2且差异检验校正后P<0.05的基因作为DEGs，用于后续分析。

1.5　基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）

将TCGA数据库中PDAC患者根据CHRNA5表达中位值分为高和低表达组，并计算2组中每个基因的FC，采用ClusterProfiler 4.7.1.3和GseaVis 0.0.9进行GSEA分析及结果可视化，参考数据库为Hallmark和Reactome。

1.6　生存分析

基于TCGA数据库中PDAC患者的转录组数据，根据CHRNA5 mRNA的表达值分为高、低和中表达组，结合高表达组和低表达组患者的临床数据，采用R包survminer 0.4.9进行预后生存分析。

1.7　免疫浸润分析

根据免疫细胞基因集并采用R包GSVA 1.46.0对TCGA数据库中PDAC转录组数据进行免疫浸润分析，计算各个免疫细胞单样本基因集富集分析（Single-Sample Gene Set Enrichment Analysis，ssGSEA）评分， 并对CHRNA5高表达和低表达组进行差异检验和多重检验校正。

1.8　单核苷酸变异（single nucleotide variant，SNV）分析

采用R包maftools 2.16.0处理从TCGA下载的PDAC患者的SNV数据，并进行数据可视化。肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）采用 maftools 2.16.0 提取数据，并用R包ggplot2 3.4.2绘制小提琴图。

1.9　拷贝数目变异（copy number variant，CNV）分析

采用软件GISTIC2 2.0.23处理从TCGA下载的PDAC患者CNV数据，并进行数据可视化。

1.10　实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）检测胰腺癌细胞和正常人胰腺导管细胞中CHRNA5 mRNA表达水平

使用TRIzol试剂从各种细胞中提取总RNA，使用PrimeScript^TM RT Master Mix合成cDNA后进一步通过RT-qPCR检测CHRNA5表达水平。以GAPDH作为内参对照，采用2^-ΔΔCt 法计算CHRNA5 mRNA表达水平。引物序列见表1。

1.11　免疫组织化学法检测胰腺癌和癌旁组织切片中CHRNA5蛋白表达情况

胰腺癌和癌旁组织样本收集自2021年9月-12月上海交通大学医学院附属仁济医院治疗的6例PDAC患者的肿瘤组织及相应癌旁组织标本。所有患者签署知情同意书。胰腺癌和癌旁组织标本经4%多聚甲醛固定后，进行石蜡包埋与切片处理。对包埋好的石蜡切片通过脱蜡、复水，pH=8.0的EDTA溶液水浴锅95 ℃水浴20 min修复。随后利用0.3%过氧化氢浸泡15 min封闭内源性过氧化物酶，采用TBST混合的10%山羊血清室温封闭1 h，甩去封闭液后CHRNA5一抗4 ℃孵育6 h。孵育完成后TBST洗片3次，每次10 min，洗去一抗后用山羊抗鼠二抗室温孵育2 h。DAB显色2 min后洗去DAB，苏木素复染，随后自来水冲洗返蓝。脱水、透明后使用LEICA Aperio GT450智能数字病理扫描仪进行扫片，用LEICA分析软件LAS X Office分析图像。

1.12　siRNA瞬时转染MIA PaCa-2和Capan-2细胞干扰CHRNA5表达

在6孔细胞培养板中接种对数生长期的MIA PaCa-2和Capan-2细胞。待细胞生长至60%~70%融合度时，分别用阴性对照（NC-siRNA）、CHRNA5-siRNA-1和CHRNA5-siRNA-2转染MIA PaCa-2和Capan-2细胞（作为NC组、siRNA-1组和siRNA-2组），利用jetPRIME Buffer溶解稀释的siRNA，混匀后加入jetPRIME Ragent，室温放置15 min后，将混合物加入细胞培液并混匀，48 h后采用RT-qPCR检测干扰效率。siRNA和阴性对照序列见表2。

1.13　CCK-8法检测干扰CHRNA5表达后胰腺癌细胞增殖活性

细胞经干扰48 h，将MIA PaCa-2和Capan-2细胞按照每孔1×10⁴个细胞的密度铺于96孔板中，置于37 ℃和5%CO₂浓度条件下培养，每组设置3个平行孔。待细胞贴壁弃去培养液，按实验分组（表3）添加培养基和ACh处理8 h。随后，在每孔添加入10 μL的CCK-8溶液，孵育1 h后采用酶标仪检测450 nm波长处吸光度（A）值，分别在24和48 h检测，并绘制增殖曲线，以A值代表细胞增殖活性。

1.14　Western blotting法检测CHRNA5干扰效率和干扰CHRNA5后胰腺癌细胞中c-Myc蛋白表达情况

将转染前和转染后的MIA PaCa-2和Capan-2细胞置于冰上，大皿加入500 μL RIPA缓冲液，6孔细胞培养板每孔加入100 μL RIPA蛋白裂解液，冰上裂解10 min后用细胞刮刀快速刮下细胞，收集在EP管中，于4 ℃、12 000 r·min^-1离心10 min，收集上清液。加入5×SDS上样缓冲液混匀后，100 ℃水浴变性10 min。用10% PAGE凝胶分离水浴后的蛋白样品，随后冰上恒定电流200 mA转膜70 min。5%脱脂奶粉常温封闭1 h，TBST洗净，一抗60 r·min^-1摇床4 ℃孵育6 h（CHRNA5、c-Myc和β-actin），随后用TBST 在60 r·min^-1摇床上清洗3次，每次10 min，加入二抗，室温孵育2 h，随后在60 r·min^-1摇床上清洗5次，每次5 min。在成像前取200 μL超敏ECL滴加于膜上，用伯乐凝胶成像仪成像，图像由Image Lab软件分析。

1.15　统计学分析

采用R 4.2.3软件进行统计学分析。生物信息学分析部分采用Wilcoxon检验分析实验组和对照组的差异，包括基因表达、免疫细胞浸润评分以及TMB，并对P值进行FDR校正，校正后P<0.05认为2组有明显差异。实验部分采用Graphpad Prism 9.0软件进行统计学分析，计量数据以x±s表示，多组样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　33种肿瘤组织中CHRNA5 mRNA表达水平

与正常组织比较， 在33种肿瘤中， 28种肿瘤组织中CHRNA5 mRNA表达水平升高（adjusted P<0.05）， 包括肾上腺皮质癌 （adrenocortical carcinoma，ACC）、膀 胱 尿 路 上 皮 癌（bladder urothelial carcinoma， BLCA）、 乳 腺 浸 润 性 癌（breast invasive carcinoma，BRCA）、宫颈鳞状细胞癌和宫颈内腺癌（cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma，CESC）、 胆 管 癌（cholangio carcinoma，CHOL）、结肠腺癌（colon adenocarcinoma，COAD）、弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBC）、食管癌（esophageal carcinoma，ESCA）、肺鳞状细胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）、多形性成胶质细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）、卵巢浆液性囊腺瘤 （ovarian serous cystadenocarcinoma，OV）和肾透明细胞癌（kidney clear cell carcinoma，KIRC）等。见图1。

2.2　 CHRAN5 mRNA在胰腺癌中的表达情况

在GSE16515、GSE28735、GSE62165和GSE71729中分析CHRNA5 mRNA的表达情况，与正常组织比较，PDAC组织中CHRNA5 mRNA表达水平明显升高（adjusted P<0.05）。见图2。

2.3　PDAC细胞和组织中CHRNA5 mRNA和蛋白表达

RT-qPCR法结果显示：与正常胰腺导管细胞hTERT-HPNE比较，在多种PDAC细胞中CHRNA5 mRNA表达水平升高，在MIA PaCa-2、Capan-2和PANC-1细胞中CHRNA5 mRNA表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）。见图3。免疫组织化学染色结果显示：与癌旁组织比较，PDAC组织中CHRNA5蛋白表达量增加。见图4。

2.4　胰腺癌组织中高表达CHRNA5对预后的影响

生存分析结果显示：与CHRNA5低表达组比较，CHRNA5高表达组患者无进展生存期（progression-free survival，PFS）明显降低（P<0.05），总生存期（overall survival，OS）降低（P=0.063），CHRNA5高表达PDAC患者预后生存较差。见图5。

2.5　DEGs分析

在TCGA数据库PDAC分成的CHRNA5高表达组和CHRNA5低表达组中共检出994个DEGs（校正后P<0.05且|log₂FC|>1），其中上调的基因有381个，下调的基因有613个。见图6。

2.6　 CHRNA5的生物学功能

基于Reactome数据库GSEA的结果显示：CHRNA5的表达与多个关键生物学通路有关联，包括DNA replication preinitiation、Chromosome Maintenance、Cell cycle checkpoint和DNA replication。见图7。此外，基于Hallmark数据库GSEA的结果显示：CHRNA5的表达与E2F targets、G2M checkpoint、MYC targets v1和Oxidative phosphorylation 等 途 径 有 密 切 关 联。见图8。

2.7　 CHRNA5对TME中免疫细胞的影响

免疫浸润分析结果显示：CHRNA5高表达组中央记忆型T细胞、记忆B细胞、γ-ΔT细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞和辅助T细胞等细胞浸润水平明显高于CHRNA5低表达组（校正后P<0.05）。自然杀伤细胞和中性粒细胞在高表达CHRNA5的样本中浸润更多，而巨噬细胞、非成熟B细胞和活化B细胞的浸润明显下降。见图9。

2.8　 CHRNA5对肿瘤细胞变异的影响

基于SNV数据进行TMB评分分析，结果表明CHRNA5高表达的PDAC样本中具有更高的TMB（P<0.01）。见图10A。SNV的分析结果显示：与CHRNA5低表达组比较，CHRNA5高表达组KRAS、TP53和SMAD4基因的变异率更高。见图10B。CNV的分析结果也显示CHRNA5高表达样本具有较高的变异拷贝。见图11。

2.9　siRNA干扰后胰腺癌细胞增殖活性

采用siRNA干扰MIA PaCa-2和Capan-2细胞后，与NC 组 比 较， siRNA-1 组 和 siRNA-2 组 细 胞 中CHRNA5 mRNA表达明显降低 （P<0.001）， 见图12。CCK-8法检测结果显示：与NC组比较，siRNA-1组和siRNA-2组Capan-2细胞增殖活性无明显著变化，siRNA-1组MIA PaCa2细胞增殖活性明显降低（P<0.05）。ACh 处 理 后， 与 NC+Ach 组 比 较，siRNA-1+Ach和siRNA-2+Ach组细胞增殖活性明显降低（P<0.05）。见图13。

2.10　siRNA干扰后胰腺癌细胞中c-Myc蛋白表达情况

与NC组比较，siRNA-1组和siRNA-2组MIA PaCa-2和Capan-2细胞中c-Myc蛋白表达量降低。见图14。

3 讨 论

胰腺癌以其高度侵袭性、早期诊断的复杂性及较差的预后而著称。目前，胰腺癌的发病机制尚不明晰，深入探讨其分子机制对于推动胰腺癌的早期筛查和开发新型有效的治疗手段至关重要。近年来，TME中的神经-肿瘤相互作用成为研究热点，特别是神经递质如5-羟色胺、去甲肾上腺素及ACh，其在调控肿瘤生物学行为中的角色日益受到关注^［18］。神经递质受体可能成为PDAC治疗的新靶点，对其防治策略具有深远影响。本研究探讨CHRNA5在PDAC中的生物学功能，通过系统性分析，阐明了CHRNA5与PDAC发病的内在联系和潜在分子机制，为PDAC的靶向治疗提供了新思路。

CHRNA5基因具有神经信号传递、调节认知功能以及保护神经等作用^［11-12］，近年来研究^［13］发现CHRNA5与肿瘤的发生也有密切关系。本研究通过数据分析发现CHRNA5在PDAC中高表达，且与预后不良有关，提示CHRNA5可能促进了PDAC的进展。本实验结果显示：单独干扰CHRNA5对PDAC细胞增殖明显影响，但在ACh处理下，干扰CHRNA5可使细胞增殖活性明显降低，这提示CHRNA5可能与ACh相互作用，共同调节PDAC细胞的增殖。另有研究^［17］显示ACh通过CHRNA5促进肝内胆管癌的EMT并促进其转移，nAChR激活能够促进肿瘤增长^［19］。本研究结果为CHRNA5通过ACh参与肿瘤发生发展增加了新证据，为阐明胰腺癌发生的分子机制提供了依据。

本研究发现CHRNA5与肿瘤免疫微环境存在密切关系。CHRNA5可能与PDAC的TME中巨噬细胞和活化状态B细胞的浸润减少以及中性粒细胞浸润的增加有关联。在TME中，巨噬细胞扮演着复杂的角色，能够根据微环境中的信号响应而采取不同的激活状态，即M1型（促炎）和M2型（抗炎或促肿瘤）^［20］。M1型巨噬细胞倾向于发挥抗肿瘤效应，而M2型巨噬细胞则可能促进肿瘤发展^［21］。活化B细胞在抗原呈递过程中起到关键作用，通过其独特的机制招募T细胞，参与形成具有免疫激活特性的“热”肿瘤微环境。中性粒细胞通过形成中性粒细胞细胞外陷阱锚定循环肿瘤细胞，促进其转移，促进肿瘤的进展^［23-24］。本研究结果表明CHRNA5的高表达增加了炎症相关免疫细胞如中性粒细胞的浸润，同时减少了免疫监视相关免疫细胞活化B细胞的浸润，而CHRNA5如何影响PDAC肿瘤免疫微环境并促进肿瘤进展还需要深入研究。

髓细胞瘤病毒癌基因（myelocytomatosis viral oncogene，MYC）家族癌蛋白是癌细胞代谢重组过程中的关键调控因子，在多种恶性肿瘤中均被激活^［25］。作为MYC家族成员之一，c-Myc在部分肿瘤细胞中过表达并参与调节细胞周期、细胞衰老、细胞分化和细胞凋亡等许多生理过程^［26］。本研究首先通过数据分析发现CHRNA5与细胞周期相关的通路DNA replication preinitiation、Cell cycle checkpoint、E2F targets、G2M checkpoint、MYC targets V1和DNA replication有关联，并通过实验验证了CHRNA5影响了c-Myc蛋白的表达，这表明CHRNA5可能通过调控c-Myc蛋白，促进肿瘤细胞的增殖。

CHRNA5基因可能通过促进肿瘤细胞的基因变异促进了肿瘤的进展。本研究发现CHRNA5与TMB呈正相关，表明CHRNA5高表达的PDAC样本中具有更多的肿瘤突变负荷。此外，CHRNA5高表达与KRAS、TP53和SMAD4基因的变异率显著增加有关，而这些基因的变异与PDAC的分期进展高度相关^［27-28］。这表明CHRNA5可能通过影响肿瘤驱动基因的变异，进而促进了PDAC的进展。

综上所述，本研究不仅确认了CHRNA5在PDAC及其他肿瘤中的重要性，还对其在PDAC进展中的作用机制进行了初步探讨，为PDAC的治疗提供了潜在靶点和理论依据。未来的研究应进一步探索CHRNA5与其他信号通路的交互作用，以及其在临床实践中作为预后标志物和治疗靶点的可行性。此外，开发针对CHRNA5的特异性抑制剂，结合现有的抗癌策略，可能会为PDAC患者提供新的治疗策略。

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基金资助

上海市卫健委卫生行业临床研究专项面上项目(202340202)

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