过表达circRNAs修饰牙髓干细胞来源的外泌体对人脐静脉内皮细胞血管生成的促进作用

Promoting effect of overexpressed circRNAs-modified dental pulp stem cell-derived exosomes on angiogenesis of human umbilical vein endothelial cells

摘要

目的 探讨过表达环状RNA（circRNAs）修饰牙髓干细胞（DPSCs）来源外泌体（Exo）促进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）血管生成在牙髓血管再生中的作用，并阐明相关分子机制。 方法 分离乳齿源-、成人智齿源-和老年人恒牙源-原代DPSCs。流式细胞术检测3种原代DPSCs表面标志物蛋白阳性表达情况。使用3种来源的DPSCs与HUVECs建立共培养体系，将细胞分为乳牙源-原代DPSCs组、成人智齿源-原代DPSCs组和老年人恒牙源-原代DPSCs组。另将细胞分为Exo-OE vector组、Exo-circ_0026827 OE组和Exo-circRNA 124534 OE组，分别转染腺病毒介导的OE vector、circ_0026827 OE和circRNA124534 OE后，分离其细胞培养上清液Exo。细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测各组HUVECs增殖活性，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组Exo中血管生成相关circRNAs表达水平，Western blotting法检测共培养细胞上清中Exo标志物相关蛋白表达水平。验证各组细胞Exo摄取情况，血管生成-诱导实验检测细胞上清液中Exo分离情况。 结果 大部分细胞表面标志物表达情况为白细胞分化抗原44（CD44）（+）、白细胞分化抗原34（CD34）（-）和基质细胞抗原1（Stro-1）（+），鉴定为原代DPSCs。CCK-8法检测，与乳牙源-原代DPSCs组比较，成人智齿源-原代DPSCs组和老年人恒牙源-原代DPSCs组共培养的HUVECs增殖活性明显降低（P<0.01）；与成人智齿源-原代DPSCs组比较，老年人恒牙源-原代DPSCs组共培养的HUVECs增殖活性明显降低（P<0.01）。3种共培养体系细胞培养上清液Exo中白细胞分化抗原9（CD9）、热激蛋白70（HSP70）和肿瘤易感基因101（TSG101）均表达阳性。3种共培养体系细胞上清液中Exo的粒径为50~110 nm。RT-qPCR法检测，与乳牙源-原代DPSCs组比较，成人智齿源-原代DPSCs组和老年人恒牙源-原代DPSCs组Exo中circRNA124534和circ_0026827 mRNA表达水平均明显降低（P<0.01）；与成人智齿源-原代DPSCs组比较，老年人恒牙源-原代DPSCs组Exo中circRNA124534和circ_0026827 mRNA表达水平均明显降低（P<0.01）；3组Exo中circ_信号诱导增殖相关基因1（SIPA1L1） mRNA表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。Western blotting法检测，与Exo-OE vector组比较，Exo-circ_0026827 OE组HUVECs中磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（p-p38 MAPK）、血管内皮生长因子A（VEGF-A）、血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）、血管发生素1（Ang-1）、基质细胞衍生因子1（SDF-1）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）；与Exo-OE vector组比较，Exo-circRNA124534 OE组HUVECs细胞中p-p38 MAPK、VEGF-A、VEGFR2、Ang-1、SDF-1和MMP-9蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）。各组HUVECs均成功摄取Exo。Exo-OE vector组HUVECs呈现较为平铺的生长状态；与Exo-OE vector组比较，Exo-circ_0026827 OE组和Exo-circRNA124534 OE组HUVECs呈现网状排列的生长状态，并有排列成管状的趋势。 结论 过表达circ_0026827和circRNA124534修饰乳牙DPSCs来源的Exo对HUVECs血管生成有一定促进作用。

Abstract

Objective To discuss the role of circular RNAs （circRNAs）-overexpressing modified dental pulp stem cells （DPSCs）-derived exosomes （Exo） in promoting angiogenesis of the human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） in dental pulp vascular regeneration， and to clarify the related molecular mechanism. Methods The primary DPSCs derived from deciduous teeth， adult wisdom teeth， and elderly permanent teeth were isolated. Flow cytometry was used to detect the positive expression of surface marker proteins in three kinds of primary DPSCs. Co-culture systems were established using three sources of DPSCs and HUVECs， and the cells were divided into deciduous teeth-derived primary DPSCs group， adult wisdom teeth-derived primary DPSCs group， and elderly permanent teeth-derived primary DPSCs group. Additionally， the cells were divided into Exo-OE vector group， Exo-circ_0026827 OE group， and Exo-circRNA124534 OE group； after transfection with adenovirus-mediated OE vector， circ_0026827 OE， and circRNA124534 OE， respectively， the Exo from the cell culture supernatant were isolated. Cell counting kit-8 （CCK-8） method was used to detect the proliferation activities of the HUVECs in various groups； real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） method was used to detect the expression levels of angiogenesis-related circRNAs in the Exo in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of Exo marker-related proteins in the supernatant of co-cultured cells. The uptakes of Exo by the cells in various groups were verified； angiogenesis induction experiment was used to detect the isolation of Exo from cell supernatant. Results Most cells expressed CD44（+）， CD34（-）， and Stro-1（+）， and were identified as primary DPSCs.The CCK-8 assay results showed that compared with deciduous teeth-derived primary DPSCs group， the proliferation activity of the HUVECs co-cultured in adult wisdom teeth-derived primary DPSCs group and elderly permanent teeth-derived primary DPSCs group was significantly decreased （P<0.01）； compared with adult wisdom teeth-derived primary DPSCs group， the proliferation activity of the HUVECs co-cultured in elderly permanent teeth-derived primary DPSCs group was significantly decreased （P<0.01）. cluster of differentiation 9 （CD9）， heat shock protein 70 （HSP70）， and tumor susceptibility gene 101（TSG101） were positively expressed in the Exo from the cell culture supernatant of three co-culture systems. The particle sizes of Exo from the cell supernatant in three co-culture systems were 50-110 nm. The RT-qPCR results showed that compared with deciduous teeth-derived primary DPSCs group， the mRNA expression levels of circRNA124534 and circ_0026827 in the Exo in adult wisdom teeth-derived primary DPSCs group and elderly permanent teeth-derived primary DPSCs group were significantly decreased （P<0.01）； compared with adult wisdom teeth-derived primary DPSCs group， the mRNA expression levels of circRNA124534 and circ_0026827 in the Exo in elderly permanent teeth-derived primary DPSCs group were significantly decreased （P<0.01）； there was no statistically significant difference in the circ_signal-induced proliferation-associated 1 like 1 （SIPA1L1） mRNA expression level among three groups （P>0.05）. The Western blotting results showed that compared with Exo-OE vector group， the protein expression levels of phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase （p-p38 MAPK）， vascular endothelial growth factor A （VEGF-A）， vascular endothelial growth factor receptor 2 （VEGFR2）， angiopoietin 1 （Ang-1）， stromal cell-derived factor 1 （SDF-1）， and matrix metalloproteinase 9 （MMP-9） in the HUVECs in overexpression circ_0026827 and circRNA124534 were significantly increased （P<0.01）； compared with Exo-OE vector group， the protein expression levels of p-p38 MAPK， VEGF-A， VEGFR2， Ang-1， SDF-1， and MMP-9 in the HUVECs in Exo-circRNA124534 OE group were significantly increased （P<0.01）. The HUVECs in various groups successfully took up Exo.The HUVECs in Exo-OE vector group showed a relatively flattened growth state. Compared with Exo-OE vector group， the HUVECs in Exo-circ_0026827 OE group and Exo-circRNA124534 OE group showed a reticularly arranged growth state and a tendency to form tubular structures. Conclusion The deciduous teeth DPSCs-derived Exo modified by overexpression circ_0026827 and circRNA124534 has a certain promoting effect on angiogenesis of the HUVECs.

Graphical abstract

关键词

牙髓血管再生 / 牙髓干细胞 / 人脐静脉内皮细胞 / 环状RNAs / 外泌体

Key words

Dental pulp vascular regeneration / Dental pulp stem cells / Human umbilical vein endothelial cells / Circular RNAs / Exosomes

牙髓炎是由于损伤或感染引起的牙髓炎症。根尖牙周炎（apical periodontitis，AP）是由牙髓源性病原体引起的根周组织的炎症和损伤，通常是牙髓坏死的结果^［1］。全球范围内年龄标准化患病率最高的疾病已被确定为口腔疾病，其中恒牙龋齿在所有口腔疾病中患病率最高^［2］。全球1/2的成年人中至少有一颗牙齿患有AP，而全球至少有一颗牙齿有AP的患病率为15%~85%^［3］。就牙髓炎而言，评估其真实患病率更具挑战性，因为高达40%的个体牙髓会感染，而许多牙髓炎在没有症状的情况下进展至坏死^［4］。目前的治疗方法是根管治疗（root canal therapy，RCT）和牙髓血管重建术。尽管临床表现为完全恢复和组织学重建，但真正的牙髓组织再生仍远未实现。再生牙髓学的目标是促进炎症或坏死牙齿恢复正常的牙髓功能^［5］。牙髓是一种高度血管化的组织，需要足够的血液供应才能成功再生，新再生的牙本质-牙髓组织必须与原始组织相似，由组织良好的结缔组织和血管丰富、神经支配的活牙髓组成^［6］。因此，牙髓的血管再生对于再生牙髓十分重要。

牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）属于间充质干细胞，可以分化成多系细胞，如脂肪细胞、神经细胞、血管内皮细胞和成骨细胞等^［7］。人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）是用于血管生成的重要间充质干细胞类型之一。但无论是在体向小鼠模型单独移植DPSCs或单独移植HUVECs，均不能形成新生血管腔内有足够红细胞的血管样结构。此类新生血管腔内需有红细胞存在，才能表明在血管周基质网中形成的新生血管样结构与宿主循环系统之间形成了良好的吻合^［8］。因此，有必要深入研究DPSCs和HUVECs的混合培养是否具有促进形成血管腔内存在足够红细胞且与宿主循环系统之间能够形成良好吻合血管样结构的能力。此类研究在国内 外 少 有 报 道。 环 状 RNAs（circular RNAs，circRNAs）是一类调节性RNAs，与线性RNAs比较，其通过反向剪接形成了圆形共价封闭结构，对外切酶具有更大的抗性，因此能够以细胞和组织特异性的方式高水平积累，在调节性RNAs研究领域受到了极大的关注^［9-10］。circRNAs以其独特的调控方式与多种病理生理过程密切相关，包括作为微小RNA（micro RNA，miRNA）的海绵体竞争性结合和抑制miRNAs、与RNA结合蛋白形成复合体并调节蛋白-蛋白相互作用及部分circRNAs还可能被翻译成功能蛋白等参与基因表达调控或直接参与执行细胞功能。本研究探讨外泌体（exosome，Exo）对HUVECs的血管生成能力的影响，并阐明其相关机制，旨在为AP的相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1　细胞、主要试剂和仪器

HUVECs购自武汉普诺赛生命科技有限公司。RNA纯化试剂盒、TIANScript Ⅱ cDNA 第 一 链 合 成 试 剂 盒、FastUniversal快速荧光定量PCR预混试剂（SYBR Green）和Bradford蛋白质定量试剂盒购自天根生化（北京）科技有限公司（中国），IlluTINGO系列染料购自北京云肽生物科技有限公司，Matrigel购 自 美 国 BD 公 司，内 皮 细 胞 生 长 培 养 基 2（endothelial cell growth medium-2，EGM-2）完全培养液（含生长因子）购自瑞士LONZA公司，FITC-标记免疫球蛋白G2a同型对照（IgG2a Isotype control）抗体或FITC-标记抗人白细胞分化抗原44（cluster of differentiation 44，CD44）、FITC-标记抗人白细胞分化抗原34（cluster of differentiation 34，CD34）或FITC-标记抗人基质细胞抗原1（stromal cell antigen-1，Stro-1）抗体、抗人磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase，p-p38 MAPK）多抗、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A）单 抗、 血 管 内 皮 生 长 因 子 受 体 2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）、血管发生素1（angiopoietin-1，Ang-1）单抗、基质细胞衍生因子1 （stromal cell-derived factor-1， SDF-1）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9） 单 抗、 甘 油 醛-3-磷 酸 脱 氢 酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多抗一抗、山羊抗兔免疫球蛋白G（轻链+重链）［immuno globulin G （light+heavy chain），IgG（H+L）］二抗和总Exo分离试剂均购 自 赛 默 飞 世 尔 科 技（中 国） 有 限 公 司。circRNA124534 OE和circ_0026827 OE过表达扩增引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司代为合成，腺病毒载体pADV-CMV-S-circRNA购自和元生物技术（上海）股份有限公司，腺病毒颗粒的包装实验也委托其代为完成。Attune NxT流式细胞仪和Multiskan FC酶标仪购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，ECLIPSE LV100N POL光学显微镜和ECLIPSE Ts2R倒置荧光显微镜购自日本尼康株式会社。

1.2　3种来源DPSCs的分离

1颗乳齿牙髓组织取自一名8岁儿童（女性）的乳齿。纳入标准为乳牙无临床病理特征，为健康牙齿，处于脱落状态，因矫形治疗而进行拔牙。排除标准为牙齿健康但无拔牙指征或牙齿有某些病理指征。父母接受孩子参与本研究，并签署书面知情同意书，同意捐献乳齿牙髓组织。

1颗成人智齿牙髓组织取自一名36岁成年男性的智齿。纳入标准为智齿无临床病理特征，为健康牙齿，因矫形治疗而进行拔牙。排除标准为牙齿健康但无拔牙指征或牙齿有某些病理指征。本人同意参与本研究，并签署书面知情同意书，同意捐献智齿牙髓组织。

1颗老年人恒牙牙髓组织取自一名69岁成年男性的恒牙。纳入标准为恒牙因磨耗导致牙髓暴露；就诊前无自发疼痛或冷热刺激痛，临床检查无叩痛；露髓直径<1 mm；牙周健康，无牙周袋。排除标准为患有系统性疾病或罕见病患者。本人同意参与本研究，并签署书面知情同意书，同意捐献智齿牙髓组织。

牙齿样本采集当天，用2%氯己定浸湿纱布直接清洁牙面5 min。向50 mL Falcon离心管中加入适量含1 000 µg·L^-1 链霉素、1 000 U·L^-1 青霉素和0.25 g·L^-1两性霉素B的1×磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），将采集获得的牙齿样本浸没其中，在4 ℃下运送至实验室。在4 ℃下在上述1×PBS缓冲液中将牙髓组织分割成尽可能小的小块，置于GentleMACS 解离器上解离。然后以300 g离心10 min。收集下层细胞沉淀，加入终浓度为3 g·L^-1 Ⅰ型胶原酶和4 g·L^-1中性蛋白酶，将悬浮液置于37 ℃下孵育30 min。结束后再次以300 g离心10 min。弃上清液，加入含10%胎牛血清的5 mL DMEM F12完全培养液洗涤1次，使酶失活。然后悬浮液过80 μm细胞筛网，最后加入1 mL DMEM F12完全培养液重悬原代DPSCs并培养，使用传代5代以内的原代DPSCs进行后续实验。

1.3　流式细胞术检测3种原代DPSCs表面标志物蛋白阳性表达

制备终浓度为1×10⁷ L^-1的原代DPSCs单细胞悬液。取100 µL，分别加入FITC-标记Isotype contrl抗体或FITC-标记抗人CD44、抗人CD34或抗人Stro-1抗体，4 ℃下避光孵育1 h。上机流式细胞仪进行分析检测，并分别计数CD44⁺、CD34^-或Stro-1⁺细胞所占百分率，即为蛋白阳性表达情况^［11］。

1.4　原代DPSCs与HUVECs共培养体系建立、细胞分组和处理

采用24孔细胞培养板细胞小室进行共培养。下层24孔细胞培养板培养原代DPSCs，上层细胞小室培养HUVECs。培养液为含10%胎牛血清的DMEM F12完全培养液。根据不同来源原代DPSCs与HUVECs的共培养体系，将细胞分为乳牙源-原代DPSCs组、成人智齿源-原代DPSCs组和老年人恒牙源-原代DPSCs组，其中的原代DPSCs分别来源于乳牙、成人智齿和老年人恒牙。

1.5　细胞转染和分组

采用腺病毒载体pADV-CMV-S-circRNA介导circRNAs的过表达。circRNA124534 OE和circ_0026827 OE过表达扩增引物委托上海生工生物（中国）代为合成^［12-13］。将上述2种过表达扩增产物连接入腺病毒载体pADV-CMV-S-circRNA的多克隆位点中，并委托上海和元生物代为完成腺病毒颗粒的包装实验。OE vector组为单纯腺病毒空载颗粒。

将细胞分为Exo-OE vector组、Exo-circ_0026827 OE组和Exo-circRNA124534 OE组。3组分别为乳牙-源原代DPSCs分别转染腺病毒介导的OE vector、circ_0026827 OE和circRNA124534 OE后，分离其细胞培养上清液Exo。将100 µL上述不同来源Exo加入HUVECs中，根据实验要求处理HUVECs。

1.6　细胞计数试剂盒8 （cell counting kit-8，CCK-8） 法检测3种共培养体系中HUVECs增殖活性

原代DPSCs与HUVECs的共培养体系连续培养48 h后，取下上层细胞小室，置于一个新的24孔细胞培养板中，下层无细胞培养物。使用CCK-8试剂盒检测各组细胞增殖活性，按照试剂盒说明书操作，向细胞培养物中加入CCK-8试剂，再连续培养6 h，采用酶标仪于450 nm波长处测定每孔吸光度（A）值，以A值代表细胞增殖活性，实验设置6个重复。

1.7　细胞培养上清液中Exo的分离和鉴定

使用总Exo分离试剂分离原代DPSCs培养上清液中的Exo。采用Western blotting法测定Exo标志物白细胞分化抗原9（cluster of differentiation 9，CD9）、热激蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）和肿瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101， TSG101） 的蛋白表达水平^［14］。采用透射电镜观察并拍摄Exo形态表现。采用纳米粒径分析仪分析测定Exo尺寸分布和浓度。

1.8　实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法检测各组Exo中血管生成相关circRNAs表达水平

采用RNA纯化试剂盒提取Exo总RNA。采用TIANScript Ⅱ cDNA第一链合成试剂盒反转录合成cDNA。采用FastUniversal快速荧光定量PCR预混试剂（SYBR Green）进行RT-qPCR反应。扩增引物为circRNA124534上游引物：5'-TGAGCTTGTGA-GTGAGTGGT-3'，circRNA124534下游引物：5'- GCAAGGAGAATGGCGAGATG-3'。circ_信号诱导增殖相关基因1（signal-induced proliferation-associated 1 like 1，SIPA1L1）上游引物：5'-TGAAACTGG-ATGAACAAGGGAG-3'， circ_SIPA1L1下游引物：5'-GCCGTCTGTGCCAACAAC-3'。circ_0026827上游引物：5'-GCTGAAGAATTAAATC-3'，circ_0026827下游引物：5'-CGAAGTTCCGTCTACG-GC-3'。GAPDH上游引物：5'-CGGACCAATAC-GACCAAATCCG-3'，GAPDH下游引物：5'-AG-CCACATCGCTCAGACACC-3'。

1.9　Western blotting法检测共培养细胞上清中Exo标志物CD9、HSP70和TSG101蛋白表达水平

每皿6孔细胞培养板细胞培养物中加入1 mL含有蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物的RIPA裂解液裂解细胞。随后提取细胞总蛋白质。采用Bradford蛋白质定量试剂盒定量总蛋白质浓度。按照标准流程进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），随后采用半干转印法将PAGE上的总蛋白质电转印至PVDF膜上。使用5%脱脂奶粉对PVDF膜进行封闭。滴加一抗工作液，抗人p-p38 MAPK（1∶1 500）、VEGF-A（1∶2 000）、VEGFR2（1∶2 000）、Ang-1（1∶2 000）、SDF-1（1∶1 500）、MMP-9（1∶2 000）和GAPDH（1∶2 000）一抗，4 ℃下使其与PVDF膜共同孵育过夜。次日，滴加二抗工作液，山羊抗兔IgG二抗（1∶6 000），室温使其与PVDF膜共同孵育1 h。使用超敏ECL化学发光底物对目的条带进行显影。

1.10　各组细胞Exo摄取情况验证

采用IlluTINGO系列染料对Exo和细胞质膜进行染色。EvLINK染色标记Exo，CellLINK染色标记细胞质膜。采用倒置荧光显微镜观察并拍照Exo和细胞质膜，通过Merged图片观察Exo摄取至胞内的情况，2种染色标记存在共定位情况。具体实验操作委托北京云肽生物科技有限公司代为完成Exo摄取实验。

1.11　血管生成-诱导实验检测各组细胞上清液中Exo分离情况

6孔细胞培养板预包被一层Matrigel，将HUVECs单独培养于6孔细胞培养板中，加入EGM-2完全培养液（含生长因子）。Exo-OE vector组、Exo-circ_0026827 OE组和Exo-circRNA124534 OE组HUVECs细胞培养液中在诱导开始时，分别添加乳牙-源原代DPSCs转染了腺病毒介导的OE vector或circ_0026827 OE，或circRNA124534 OE后，分离获得100 µL细胞上清液Exo。将细胞置于37 ℃恒温湿润的CO₂孵育箱中连续诱导48 h，光学显微镜下镜检观察并拍照。

1.12　统计学分析

采用GraphPad v8软件进行统计学分析。计量数据包括各组原代DPSCs表面标志物CD44、CD34和Stro-1蛋白表达阳性率、细胞增殖活性、细胞中circRNAs表达水平和共培养细胞上清中Exo标志物CD9、HSP70和TSG101蛋白表达水平，均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，2组间样本均数比较采用独立样本t检验，组间样本均数两两比较采用事后Tukey’s检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　3种原代DPSCs表面标志物蛋白阳性表达情况

大部分细胞表面标志物表达情况为CD44（+）、CD34（-）和Stro-1（+），鉴定为原代DPSCs。见图1。

2.2　3种共培养体系中HUVECs增殖活性

与乳牙源-原代DPSCs组（1.78±0.18）比较，成人智齿源-原代DPSCs组（1.34±0.15）和老年人恒牙源-原代DPSCs组共培养的HUVECs增殖活性（0.92±0.11）明显降低（P<0.01）。与成人智齿源-原代DPSCs组比较，与老年人恒牙源-原代DPSCs组共培养的HUVECs增殖活性明显降低（P<0.01）。

2.3　3种共培养体系细胞培养上清液中Exo的分离和鉴定

3种共培养体系细胞培养上清液Exo中CD9、HSP70和TSG101均表达阳性。3种共培养体系中细胞上清液Exo粒径为50~110 nm。见图2。

2.4　各组Exo中血管生成相关circRNAs表达水平

与乳牙源-原代DPSCs组比较，成人智齿源-原代DPSCs组和老年人恒牙源-原代DPSCs组Exo中circRNA124534和circ_0026827 mRNA表达水平均明显降低（P<0.01）。与成人智齿源-原代DPSCs组 比 较，老 年 人 恒 牙 源-原 代 DPSCs 组 Exo 中circRNA124534和circ_0026827 mRNA表达水平均明显降低（P<0.01）。circ_SIPA1L1 mRNA表达水平组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.5　各组HUVECs中血管生成相关因子蛋白表达水平

与Exo-OE vector组比较，Exo-circ_0026827 OE组HUVECs中p-p38 MAPK、VEGF-A、VEGFR2、Ang-1、SDF-1和MMP-9蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）。与Exo-OE vector组比较，Exo-circRNA124534 OE组HUVECs中p-p38 MAPK、VEGF-A、VEGFR2、Ang-1、SDF-1和MMP-9蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）。见图3、表2和表3。

2.6　各组HUVECs对Exo摄取及HUVECs血管生成情况

各组HUVECs均成功摄取Exo。Exo-OE vector组HUVECs呈现较为平铺的生长状态。与Exo-OE vector组比较，Exo-circ_0026827 OE组和Exo-circRNA124534 OE组HUVECs呈现网状排列的生长状态， 并有排列成管状的趋势。见图4和5。

3 讨 论

DPSCs比骨髓间充质干细胞具有更高的克隆形成能力和增殖潜能。DPSCs很容易从拔出的牙齿中分离出来，包括乳牙或成人的智齿、恒牙等，以一种微创的方式获得，且无任何伦理问题。体内移植研究^［15］报道：DPSCs的在体多向分化潜能、有益的旁分泌功能和形成牙髓样结构的潜在能力。然而，DPSCs的存活、增殖和分化潜能受供体的年龄影响较大。从乳牙分离获得的DPSCs存活、增殖和分化潜能较强，而从老年人的恒牙或智齿中分离获得的DPSCs则较弱。多种circRNAs参与调节DPSCs的多向分化。circ_0026827作为miR-188-3p的海绵体上调苄氯素1（Beclin1）/Runt相关转录因子1（Runt-related transcription factor 1，RUNX1）信号通路促进DPSCs的成骨分化^［16］。circRNA124534通过miR-496/β连环蛋白（β-catenin）信号轴促进DPSCs向成骨分化^［17］。circ_SIPA1L1被报道通过miR-617/Smad家庭成员3（Smad family member 3，Smad3）轴促进DPSCs的成骨分化^［18］。因此，本研究中首先根据乳牙-源、成人智齿源-和老年人恒牙源-原代DPSCs与HUVECs的共培养体系中促进HUVECs增殖能力的差 异， 通 过 RT-qPCR 法 测 定 circ_0026827、circRNA124534和circ_SIPA1L1在上述3种来源原代DPSCs Exo中表达水平的差异，结果显示：与乳牙源-原代DPSCs共培养的HUVECs的增殖能力最高，且circ_0026827和circRNA124534在乳牙-源原代DPSCs中表达水平最高。因此，研究可在乳牙-源原代DPSCs的基础上过表达circ_0026827或circRNA124534探讨2种circRNAs对HUVECs血管生成能力的影响。

p38 MAPK被磷酸化激活后，通过p38 MAPK/VEGF-A/VEGFR2信号轴促进血管生成^［19］。在椎间盘融合过程中p38 MAPK信号通路促进成骨分化和血管生成^［20］。p38 MAPK信号通路促进人牙周韧带间充质干细胞的迁移和成骨细胞分化^［21］。在伤口愈合过程中叉头框蛋A1（forkhead box protein A1，FOXA1）/S100A8/p38 MAPK促进肉芽组织处血管新生^［22］。因此，p38 MAPK的活化是促进血管生成的重要信号通路之一。VEGFR2通过激活磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路促进HUVECs的血管生成过程^［23］。Ang-1和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管生成的中枢调节因子^［24］。低温可通过上调VEGF/Ang-1信号通路促进血管生成和糖尿病患者创面愈合^［25］。SDF-1/趋化因子CXC受体4（chemokine CXC receptor 4，CXCR4）轴在骨关节炎中介导软骨下骨异常成骨和血管生成^［26］。MMP-9和基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）是重要的基质金属蛋白酶，在血管生成过程中负责降解细胞外基质（extrace cellular matrix，ECM）的原有成分， 参与血管生成过程中的ECM成分重构^［27］。在子宫内膜损伤小鼠模型中，损伤的子宫内膜通过肿瘤坏死因子α （tumor necrosis factor-α， TNF-α） 和基质金属蛋白酶3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）增加MMP-9的表达和活化水平，促进血管生成^［28］。因此， 本研究检测的p-p38 MAPK、VEGF-A、VEGFR2、Ang-1、SDF-1和MMP-9蛋白表达上调与促血管生成过程密切相关。本研究结果显示：与Exo-OE vector组比较，Exo-circ_0026827 OE组和Exo-circRNA124534 OE组HUVECs呈现网状排列的生长状态，并有排列成管状的趋势，提示过表达circ_0026827和circRNA124534修饰乳牙DPSCs来源的Exo对HUVECs血管生成有一定促进作用^［29］。且Exo-circ_0026827 OE组和Exo-circRNA124534 OE组HUVECs内p-p38 MAPK、VEGF-A、VEGFR2、Ang-1、SDF-1和MMP-9蛋白表达水平升高，更加佐证了上述结论。

综上所述，circ_0026827和circRNA124534可能具有促进血管生成的活性。过表达circ_0026827和circRNA124534修饰的乳牙DPSCs来源的Exo对HUVECs中血管生成有一定促进作用，可能进一步用于增强HUVECs在促血管生成相关领域中的应用潜能。

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