甲型流感病毒PR8感染小鼠早期记忆T淋巴细胞的改变及其意义

Changes of early memory T lymphocytes in mice infected with influenza A virus PR8 and its significance

摘要

目的 探讨早期记忆T淋巴细胞（T_M）在甲型流感病毒（H1N1）PR8感染小鼠后的变化情况，并阐明其意义。 方法 将32只C57BL/6小鼠随机分为对照组和流感病毒（PR8）组，每组16只。对照组小鼠鼻滴30 μL无菌磷酸盐缓冲液（PBS），PR8组小鼠给予鼻滴2 LD₅₀ PR8病毒液。于第10天处死小鼠，收集支气管肺泡灌洗液（BALF）、肺组织和淋巴结用于后续实验。HE染色观察2组小鼠肺组织病理形态表现，血凝试验、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法和免疫荧光法检测小鼠肺组织病毒感染情况，流式细胞术检测2组小鼠BALF、肺组织和淋巴结中T淋巴细胞、效应性T淋巴细胞、中央型T_M淋巴细胞（T_CM）和效应性T_M淋巴细胞（T_EM）及核蛋白（NP）/聚合酶酸性蛋白（PA）特异性T_EM淋巴细胞百分率。 结果 与对照组比较，PR8组小鼠肺组织出现明显的病理损伤，且肺组织病毒效价和NP蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）。与对照组比较，PR8组小鼠BALF和肺组织中CD4⁺T淋巴细胞、CD8⁺T淋巴细胞、效应性CD4⁺T淋巴细胞、效应性CD8⁺T淋巴细胞、CD4⁺T_EM淋巴细胞和CD8⁺T_EM淋巴细胞百分率均明显升高（P<0.01）。与对照组比较，PR8组小鼠BALF和肺组织中CD4⁺T_CM、CD8⁺T_CM、CD4⁺T_EM、CD8⁺T_EM及NP/PA特异性CD4⁺T_EM和CD8⁺T_EM淋巴细胞百分率均明显升高（P<0.05或P<0.01），淋巴结中CD8⁺T_CM淋巴细胞百分率明显升高（P<0.05）。 结论 流感病毒感染可诱导机体T淋巴细胞增殖分化为效应性T淋巴细胞，在呼吸道黏膜局部早期建立保守表位NP/PA的特异性T_M淋巴细胞。

Abstract

Objective To discuss the changes of early memory T lymphocytes （T_M） in the mice infected with influenza A virus （H1N1） PR8， and to clarify its significance. Methods A total of 32 C57BL/6 mice were randomly divided into control group and influenza virus （PR8） group， with 16 mice in each group. The mice in control group were intranasally administered 30 μL of sterile phosphate buffered saline （PBS）， and the mice in PR8 group were intranasally administered 2 LD₅₀ PR8 virus solution. The mice were sacrificed on the 10 th day， and bronchoalveolar lavage fluid （BALF）， lung tissue， and lymphnodes were collected for subsequent experiments. HE staining was used to observe the pathomorphology of lung tissue in the mice in two groups； hemagglutination assay， real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） method， and immunofluorescence method were used to detect the viral infection in lung tissue of the mice； flow cytometry was used to detect the percentages of T lymphocytes， effector T lymphocytes， central memory T lymphocytes （T_CM）， effector memory T lymphocytes （T_EM）， and nuclear protein（NP）/pdymerase acidic protein（PA）-specific T_EM lymphocytes in BALF， lung tissue， and lymphnodes of the mice in two groups. Results Compared with control group， the lung tissue of the mice in PR8 group showed significant pathological damage， and the lung tissue virus titer and NP protein expression level were significantly increased （P<0.01）. Compared with control group， the percentages of CD4⁺ T lymphocytes， CD8⁺ T lymphocytes， effector CD4⁺ T lymphocytes， effector CD8⁺ T lymphocytes， CD4⁺ T_EM lymphocytes， and CD8⁺ T_EM lymphocytes in BALF and lung tissue of the mice in PR8 group were significantly increased （P<0.01）. Compared with control group， the positive percentages of CD4⁺ T_CM， CD8⁺ T_CM， CD4⁺ T_EM， CD8⁺ T_EM， and NP/PA-specific CD4⁺ T_EM， CD8⁺ T_EM lymphocytes in BALF and lung tissue of the mice in PR8 group were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）， and the percentage of CD8+ T_CM lymphocytes in the lymph nodes was significantly increased （P<0.05）. Conclusion Influenza virus infection can induce the proliferation and differentiation of T lymphocytes into effector T lymphocytes， leading to the early establishment of virus-specific T_M lymphocytes targeting the conserved NP/PA epitopes in the respiratory mucosa.

Graphical abstract

关键词

流感病毒 / 记忆T淋巴细胞 / 中央型记忆T淋巴细胞 / 效应型记忆T淋巴细胞 / 保守表位

Key words

Influenza virus / Memory T lymphocyte / Central memory T lymphocyte / Effector memory T lymphocyte / Conserved epitope

流行性感冒是由流感病毒引起的传染性强、传播速度快的急性呼吸道传染病，季节性流感导致每年300~500万重症病例和29~65万患者死亡^［1-2］。流感病毒通过抗原漂移和抗原转化导致中和抗体识别表位构象发生变化，使其能够逃避自然感染和传统疫苗接种引起的群体体液免疫^［3］。针对病毒亚型中高度保守的病毒蛋白区域血凝素（hemagglutinin， HA）、 神 经 氨 酸 酶（neuraminidase，NA）、 基 质 蛋 白 2 胞 外 域（extracellular domain of matrix protein 2，M2e）和核蛋白（nucleoprotein，NP）作为潜在靶抗原，研发通用疫苗对预防不同型流感病毒株及其引起的全球大流行意义重大^［4-5］。

记忆T淋巴细胞（memory T lymphocyte，T_M）提供长期保护、增强二次免疫应答效率、确保免疫反应特异性以及维护免疫系统平衡等多种作用，现已成为研发通用疫苗的关键靶标^［6-8］。T_M淋巴细胞分化的经典模式为初始的T淋巴细胞受抗原刺激分化为效应性T淋巴细胞后，约10%效应性T淋巴细胞分化为T_M淋巴细胞，T_M淋巴细胞谱系的建立需要约30 d^［9］。研究^［10-11］显示：在抗原刺激或接种疫苗情况下，初始CD4⁺T淋巴细胞能直接、快速且持续分化为长期效应性细胞和T_M淋巴细胞。研究^［12-13］表明：流感病毒初次感染4周，再次感染数周后，靶向识别流感病毒内部保守蛋白的T_M淋巴细胞比例明显升高，与多种流感病毒亚型发生交叉反应，提供异型保护作用。本研究检测流感病毒感染小鼠早期T_M淋巴细胞的变化情况，探讨流感病毒诱导的T_M淋巴细胞是否可以由初始T淋巴细胞直接分化，及T_M淋巴细胞在呼吸道黏膜早期抗感染免疫中的作用，为研发靶向T_M淋巴细胞的流感通用疫苗提供基础数据支持。

1 材料与方法

1.1　实验动物、流感病毒PR8、主要试剂和仪器

SPF级6~8周雌性C57BL/6小鼠由锦州医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（辽）2019-0003，实验动物使用许可证号：SYXK（辽）2019-0007，在锦州医科大学基础医学院病原学生物安全二级（ABSL-2）实验室进行饲养，本实验所有动物操作均经锦州医科大学动物伦理委员会批准，伦理号2022016。甲型流感病毒A/Puerto Rico/8/34（H1N1；PR8）由国家疾病预防控制中心传感所惠赠，经锦州医科大学基础医学院病原学实验室鸡胚传代增毒，-80 ℃保存。RNeasy小量提取试剂盒购自德国Qiagen公司，一步法SYBR^®PrimeScript™ 逆转录PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司， 多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质 复 合 物（peridinin-chlorophyll-protein complex，PerCP）- 花菁染料5.5（Cyanine5.5， Cy5.5）标记的CD8抗体、亮紫421（Brilliant violet 421，BV421）标 记 的 CD4 抗 体、异 硫 氰 酸 荧 光 素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的CD44抗体、别藻蓝蛋白（allophycocyanin，APC）标记的CD62L抗体和藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）抗体购自美国BioLegend公司，固定/渗透溶液、固定/渗透缓冲液、布雷非德菌素A、佛波醇酯和离子霉素购自美国BD公司，甲型流感病毒PR8株的NP第366~374位氨基酸（NP_366-374）和聚合酶酸性蛋白（polymerase acidic protein，PA）第224~233位氨基酸（PA_224-233）购自美国AnaSpec公司，胶原酶Ⅳ、Dnase酶和Percoll细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司， 实时荧光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-PCR）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。RT-qPCR仪（型号：QuantStudio 7 Flex）购自美国ABI公司，流式细胞分析仪（型号：FACS Canto Celesta）购自美国BD公司。

1.2　小鼠流感病毒PR8感染诱发急性肺损伤模型的制备和分组

将32只C57BL/6小鼠随机分为对照组和流感病毒（PR8）组，每组16只。对照组小鼠鼻滴30 μL无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），PR8组小鼠鼻滴2 LD₅₀ PR8病毒液。于感染后的第10天取材，每组各8只小鼠，处死后完整取出右肺，置于10%甲醛中固定，用于石蜡切片及HE染色。左肺分别置于含1 mL PBS缓冲液的EP管中，冰上匀浆后离心，上清用于血凝实验，并置于EP管中-80℃保存，用于RT-qPCR检测。无菌分离小鼠腋下及腹股沟淋巴结，置于含有3 mL PBS缓冲液平皿内，用于流式细胞术检测。每组各8只小鼠分离气管并插管，PBS缓冲液冲洗获得支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），离心后细胞沉淀，用于流式细胞术检测。所有操作需无菌、低温和快速。

1.3　HE染色观察2组小鼠肺组织病理形态表现

小鼠左肺经固定、脱水、透明、浸蜡和包埋后切成6 μm厚的切片，切片在65 ℃烤箱中烤2~4 h，常规HE染色，中性树胶封片。光学显微镜下观察肺组织病理形态表现关键指标：①组织间隙浸润。肺泡间隔、血管周围和支气管周围区域是否有中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞等炎性细胞的聚集。②肺实变情况：是否为充气的空腔结构，实变区域肺泡结构是否消失。③气管和细支气管上皮细胞坏死及炎性细胞浸润程度：气道上皮细胞是否排列整齐、完整，是否有细胞坏死、脱落及黏膜下层炎性细胞浸润。

1.4　血凝试验检测肺2组小鼠组织病毒滴度

小鼠肺组织匀浆后，离心后将上清液加入U型板孔中，依次做倍比稀释，稀释度为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024和1∶2 048。每孔加入50 μL 1%红细胞悬液，室温静置30 min，观察孔底红细胞形态表现。阳性结果（有血凝）：红细胞均匀铺于孔底，形成一层红色薄膜，边缘可能不整齐或呈锯齿状。阴性结果（无血凝）：红细胞未交联，沉降到孔底中心形成一个致密、边缘光滑的红色圆点。以能引起完全血凝的病毒样本的最高稀释度的倒数为血凝效价，血凝单位为每孔50 μL。血凝效价是病毒滴度的半定量指标。

1.5　RT-qPCR法检测2组小鼠肺组织流感病毒RNA水平

提取对照组和PR8组各8只小鼠肺组织中总RNA，采用SYBR荧光染料一步法进行RT-qPCR检测。引物序列：PR8 F 5'- GACCGAT-CCTGTCACCTCTGAC-3'，R 5'-AGGGCATTC-TGGACAAAGCGTCTA-3'。PCR反应条件： 42 ℃、5 min，95 ℃、10 s，95 ℃、3 s，60 ℃、30 s，共40个循环；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。使用标准品进行PCR扩增，记录Ct值，以Ct值为纵坐标，lg基因拷贝数为横坐标，绘制标准曲线。检测样本的病毒拷贝数（copy·mL^-1），应用标准曲线计算流感病毒RNA水平。

1.6　免疫荧光法检测2组小鼠肺组织中流感病毒NP蛋白表达水平

小鼠肺组织切片脱蜡和梯度乙醇脱水，抗原修复后，滴加一抗NP（1∶200），4 ℃过夜。PBS缓冲液洗涤，滴加FITC标记的荧光二抗，PBS缓冲液洗涤，在组织上滴加含DAPI的抗淬灭封片液封片，荧光显微镜下观察病毒感染水平，NP阳性信号为FITC标记的绿色荧光。采用Image J软件计算每张切片3个视野的绿色荧光像素数量，计算NP蛋白表达水平。NP蛋白表达水平=平均绿色荧光像素数量/实际组织总面积，单位为pixel/area。

1.7　小鼠BALF的制备

对照组和PR8组小鼠各8只，采用颈椎脱臼处死，暴露气管，用注射器吸取1 mL预冷PBS缓冲液，针头插入气管约1.5 cm，以1 mL PBS缓冲液反复抽吸3次冲洗肺部，将BALF转至离心管中，再重复灌洗2次。用吸管将3次收集的BALF分次通过200目无菌尼龙滤网，1 500 r·min^-1离心5 min，弃上清，加入1 mL预冷PBS缓冲液重悬细胞。

1.8　2组小鼠肺组织中淋巴细胞的提取

对照组和PR8组小鼠各8只，无菌分离小鼠肺组织，置于EP管内匀浆，用5 mL消化液将组织移至离心管中，37 ℃摇床90 min。用200目筛网过滤组织悬液，1 500 r·min^-1离心5 min，弃上清，1640培养基重悬后用25%Percoll分离淋巴细胞，1 500 r·min^-1离心5 min，弃上清，用1 mL PBS缓冲液重悬细胞沉淀，0.4%台盼蓝溶液染色后，细胞计数板计数，根据计数情况用PBS缓冲液将细胞密度调至每毫升1×10⁶个细胞。

1.9　2组小鼠淋巴结中淋巴细胞的提取

对照组和PR8组小鼠各8只，无菌分离鼠腹股沟和腋下淋巴结，玻片磨砂面研磨淋巴结，用200目筛网过滤悬液，1 500 r·min^-1离心5 min，弃上清，用2 mL PBS缓冲液重悬细胞沉淀，0.4%台盼蓝溶液染色后，细胞计数板计数，根据计数情况用PBS缓冲液将细胞密度调至每毫升1×10⁶个细胞。

1.10　流式细胞术检测2组小鼠淋巴细胞中CD4、CD8、CD44和CD62L阳性细胞百分率

将小鼠BALF、肺组织和淋巴结中提取的细胞悬液分至1.5 mL EP管中，每管中含1×10⁶个细胞，离心后重悬细胞，加入佛波醇酯20 μL、离子霉素8 μL、NP_366-374或PA_224-233 2 μL，混匀转移至96孔细胞培养板培养1 h，加入布雷非德菌素A每孔1 μL，培养4 h；收集96孔细胞培养板细胞，加入CD4、CD8、CD44和CD62L抗体各2 μL，孵育20 min；PBS缓冲液重悬细胞，离心；细胞沉淀加入100 μL固定或渗透溶液，孵育20 min；细胞洗涤后加入IFN-γ抗体4 μL，孵育20 min；细胞重悬用300目筛网过滤细胞，待上机。细胞阳性百分率以CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺/CD8⁺IFN-γ⁺、CD4⁺/CD8⁺CD44⁺CD62L^hi、CD4⁺/CD8⁺CD44⁺CD62L^lo和CD4⁺/CD8⁺CD44⁺ CD62L^loIFN-γ⁺细胞数/上机总细胞数的百分率表示。

1.11　统计学分析

采用 GraphPad Prism 9. 0软件进行统计学分析。2组小鼠肺组织中病毒滴度、NP蛋白表达水平、CD4⁺T淋巴细胞和CD8⁺ T淋巴细胞、效应性T淋巴细胞、CD4⁺/CD8⁺效应性T_M淋 巴 细 胞（effector T_M lymphocyte，T_EM）、CD4⁺/CD8⁺中 央 型 T_M 淋 巴 细 胞（central T_M lymphocyte，T_CM）、和NP/PA特异性CD4⁺T_M淋巴细胞百分率均符合正态分布，以x±s表示，2组间样本均数比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　2组小鼠肺组织大体形态和病理形态表现

对照组小鼠肺组织呈淡粉红色，质地柔软、表面光滑湿润，富有弹性且无实变感。PR8组小鼠肺组织发生明显病变，肺组织体积弥漫性肿大，表面颜色呈暗红色，有片状出血灶，肺实质质地变实，表面附有少量血性渗出物。见图1。HE染色结果显示：对照组肺泡结构清晰，形态规则，肺泡间隔薄而均匀，支气管上皮完整，肺内动、静脉血管结构正常，管壁厚度均匀，无增生、水肿或炎性细胞浸润。PR8组小鼠肺组织架构广泛破坏，可见多灶性至弥漫性实变区域，小支气管和细支气管受累显著，管壁黏膜层可见大量炎性细胞浸润，肺泡间隔因充血、水肿和炎性细胞浸润而呈弥漫性增生。见图2。

2.2　2组小鼠肺组织病毒感染情况

血凝试验检测结果显示：与对照组比较，PR8组流感病毒HA效价明显升高（P<0.01）。见图3。RT-qPCR法分析小鼠肺组织病毒感染情况，对照组小鼠无流感病毒感染，PR8病毒基因拷贝数为0，而PR8组病毒基因拷贝数为2.1×10⁴ copy·mL^-1。免疫荧光检测结果显示：与对照组（1.3×10² pixel/area）比较，PR8组小鼠肺组织中NP蛋白表达水平（6.9×10⁴ pixel/area）明显升高（P<0.01）。见图4。

2.3　2组小鼠淋巴细胞中CD4⁺T淋巴细胞和CD8⁺T淋巴细胞百分率

与对照组比较，PR8组小鼠BALF和肺组织淋巴细胞中CD4⁺T淋巴细胞和CD8⁺T淋巴细胞百分率明显升高（P<0.05或P<0.01）。与对照组比较，PR8组小鼠淋巴结中CD4⁺T淋巴细胞和CD8⁺T淋巴细胞百分率差异无统计学意义（P>0.05）。见图5和6。

2.4　2组小鼠淋巴细胞中效应性T细胞阳性百分率

与对照组比较，PR8组小鼠BALF和肺组织淋巴细胞中效应性CD4⁺T淋巴细胞和效应性CD8⁺T淋巴细胞百分率明显升高（P<0.01）。与对照组比较，PR8组小鼠淋巴结中效应性CD4⁺ T淋巴细胞和效应性CD8⁺T淋巴细胞百分率差异无统计学意义（P>0.05）。见图7和8。

2.5　2组小鼠淋巴细胞中T_M淋巴细胞阳性百分率

与对照组比较，PR8组小鼠BALF和肺组织淋巴细胞中CD4⁺T_EM和CD8⁺ T_EM淋巴细胞百分率均明显升高（P<0.01）。对照组比较，PR8组小鼠淋巴结中CD4⁺ T_EM和CD8⁺T_EM淋巴细胞百分率差异均无统计学意义（P>0.05）。与对照组比较，PR8组小鼠BALF和肺组织淋巴细胞中CD4⁺T_CM淋巴细胞、CD8⁺T_CM淋巴细胞及淋巴结淋巴细胞中CD8⁺T_CM淋巴细胞百分率均明显升高（P<0.05）。与对照组比较，PR8组小鼠淋巴结淋巴细胞中CD4⁺T_CM淋巴细胞百分率差异均无统计学意义（P>0.05）。见图9和10。

2.6　2组小鼠淋巴细胞中NP/PA特异性T_EM淋巴细胞阳性百分率

与对照组比较，PR8组BALF和肺组织淋巴细胞中CD4⁺T_EM淋巴细胞、CD8⁺T_EM淋巴细胞、NP/PA特异性CD4⁺T_EM淋巴细胞及CD8⁺T_EM淋巴细胞百分率明显升高（P<0.05或P<0.01）。见图11~14。

3 讨 论

近年研究^［14-15］表明：新型通用型疫苗更侧重于诱导针对病毒特异性的细胞免疫，而细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T cell，CTL）成为诱导交叉保护效应的核心环节。流感病毒内部NP、PA、聚合酶碱性蛋白1（polymerase basic protein 1，PB1）和聚合酶碱性蛋白2（polymerase basic protein 2，PB2）基因高度保守，经抗原提呈给T淋巴细胞后，分化的效应性T淋巴细胞对感染病毒的细胞进行针对性破坏，诱导广泛和持久的保护性免疫，降低疾病发生和流感病毒传播的可能性^［16-18］。本研究结果显示：流感病毒PR8感染后小鼠BALF和肺组织淋巴细胞中CD4⁺T淋巴细胞、CD8⁺T淋巴细胞、CD4⁺IFN-γ淋巴细胞和CD8⁺IFN-γ淋巴细胞百分率升高，提示机体感染病毒后诱导T淋巴细胞明显增殖，CD8⁺T淋巴细胞经历病毒抗原的识别、细胞活化和增殖过程，分化为CTL直接释放毒性物质诱导感染细胞的凋亡。CD4⁺T淋巴细胞分化为辅助性T淋巴细胞（T helper cell，Th），通过细胞因子诱导并促进CTL清除病毒感染的靶细胞。

机体受到病毒感染，免疫系统不仅通过活化的效应性细胞清除感染，同时向T_M淋巴细胞分化而建立起对病毒的长期免疫记忆。在呼吸道感染和黏膜免疫方面，呼吸道周围和肺部的T_M淋巴细胞尤为重要，其能提供快速、持久的局部免疫反应。CD8⁺T_M淋巴细胞通过产生IFN-γ、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）等细胞因子和细胞毒性分子快速清除病毒^［19］。CD4⁺ T_M淋巴细胞位于呼吸道周围以及肺部的特殊淋巴组织结构内，辅助CD8⁺T_M淋巴细胞的发育和抗体的产生^［20］。本研究结果显示：小鼠感染流感病毒后BALF和肺组织中CD4⁺T_EM/T_CM淋巴细胞、CD8⁺T_EM/T_CM淋巴细胞及淋巴结中CD8⁺T_CM淋巴细胞百分率升高，可见流感病毒经由呼吸道感染后诱发呼吸道周围和支气管相关淋巴组织内显著的黏膜免疫记忆。此外，在流感病毒感染的第10天小鼠BALF、肺组织和淋巴结中CD4⁺T_M及CD8⁺T_M淋巴细胞比例明显高于传统意义中约10%的效应性细胞群转化为T_M细胞，支持KEDZIERSKA等^［21］的观点，即在流感感染后，T_M淋巴细胞早期建立（感染第1周内），T_CM和T_EM淋巴细胞谱系从原发性抗原暴露时间开始即建成，而非传统意义的效应T淋巴细胞群约10%转化为T_M淋巴细胞。T_EM淋巴细胞检测结果显示：小鼠感染后效应性CD4⁺T_EM、CD8⁺T_EM及针对流感保守表位NP/PA的特异性CD4⁺T_EM、CD8⁺T_EM淋巴细胞百分率均升高。可见，小鼠感染PR8后产生针对于保守表位的特异性CD4⁺T_EM和CD8⁺T_EM淋巴细胞，对同型或异型流感感染具有交叉保护效应，有利于再次感染时高效清除流感病毒。

综上所述，流感病毒感染诱导机体T淋巴细胞增殖分化为效应性T淋巴细胞，启动T_M淋巴细胞和针对流感保守表位NP/PA特异性的T_M淋巴细胞在呼吸道黏膜局部早期建立，本研究结果为靶向T_M淋巴细胞的通用疫苗研发提供了数据支持。

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基金资助

辽宁省教育厅基本科研面上项目(LJKMZ20221239)

辽宁省科技厅联合计划面上项目(2025-MSLH-250)

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