盐酸小檗碱调控PI3K/AKT/mTOR信号通路对感染1型单纯疱疹病毒HeLa细胞自噬的影响

Effect of berberine hydrochloride on autophagy of HeLa cells infected with herpes simplex virus type 1 by regulating PI3K/AKT/mTOR signaling pathway

摘要

目的 探讨盐酸小檗碱（BBR）对1型单纯疱疹病毒（HSV-1）感染HeLa细胞自噬的影响，并阐明其相关机制。 方法 将处于对数生长期的HeLa细胞分别加入0、10、20、40、80、120和160 μmol·L^-1 BBR中培养24 h。另将HeLa细胞分为HSV-1组（感染HSV-1）、L-BBR组（感染HSV-1后，用20 μmol·L^-1 BBR处理24 h）、M-BBR组（感染HSV-1后，用40 μmol·L^-1 BBR处理24 h）、H-BBR组（感染HSV-1后，用80 μmol·L^-1 BBR处理24 h）和740 Y-P组（感染HSV-1后，用80 μmol·L^-1 BBR和10 μmol·L^-1 740 Y-P处理24 h），进行病毒感染及相应的药物处理。四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测检测不同浓度BBR处理HeLa细胞活性，空斑减数实验检测各组HeLa细胞中HSV-1增殖能力，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组Hela细胞中病毒复制相关基因mRNA表达水平，免疫荧光法检测各组Hela细胞中微管相关蛋白1轻链3（LC3）自噬小体形成情况，流式细胞术检测各组Hela细胞凋亡率，Western blotting法检测各组Hela细胞中自噬及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路相关蛋白表达水平。 结果 MTT法检测，与0 μmol·L^-1 BBR组比较，120和160 μmol·L^-1 BBR组HeLa细胞活性明显降低（P<0.05），对细胞具有一定毒性；选择20、40和80 μmol·L^-1 BBR进行后续实验。空斑减数实验检测，与HSV-1组比较，L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞中空斑形成单位（PFUs）明显减少（P<0.05），并呈剂量依赖性；与H-BBR组比较，740 Y-P组HeLa细胞中PFUs明显增加（P<0.05）。RT-qPCR法检测，与HSV-1组比较，L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组感染细胞蛋白0（ICP0）、感染细胞蛋白22（ICP22）、感染细胞蛋白8（ICP8）、胸苷激酶（TK）、糖蛋白B（gB）和糖蛋白D（gD）mRNA表达水平均明显降低（P<0.05），并呈剂量依赖性；与H-BBR组比较，740 Y-P组HeLa细胞中ICP0、ICP22、ICP8、TK、gB和gD mRNA表达水平均明显升高（P<0.05）。免疫荧光法检测，与HSV-1组比较，L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞中LC3自噬小体形成数量增加；与H-BBR组比较，740 Y-P组HeLa细胞中LC3自噬小体形成数量减少。流式细胞术检测，与HSV-1组比较，L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞凋亡率明显升高（P<0.05），并呈剂量依赖性；与H-BBR组比较，740 Y-P组HeLa细胞凋亡率明显降低（P<0.05）。Western blotting法检测，与HSV-1组比较，L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞中苄氯素1（Beclin-1）及B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）/腺病毒E1B 19kDa蛋白相互作用蛋白（BNIP）蛋白表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显升高（P<0.05），并呈剂量依赖性；与H-BBR组比较，740 Y-P组HeLa细胞中Beclin-1和BNIP蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显降低（P<0.05）；与HSV-1组比较，L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）和Bcl-2相关X蛋白（Bax）蛋白表达水平均明显升高（P<0.05），Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P<0.05），并呈剂量依赖性；与H-BBR组比较，740 Y-P组HeLa细胞中Caspase-1、Caspase-3和Bax蛋白表达水平明显降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；与HSV-1组比较，L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞中磷酸化PI3K（p-PI3K）/PI3K、磷酸化AKT（p-AKT）/AKT和磷酸化mTOR（p-mTOR）/mTOR比值均明显降低（P<0.05），并呈剂量依赖性；与H-BBR组比较，740 Y-P组HeLa细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值均明显升高（P<0.05）。 结论 BBR能够促进HSV-1病毒感染HeLa细胞的自噬过程，诱导自噬依赖性凋亡，并显著抑制病毒的复制，其作用机制与调控PI3K/AKT/mTOR通路有关。

Abstract

Objective To discuss the effect of berberine hydrochloride （BBR） on autophagy in the HeLa cells infected with herpes simplex virus type 1 （HSV-1）， and to clarify its related mechanism. Methods The HeLa cells at logarithmic growth phase were added with 0， 10， 20， 40， 80， 120， and 160 μmol·L^-1 BBR， respectively， and cultured for 24 h. In addition， the HeLa cells were divided into HSV-1 group （the cells were infected with HSV-1）， L-BBR group （were infected with HSV-1 and then treated with 20 μmol·L^-1 BBR for 24 h）， M-BBR group （were infected with HSV-1 and then treated with 40 μmol·L^-1 BBR for 24 h）， H-BBR group （were infected with HSV-1 and then treated with 80 μmol·L^-1 BBR for 24 h）， and 740 Y-P group （were infected with HSV-1 and then treated with 80 μmol·L^-1 BBR and 10 μmol·L^-1 740 Y-P for 24 h） for viral infection and corresponding drug treatment. MTT method was used to detect the activities of microtubule-associated protein 1 light chain 3 （LC3） the HeLa cells after treated with different concentrations of BBR； plaque reduction assay was used to detect the proliferation ability of HSV-1 in the HeLa cells in various groups； real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） method was used to detect the mRNA expression levels of virus replication-related genes in the HeLa cells in various groups； immunofluorescence method was used to detect the formation of autophagosomes in the HeLa cells in various groups； flow cytometry was used to detect the apoptotic rate of the HeLa cells in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of autophagy and the phosphoinositide 3-kinase （PI3K）/protein kinase B（AKT）/mammalian target of rapamycin （mTOR） pathway pathway-related proteins in the HeLa cells in various groups. Results The MTT method results showed that compared with 0 μmol·L^-1 BBR group， the activities of the HeLa cells in 120 and 160 μmol·L^-1 BBR groups were significantly decreased （P<0.05）， which had certain toxicity to the cells； 20， 40， and 80 μmol·L^-1 BBR were selected for subsequent experiments. The plaque reduction assay results showed that compared with HSV-1 group， the plaque forming units（PFUs） in the HeLa cells in L-BBR group， M-BBR group， and H-BBR group were significantly decreased （P<0.05） in a dose-dependent manner； compared with H-BBR group， the PFUs in the HeLa cells in 740 Y-P group were significantly increased （P<0.05）. The RT-qPCR results showed that compared with HSV-1 group， the mRNA expression levels of infected cell protein 0 （ICP0）， infected cell protein 22 （ICP22）， infected cell protein 8 （ICP8）， thymidine kinase （TK）， glycoprotein B （gB）， and glycoprotein D （gD） in the HeLa cells in L-BBR group， M-BBR group， and H-BBR group were significantly decreased （P<0.05） in a dose-dependent manner； compared with H-BBR group， the expression levels of ICP0， ICP22， ICP8， TK， gB， and gD mRNA in the HeLa cells in 740 Y-P group were significantly increased （P<0.05）. The immunofluorescence method results showed that compared with HSV-1 group， the number of LC3 autophagosomes formed in the HeLa cells in L-BBR group， M-BBR group， and H-BBR group was increased； compared with H-BBR group， the number of LC3 autophagosomes formed in the HeLa cells in 740 Y-P group was decreased. The flow cytometry results showed that compared with HSV-1 group， the apoptotic rates of the HeLa cells in L-BBR group， M-BBR group， and H-BBR group were significantly increased （P<0.05） in a dose-dependent manner； compared with H-BBR group， the apoptotic rate of the HeLa cells in 740 Y-P group was significantly decreased （P<0.05）. The Western blotting method results showed that compared with HSV-1 group， the expression levels of Beclin-1 and B-cell lymphoma 2 （Bcl-2）/adenovirus E1B 19kDa protein interacting protein protein（BNIP） 2 proteins and the ratios of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ in the HeLa cells in L-BBR group， M-BBR group， and H-BBR group were significantly increased （P<0.05） in a dose-dependent manner； compared with H-BBR group， the expression levels of Beclin-1 and BNIP proteins and the LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ ratio in the HeLa cells in 740 Y-P group were significantly decreased （P<0.05）； compared with HSV-1 group， the expression levels of cysteine-containing aspartate protein hydrolase 1 （Caspase-1）， cysteine-containing aspartate protein hydrolase 3 （Caspase-3）， and Bcl-2 associated X protein （Bax） proteins in the HeLa cells in L-BBR group， M-BBR group， and H-BBR group were significantly increased （P<0.05）， and the expression level of Bcl-2 protein was significantly decreased （P<0.05） in a dose-dependent manner； compared with H-BBR group， the expression levels of Caspase-1， Caspase-3， and Bax proteins in the HeLa cells in 740 Y-P group were significantly decreased （P<0.05）， and the expression level of Bcl-2 protein was significantly increased （P<0.05）； compared with HSV-1 group， the ratios of phosphorylated PI3K （p-PI3K）/PI3K， phosphorylated AKT（p-AKT）/AKT， and phosphorylated mTOR （p-mTOR）/mTOR in the HeLa cells in L-BBR group， M-BBR group， and H-BBR group were significantly decreased （P<0.05） in a dose-dependent manner； compared with H-BBR group， the ratios of p-PI3K/PI3K， p-Akt/Akt， and p-mTOR/mTOR in the HeLa cells in 740 Y-P group were significantly increased （P<0.05）. Conclusion BBR can promote the autophagy process in the HeLa cells infected with HSV-1 by regulating the PI3K/AKT/mTOR pathway， induce autophagy-dependent apoptosis， and significantly inhibit the virus replication.

Graphical abstract

关键词

盐酸小檗碱 / 磷脂酰肌醇3-激酶 / 蛋白激酶B / 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路 / 1型单纯疱疹病毒 / 自噬

Key words

Berberine hydrochloride / Phosphatidylinositol 3-kinase / Protein kinase B / Mammalian target of rapamycin pathway / Herpes simplex virus type 1 / Autophagy

1型单纯疱疹病毒 （herpes simplex virus type 1，HSV-1）是一种专门感染人类的嗜神经双链DNA病毒，属于α疱疹病毒家族，在上皮细胞中复制，并能在神经元中潜伏终身^［1］。在全球范围内，HSV-1具有高感染率，50%~90%的人口HSV-1血清检测呈阳性^［2-3］。HSV-1主要通过黏膜或皮肤侵入宿主，引发除生殖器以外的皮肤、黏膜（如口腔黏膜）及器官（如脑部）的感染。一旦进入体内，病毒会潜伏于感觉神经末梢和神经节，形成难以治愈的终身潜伏状态^［4］。HSV-1感染的症状通常表现为唇疱疹和皮肤水泡，也可能导致严重的并发症，如病毒性角膜炎、病毒性脑炎和癌症，甚至死亡^［5］。鉴于其潜在的严重后果，研发新型高效的抗病毒药物显得尤为重要。小檗碱（berberine，BBR）是多种植物次生代谢的产物，广泛存在于中草药根、根茎、茎皮及小檗属植物中，具有抗病毒和抗癌等多种生物活性^［6］。在临床前研究中，BBR可通过靶向疱疹病毒生命周期的多个阶段引起抗疱疹病毒作用的机制和途径^［7］，但其抗HSV-1病毒的具体机制尚未完全明确。因此，本研究利用BBR对感染HSV-1病毒的HeLa细胞进行干预，以初步探讨其抗病毒潜在的分子机制。

1 材料与方法

1.1　细胞、病毒、主要试剂和仪器

人子宫颈癌细胞株HeLa购自武汉普诺赛生命科技有限公司。HSV-1 F株购自武汉大学医学院病毒学研究所。BBR（纯度>97%）和四甲基偶氮唑盐 ［3-（4，5- Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，胰蛋白酶、牛血清白蛋白、RPMI 1640培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和RIPA裂解液均购于美国Promega公司，逆转录试剂盒购自上海碧云天生物有限公司，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）激活剂740 Y-P购自于上海麦克林生化科技股份有限公司，TRIzol、SYBR green PCR Mix、兔抗B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）/腺病毒E1B 19kDa蛋白相互作用蛋白（Bcl-2/adenovirus E1B 19kDa protein-interacting protein， BNIP） 2抗体、 兔抗蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）抗体、兔抗磷酸化AKT（phosphorylated AKT，p-AKT）抗体、兔抗哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抗体和兔抗磷酸化mTOR（phosphorylated mTOR，p-mTOR）抗体购自美国Thermo Fisher Scientific公司，兔抗微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）-Ⅱ抗体、兔抗LC3-Ⅰ抗体、 兔抗苄氯素1 （Beclin-1）抗体、兔抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1， Caspase-1）抗体、兔抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）抗体、兔抗Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax） 抗体、兔抗Bcl-2抗体、兔抗PI3K抗体，兔抗磷酸化PI3K （phosphorylated PI3K，p-PI3K）抗体和甘油醛3磷酸脱氢酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）购自美国Abcam公司。TGL-16MS型高台式速离心机购自上海卢湘仪离心机仪器有限公司，光学显微镜购自日本Nikon公司，细胞培养箱购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2　细胞培养和分组处理

在暗室条件下，将1.6 mg BBR与20 μL DMSO溶剂混合均匀，随后加入980 mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），定容至1 000 mL，再次充分混匀以制备母液。此过程中，确保二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的浓度维持在0.1%以下。将配置好的药物进行分装，并储存于-20 ℃的避光环境中。将HeLa细胞接种于含10% FBS和1%青-链霉素的RPIMI 1640培养基中，于37 ℃，5%CO₂环境中进行常规培养。随后将处于对数生长期的细胞以每孔1×10⁵个细胞的密度接种于6孔细胞培养板中，将培养好的细胞分别加入不同浓度（0、10、20、40、80、120和160 μmol·L^-1）BBR培养24 h，每个浓度设3个复孔，用于检测BBR对HeLa细胞活性的影响。另将细胞随机分为HSV-1组（感 染 HSV-1）、 L-BBR 组（感 染 HSV-1 后，用20 μmol·L^-1 BBR 处 理 24 h）、 M-BBR 组（感 染HSV-1 后， 用 40 μmol·L^-1 BBR 处 理 24 h）、H-BBR组（感染HSV-1后，用80 μmol·L^-1 BBR处 理 24 h）和 740 Y-P 组（感 染 HSV-1 后， 用80 μmol·L^-1 BBR和10 μmol·L^-1 740 Y-P处理24 h），HeLa细胞接种于12孔细胞培养板中，形成单层后，在37 ℃条件下感染HSV-1病毒，多重感染复数（multiplicity of infection，MOI）=1.5。感染2 h后，移除病毒接种物。加入相应的药物培养液于37 ℃、5% CO₂培养24 h，每组设3个复孔，用于检测BBR对HSV-1病毒感染HeLa细胞的影响。药物剂量和MOI参考文献［8-9］。

1.3　MTT法检测不同浓度BBR处理HeLa细胞活性

将处于对数生长期的HeLa细胞接种于96孔细胞培养板中，培养24 h。随后去除原有培养基，分别加入分别含0、20、40、80、120和160 μmol·L^-1 BBR的培养液，于37 ℃、5% CO₂环境下进行孵育72 h，弃上清，每孔加10 μL MTT（0.5 g·L^-1）孵育2~4 h。吸弃上清，加入100 μL DMSO溶解结晶，于波长490 nm处测定吸光度（A）值，以A值代表细胞活性。

1.4　空斑减数实验检测各组HeLa细胞中HSV-1增殖能力

根据文献［10］中的方法，将HeLa细胞于37 ℃条件下感染HSV-1病毒2 h后，移除病毒接种物。向每孔中加入1 mL甲基纤维素覆盖层，该覆盖层由2%甲基纤维素与2倍最终测试浓度的相应药物组成。于37 ℃、5% CO₂的条件下，将细胞孵育72 h。使用4%多聚甲醛固定细胞。固定后，用1%结晶紫对细胞进行染色，在显微镜下观察染色后的细胞层，识别由单个病毒感染细胞形成的空斑。结晶紫将细胞核染成紫色，而无细胞的部分则为透明。进行空斑计数。根据空斑数和病毒稀释度计算病毒滴度，结果以每毫升病毒样品的空斑形成单位（plaque formilg uints，PFUs）表示。PFUs=（X1+X2+…+Xn）×d/（n×v）。X1、X2、Xn代表同一稀释梯度下不同培养孔中所观察到的空斑数目，n代表参与计数的培养孔总数，v表示病毒量（mL），d表示病毒的稀释倍数。PFUs数值越高表示病毒增殖能力越强。

1.5　实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法检测各组HeLa细胞中感染细胞蛋白0（infected cell protein 0，ICP0）、感染细胞蛋白22（infected cell protein 22，ICP22）、感染细胞蛋白8（infected cell protein 8，ICP8）、胸苷激酶（thymidine kinase、TK）、糖蛋白B（glycoprotein B，gB）和糖蛋白D（glycoprotein D，gD） mRNA表达水平

取各组细胞，使用TRIzol试剂提取总RNA，依据逆转录试剂盒说明书将其逆转录为cDNA。采用RT-qPCR仪进行RT-qPCR实验。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s、60 ℃退火延伸30 s，40个循环，采用2^-△△Ct法计算各组细胞中ICP0、ICP22、ICP8、TK、gB及gD mRNA表达水平。引物序列见表1。

1.6　免疫荧光法检测各组HeLa细胞中LC3自噬小体形成情况

将HeLa细胞接种至6孔细胞培养板中， 采用含有人绿色荧光蛋白 （green fluorescent protein， GFP）-单体红色荧光蛋白 （monomeric red fluorescent protein，mRFP）-LC3腺病毒转染24 h，PBS缓冲溶液洗涤后，荧光显微镜对LC3自噬小体进行成像。GFP-mRFP-LC3标记的自噬小体表现为红色荧光。

1.7　流式细胞术检测各组HeLa细胞凋亡率

PBS缓冲液洗涤各组HeLa细胞样本，4 ℃离心收集细胞样本，重悬细胞于结合缓冲液，加入膜联蛋白V-FITC（5 μL）和PI（5 μL），室温避光孵育15 min，流式细胞术检测荧光信号。统计右下象限细胞百分率，即为细胞凋亡率。

1.8　Western blotting法检测各组HeLa细胞中自噬、凋亡和PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达水平

于RIPA缓冲液（含蛋白酶抑制剂）中收集各组HeLa细胞。随后，将裂解液于4 ℃条件下以12 000 r·min^-1离心15 min，以去除不溶性的细胞组分。采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。通过12% SDS-PAGE电泳，从每个样品中分离出20 μg蛋白质，并将其转移至PVDF膜上。将膜置于含有0.05% Tween-20的TBST缓冲盐溶液及5%脱脂牛奶中，于室温下孵育2 h封闭。膜与一抗BNIP2（1∶1 000）、AKT（1∶1 000）、p-AKT（1∶1 000）、mTOR（1∶1 000）、p-mTOR（1∶1 000）、LC3-Ⅱ（1∶1 000）、 LC3-Ⅰ（1∶1 000）、 Beclin-1（1∶1 000）、Caspase-1（1∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、PI3K（1∶1 000）、p-PI3K（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）于4 ℃条件下共同孵育过夜。加入相应HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶5 000），于室温孵育2 h。采用增强化学发光法对膜进行可视化处理，化学发光成像系统Amersham Imager 600采集图像。采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.9　统计学分析

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。Hela细胞活性、各组HeLa细胞中PFUs、细胞中ICP0、ICP22、ICP8、TK、gB和gD mRNA表达水平、HeLa细胞凋亡率、自噬和凋亡及PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　各组HeLa细胞活性

与0 μmol·L^-1 BBR组比较，10、20、40和80 μmol·L^-1 BBR组HeLa细胞活性差异无统计学意义（P>0.05），120和160 μmol·L^-1 BBR组HeLa细胞活性明显降低（P<0.05），表明其对细胞具有一定毒性。见图1。因此选择20、40和80 μmol·L^-1 BBR进行后续实验。

2.2　各组HeLa细胞中PFUs

与HSV-1组比较，L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞中PFUs明显降低（P<0.05），并呈剂量依赖性。与H-BBR组比较，740 Y-P组HeLa细胞中PFUs明显升高（P<0.05）。见图2。

2.3　各组HeLa细胞中ICP0、ICP22、ICP8、TK、gB和gD mRNA表达水平

与HSV-1组比较，L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞中ICP0、ICP22、ICP8、TK、gB和gD mRNA表达水平均明显降低（P<0.05），并呈剂量依赖性。与H-BBR组比较，740 Y-P组HeLa细胞中ICP0、ICP22、ICP8、TK、gB和gD mRNA表达水平均明显升高（P<0.05）。见表2。

2.4　各组HeLa细胞中LC3自噬小体形成情况

与HSV-1组比较，L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞中LC3自噬小体形成数量增加。与H-BBR组比较，740 Y-P组HeLa细胞中LC3自噬小体形成数量减少。见图3。

2.5　各组HeLa细胞凋亡率

与HSV-1组比较，L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa凋亡率明显升高（P<0.05），并呈剂量依赖性。与H-BBR组比较，740 Y-P组HeLa凋亡率明显降低（P<0.05）。见图4和表3。

2.6　各组HeLa细胞中Beclin-1和BNIP蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值

与HSV-1组比较，L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞中Beclin-1及BNIP蛋白表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显升高（P<0.05），并呈剂量依赖性。与H-BBR组比较，740 Y-P组HeLa细胞中Beclin-1和BNIP蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显降低（P<0.05）。见图5和表4。

2.7　各组HeLa细胞中Caspase-1、Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达水平

与HSV-1组比较，L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞中Caspase-1、Caspase-3和Bax蛋白表达水平均明显升高（P<0.05），Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P<0.05），并呈剂量依赖性；与H-BBR组比较，740 Y-P组HeLa细胞中Caspase-1、Caspase-3和Bax蛋白表达水平明显降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。见图6和表5。

2.8　各组HeLa细胞中p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR和mTOR蛋白表达水平

与HSV-1组比较，L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值均明显降低（P<0.05），并呈剂量依赖性。与H-BBR组比较，740 Y-P组HeLa细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值均明显升高（P<0.05）。见图7和表6。

3 讨 论

疱疹病毒采用“逃逸与隐匿”策略进行感染，当免疫系统因生理或环境因素受损时，这些感染便可能引发严重并发症^［11］。美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administra-tion，FDA）批准的治疗该疾病的药物主要包括核苷类似物，如阿昔洛韦、喷昔洛韦和伐昔洛韦，其通过靶向病毒DNA聚合酶以防止病毒复制^［9］，但其无法根治疾病或预防复发，在某些情况下还会加剧由病毒感染引发细胞损伤，长期使用还可能引发耐药性问题^［12-13］。因此，开发具有不同于核苷类似物活性机制的新型抗单纯疱疹病毒（herpes simple virus，HSV）药物具有重要意义。近年来，大多数药物发现策略依赖于天然产物，尤其是植物，常作为新候选药物相对安全且丰富的来源。本研究结果显示：BBR处理后，HeLa细胞中PFUs明显降低，并呈剂量依赖性，与既往关于BBR具有多种生物活性的报道^［7］相符。研究^［14-15］发现：BBR具有抑制HSV感染的潜力，如通过调节核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）/c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）途径抑制HSV-1复制及抑制病毒复制周期中的吸附和渗透阶段。本研究深入探讨了BBR对HSV-1基因表达的影响。HSV-1的转录调控分为即刻早期、早期和晚期基因^［16］阶段，其中即刻早期基因在病毒进入和衣壳分解后首先表达，进而调控早期和晚期病毒基因的表达。本研究结果显示：BBR明显抑制了HSV-1的即刻早期基因（ICP0和ICP22）、早期基因（ICP8和TK）以及晚期基因（gB和gD）的表达^［9］。与既往关于BBR通过调控Ⅰ型干扰素刺激展现抗病毒特性的研究^［17］一致，进一步证实了BBR在抗病毒方面的广泛作用机制。

自噬作为细胞稳态维持的关键机制，是一种高度保守且至关重要的细胞内物质循环和降解过程，其核心在于自噬体的形成，这些自噬体能够包裹待降解物质并与溶酶体融合，从而实现物质的循环利用。自噬不仅扮演着细胞自我清理的角色，清除无用或有害的细胞成分，也是对抗病原体如细菌和病毒的重要防御手段，这一过程被称为异种自噬，以区别于细胞对自身成分的降解^［18］。既往研究^［19］已经揭示了HSV-1病毒具有破坏自噬激活、降解及抗原呈递的能力，从而导致自噬功能障碍。HSV-1感染会导致评价自噬水平的标志蛋白Beclin-1和BNIP蛋白表达水平降低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，自噬小体数量减少，即自噬也在抵御HSV-1感染中发挥着重要作用。HSV-1病毒的ICP34.5蛋白作为一种自噬抑制因子，通过与Beclin-1结合，干扰自噬的正常执行，从而增强病毒的复制能力和感染效率。相反，高水平的自噬则能够保护宿主细胞免受HSV-1的感染^［19］。这一发现得到了其他研究的支持，如AHMAD等^［20］研究发现：自噬通过促进受感染细胞的存活，降解病毒颗粒和过量或缺陷的蛋白，并激活适应性免疫反应，从而在HSV-1感染中发挥保护作用。另一项研究^［21］也发现：促进自噬小体成熟为自噬-溶酶体，可以加速HSV-1病毒及其复制所必需的细胞成分的降解，进而抑制HSV-1的感染。本研究在此基础上，进一步探讨了BBR对HSV-1感染HeLa细胞后自噬水平的影响，结果显示：BBR干预后，HSV-1感染HeLa细胞中Beclin-1和BNIP蛋白表达水平明显升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显升高，自噬小体形成增加。提示BBR可能通过促进自噬过程来增强细胞对HSV-1病毒的防御能力。自噬在HSV-1感染中具有保护作用，BBR可以作为潜在抗HSV-1药物候选者。

自噬和细胞凋亡共同构成了细胞稳态调节的关键机制，两者间的相互作用复杂且精细，其中线粒体自噬与细胞凋亡的交互尤为关键，这一过程受到包括Bcl-2和Bax在内的多种分子的精细调控。已知自噬过程中产生的Beclin-1蛋白，其BH3结构域能够与Bcl-2特异性结合，从而调控细胞凋亡通路，诱导自噬依赖性凋亡^［22］。细胞凋亡不仅维持细胞群体平衡，还是宿主防御机制的一部分，能限制病原体在内部应激或细菌感染时的复制和传播。HSV-1病毒具有干扰凋亡信号的能力，能在多个层面阻止感染细胞进入凋亡状态。研究^［23］表明：通过提升HSV-1感染细胞的凋亡水平，可以有效降低其感染率和繁殖能力。本研究结果显示：经BBR干预后，HSV-1感染的HeLa细胞中Caspase-1、Caspase-3和Bax蛋白表达水平明显升高，Bcl-2蛋白表达水平明显降低。同时，流式细胞术检测结果显示：经BBR干预后，HSV-1感染的HeLa细胞凋亡率明显升高。这些发现不仅与既往关于HSV-1干扰凋亡信号的研究^［23］结果一致，而且进一步验证了BBR可能通过促进细胞凋亡来发挥抗HSV-1病毒的作用。

PI3K/AKT/mTOR是调控许多重要生物活性的关键信号通路。病毒通过操纵这一通路能够显著增强其复制、转录及翻译能力，并促进病毒的入侵、复制、潜伏及激活^［24］。在HSV-1感染的背景下，PI3K/AKT信号通路调节对HSV-1在宿主细胞内复制非常重要^［25-26］。BBR作为一种具有广泛生物活性的化合物，已被证实是PI3K/AKT/mTOR信号通路的有效调节剂，并在多种癌症治疗中显示出显著的疗效^［27-28］。尽管BBR在调节PI3K/AKT/mTOR信号通路方面展现出显著的效果，但其在HSV-1病毒感染中的作用尚未得到明确证实。因此，在本研究检测了PI3K/AKT/mTOR相关通路的表达情况，结果显示：经BBR干预后，Hela细胞的p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值明显降低，并呈剂量依赖性。提示BBR可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥抗病毒作用。本研究使用PI3K激活剂处理经BBR干预的HSV-1感染细胞，结果显示：Beclin-1、BNIP、Caspase-1和Caspase-3蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显降低，而PFUs、复制相关蛋白和Bcl-2蛋白表达水平明显升高。进一步证实了BBR通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路来发挥抗HSV-1病毒的作用。

综上所述，BBR能够通过调控PI3K/AKT/mTOR通路促进HSV-1病毒感染HeLa细胞的自噬过程，诱导自噬依赖性凋亡，并显著抑制病毒的复制。本研究结果为BBR在抗病毒和细胞自噬调控领域的探讨提供了新的理论依据，为开发新型抗病毒药物提供了潜在的靶点。

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