miR-125a-5p在结核分枝杆菌潜伏感染患者外周血单个核细胞中的表达及其意义

Expression of miR-125a-5p in peripheral blood mononuclear cells of patients with latent mycobacterium tuberculosis infection and its significance

摘要

目的 探讨微小RNA（miR）-125a-5p在感染结核分枝杆菌（MTB）患者外周血单个核细胞（PMBCs）中表达的差异及其对巨噬细胞CD80和CD206蛋白表达的影响，并阐明其临床意义。 方法 选择2022年7月—2023年6月就诊、经临床确诊的活动性结核病（ATB）感染者40例（ATB组），结核分枝杆菌潜伏感染（LTBI）患者35例（LTBI组）和健康体检者40名（对照组），禁食12 h后次日清晨分别采集3组研究对象空腹血样本，分离血清，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测各组研究对象血清中炎症因子水平，同时提取各组PBMCs，采用流式细胞术检测各组研究对象PBMCs中CD80和CD206蛋白表达水平，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组研究对象PBMCs中miR-125a-5p和白细胞介素6（IL-6）mRNA表达水平。 结果 3组研究对象年龄一般资料比较差异均无统计学意义（P>0.05）。与对照组比较，ATB组和LTBI组患者血清中血沉（ESR）、单核细胞（MONO）百分比、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素10（IL-10）水平均明显升高（P<0.05），淋巴细胞（LY）百分比明显降低（P<0.05）；与ATB组比较，LTBI组患者血清中ESR和IL-10水平均明显降低（P<0.05），LY百分比明显升高（P<0.05）；白细胞（WBC）计数组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。流式细胞术检测，与对照组比较，ATB组和LTBI组患者PBMCs中CD80和CD206蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；与ATB组比较，LTBI组患者PBMCs中CD206蛋白表达水平明显升高（P<0.05），CD80蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。RT-qPCR法检测，与对照组比较，ATB组和LTBI组患者PBMCs中miR-125a-5p和IL-6 mRNA表达水平均明显升高（P<0.05）；与ATB组比较，LTBI组患者PBMCs中miR-125a-5p和IL-6 mRNA表达水平均明显升高（P<0.05）。相关性分析，miR-125a-5p表达水平与TNF-α水平和IL-6 mRNA表达水平呈正相关关系（r=0.406，P<0.05；r=0.351，P<0.05），与IL-10水平呈负相关关系（r=－0.368，P<0.05）。miR-125a-5p表达水平诊断LTBI患者的受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）值为0.89（P<0.01），灵敏度为0.85，特异度为0.88。 结论 miR-125a-5p在LTBI组患者PBMCs中表达水平明显升高，其可影响巨噬细胞向M1极化，促进巨噬细胞炎症反应过程，参与肺结核的发生发展。

Abstract

Objective To discuss the differential expression of microRNA（miR）-125a-5p in peripheral blood mononuclear cells （PBMCs） of the patients with mycobacterium tuberculosis （MTB） infection and its effect on macrophage polarization， and to clarify its clinical significance. Methods A total of 40 patients with active tuberculosis （ATB） （ATB group）， 35 patients with latent tuberculosis infection （LTBI） （LTBI group）， and 40 healthy physical examinees （control group） clinically diagnosed from July 2022 to June 2023 were selected. The fasting blood samples of the subjects in three groups were collected next morning after 12 h of fasting， and then serum was separated. Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） method was used to detect the levels of inflammatory factors in the serum of the subjects in various groups. Simultaneously， the PBMCs were extracted from the subjects in various groups； flow cytometry was used to detect the expression levels of CD80 and CD206 proteins in the PBMCs of the subjects in various groups； real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） method was used to detect the expression levels of microRNA （miR）-125a-5p and interleukin-6 （IL-6） mRNA in PBMCs of the subjects in various groups. Results There were no statistically significant differences in the general information of the subjects among three groups （P>0.05）. Compared with control group， the erythrocyte sedimentation rate （ESR）， percentages of monocytes （MONO）， tumor necrosis factor-α （TNF-α） levels， and interleukin-10 （IL-10） levels in serum of the patients in ATB group and LTBI group were significantly increased （P<0.05）， and the percentages of lymphocytes （LY） were significantly decreased （P<0.05）； compared with ATB group， the ESR and level of IL-10 in serum of the patients in LTBI group were significantly decreased （P<0.05）， and the percentage of LY was significantly increased （P<0.05）； there were statistically significant differences in the counts of white blood cell （WBC） of the subjects among various groups （P>0.05）. The flow cytometry results showed that compared with control group， the expression levels of CD80 and CD206 proteins in PBMCs of the patients in ATB group and LTBI group were significantly increased （P<0.05）. Compared with ATB group， the expression level of CD206 protein in the PBMCs of the patients in LTBI group was significantly increased （P<0.05）， and the expression level of CD80 protein was significantly decreased （P<0.05）. The RT-qPCR results showed that compared with control group， the expression levels of miR-125a-5p and IL-6 mRNA in the PBMCs of the patients in ATB group and LTBI group were significantly increased （P<0.05）； compared with ATB group， the expression levels of miR-125a-5p and IL-6 mRNA in PBMCs of the patients in LTBI group were significantly increased （P<0.05）. The correlation analysis results showed that the miR-125a-5p expression level was positively correlated with the TNF-α level and IL-6 mRNA expression level （r=0.406， P<0.05； r=0.351， P<0.05）， and negatively correlated with the IL-10 level （r=-0.368， P<0.05）. The area under the receiver operating characteristic （ROC） curve （AUC） value of miR-125a-5p expression level for diagnosing LTBI patients was 0.89 （P<0.01）， with a sensitivity of 0.85 and a specificity of 0.88. Conclusion The expression level of miR-125a-5p in PBMCs of the patients in LTBI group is significantly increased， and it can affect the macrophage polarization to M1， promote the inflammatory response process of macrophages and participate in the occurrence and development of pulmonary tuberculosis.

Graphical abstract

关键词

肺结核 / 结核分枝杆菌潜伏感染 / 微小RNA-125a-5p / 巨噬细胞 / 炎症反应

Key words

Pulmonary tuberculosis / Latent tuberculosis infection / MicroRNA-125a-5p / Macrophage / Inflammatory response

感染结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）可导致活动性结核病（active tuberculosis，ATB）或更常见的结核分枝杆菌潜伏感染 （latent tuberculosis bacillus infection， LTBI）^［1］，这与菌株毒力和免疫反应有关。LTBI具有结核病的免疫学证据，但无疾病的体征和症状，是一种临床状态^［2-4］，但5%~15%的接触MTB的人会患上此疾病^［5］。免疫抑制剂可能导致再激活，每年有超过600万人被诊断出患有结核病^［6-7］。早期诊断和积极治疗患者至关重要。LTBI缺乏统一诊断标准，即使经典的结核菌素试验（purified protein derivative test，PPD）、痰涂片抗酸染色和γ干扰素释放试验 （interferon-Gamma release assays， IGRA）也难以准确鉴别LTBI与结核病，存在假阴性和假阳性^［8-10］。区分感染和患病是棘手的问题，特别是在结核病流行地区，发现高敏感性和特异性的诊断性生物标志物，可尽早诊断LTBI^［11-13］。微小RNA（microRNA，miRNA）可从多种生物样本中分离，具有稳定性和易获取性，成为有用的生物标志物。其作为内源性非编码RNA，长度为21~24个核苷酸，参与基因表达调控^［14-15］。PENG等^［16］研究显示：miRNA在调控结核病和相关疾病中起关键作用，可调控巨噬细胞和LTBI感染。miRNA表达量与免疫功能和细胞变态反应有关，影响固有和适应性免疫反应，促进炎症性疾病发展^［17］。miR-125a-5p在Krueppel样因子13（Krueppel-like factor 13，KLF13）转录因子的介导下，成为巨噬细胞极化的关键基因^［18］。miR-125a-5p可能通过调节核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）途径促进促炎细胞因子的分泌^［19］。LTBI入侵巨噬细胞时，miR-125a-5p通过与Toll样受体（Toll-like veceptor，TLR）结合激活NF-κB信号通路，导致肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6和IL-8等炎症因子的释放，调节炎症反应和清除病原体^［20］。

目前有关miR-125a-5p在MTB患者的表达的差异及其对巨噬细胞极化的影响研究较少，本研究通过测定人外周血中miR-125a-5p及炎症因子水平等，探讨miR-125a-5p在MTB患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中表达的差异及其对巨噬细胞极化的影响，旨在为肺结核（pulmonary tuberculosis，PTB）诊断提供新的思路。

1 资料与方法

1.1　研究对象

本研究严格按照纳入和排除标准，选取2022年7月—2023年6月于青海大学附属医院和青海省第四人民医院就诊，经临床确诊的ATB患者40例（ATB组）和LTBI患者35例（LTBI组），并选取同时间段内就诊于青海大学附属医院体检中心健康体检者40名作为对照组。本研究已获本院医学伦理委员会审批（伦理审批编号：P-SL-202167），所有研究对象均签署书面知情同意书。ATB诊断标准：依照《肺结核诊断标准（WS 288-2017）》^［21］。LTBI诊断标准： 依照《结核病分类（WS196-2017）》^［22］。

1.2　纳入和排除标准

1.2.1　纳入标准

ATB组：①符合ATB诊断标准，临床症状、体征和胸部影像学检查诊断依据痰或肺泡灌洗液中发现MTB；②既往未诊治过结核病未接受过抗结核治疗；③年龄18~65岁；LTBI组：①与PTB或喉结核密切接触人群、免疫功能低下且有结核杆菌（Tubercle bacillus，TB）高风险人群，需进行TB测试（PPD实验及IGRA）；②在结核菌素试验中，若硬结直径≥5 mm，不论是否接种过卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG）均为阳性；③如任何一项检测试验结果为阳性，并明确排除活动性ATB则可以诊断潜伏期感染。④TB测试年龄上限为65岁；健康对照组：①健康体检者均无TB个人病史、TB患者家族感染史和近6个月无活动性TB患者密切接触史；②IGRA及PPD试验阴性；③年龄18~65岁。

1.2.2　排除标准

①确定诊断为慢性肠炎、免疫缺陷性疾病和糖尿病等慢性疾病患者；②并发肝炎和获得性免疫缺陷综合征（acquiredImmune deficiency syndrome，AIDS）等传染性疾病者；③近期曾进行手术或服用激素、免疫抑制剂治疗者；④不配合或非自愿参与者。

1.3　主要试剂和仪器

人 IL-10 和 TNF-α 酶 联 免 疫 吸 附 试 验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）、MMR/CD206/甘露糖受体抗体（上海优宁维生物科技有限公司），Anti-CD80抗体［艾博抗（上海）贸易有限公司］，RNAsimple总RNA提取试剂盒、FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂和FastReal快速荧光定量PCR预混试剂［天根生化科技（北京）有限公司］，山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor^®488）（上海钰博科技有限公司产品），磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（上海申启科技有限公司），无水乙醇和异丙醇（天津市致远化学试剂有限公司）。超净台（型号：SW-CJ-2FD）（苏州安泰空气技术公司）、PCR扩增仪、离心机（型号：5424R）、漩涡混合器和minispinplus离心机（德国Eppendorf公司），实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR， RT-qPCR） 仪 （型 号： Quantstudio5） 和NanoDrop2000C核酸检测仪（美国Thermo公司），分 光 光 度 测 色 仪（美 国 Bio-Rad 公 司），BECKMAN FC-500流式细胞仪（美国贝克曼库尔特有限公司），制冰机（日本Panasonic电器公司），恒温培养箱（美国SHELLAB公司）等。

1.4　血清提取

所有研究对象均在禁食12 h后次日清晨采集空腹静脉血10 mL，分别置入干燥、无菌促凝管和抗凝管中各5 mL，使得血液充分混匀，并记录各组研究对象的基本信息，如姓名、性别、组别和收集 日 期、 血 沉 （erythrocyte sedimentation rate，ESR）、白 细 胞（white blood cell，WBC）计数、单核细胞（monocyte，MONO）百分比、淋巴细胞（lymphocyte，LY）百分比等，促凝管中的血样本用离心机离心出血清置于EP管中，血清和抗凝管中的全血分别于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.5　ELISA法检测各组研究对象血清中炎症因子TNF-α和IL-10水平

所有样本室温融化、平衡，并做复孔（上样），准备各工作液。按照ELISA试剂盒说明书操作，采用酶标仪，于波长450 nm处检测吸光度（A）值，绘制标准曲线，计算各组研究对象血清中炎症因子TNF-α和IL-10水平。

1.6　流式细胞术检测各组研究对象PBMCs中CD80和CD206蛋白表达水平

所有样本室温融化、平衡，准备各工作液。向装有细胞沉淀EP管中加入PBS缓冲液，将管底的沉淀吹打开备用，制备细胞悬液。将装有PBMCs悬液的EP管离心，800 r·min^－1，离心5 min，沉淀物即为细胞。采用预冷PBS缓冲液洗涤2次，再次离心500 r·min^－1，离心5 min。弃上清，加入50 μL底物，充分振摇混匀。再用预冷PBS缓冲液洗涤2次，再次600 r·min^－1离心5 min。加入二抗，于37 ℃水浴锅孵育30 min。采用流式细胞仪计算各组研究对象PBMCs中CD80和CD206蛋白表达水平，以百分率（%）表示。

1.7　RT-qPCR法检测各组研究对象PBMCs中miR-125a-5p和IL-6 mRNA表达水平

按照试剂盒说明书方法提取总RNA，Nandrop200检测RNA的浓度和纯度，采用逆转录试剂盒合成cDNA，以β-actin为内参基因，进行RT-qPCR法检测。反应体系：5×SYBR Super mix plus 10 μL， 模板 cDNA 200 μg， 上下游引物各1 μL，加入水补齐至20 μL。反应条件：反应温度梯度 预变性 95 ℃、15 min，RT-PCR反应条件95 ℃、10 s，55 ℃、20 s，72 ℃、 32 s，共40个循环。引物序列：miR-125a-5p F TGCCAGTCT-CTAGGTCCCTGAG，miR-125a-5p R CAGACG-CCAGGCTCCCAAG；IL-6 F GGTGTTGCCTG-CTGCCTTCC，IL-6 R GTTCTGAAGAGGTG-AGTGGCTGTC；β-actin F CATCTGCTGGAA-GGTGGACA，β-actin R CGACAGGATGCAGA-AGGAGA。采用2^—△△Ct法计算各组PBMCs中目的基因表达水平。

1.8　统计学分析

采用SPSS 28.0和GraphPad Prism 9.0统计软件进行统计学分析。各组研究对象年龄、血清ESR、WBC计数、MONO百分比和LY百分比均符合正态分布，以x±s表示，正态分布资料多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验； PBMCs中miR-125a-5p和IL-6 mRNA表达水平及TNF-α和IL-10水平符合偏态分布，以M（P25，P75）表示，偏态分布的组间及两两比较采用Kruskal-Wallis H秩和检验，分类数据比较采用卡方检验；相关性分析采用Spearman相关分 析，以P<0.05为差异有统计学意义。绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC） 曲线， 计算曲线下面积 （area under curve，AUC）和95%置信区间 （confidence interval， CI）， 以确定miR-125a-5p对LTBI患者诊断的灵敏度和特异度。

2 结 果

2.1　一般资料

各组研究对象中，ATB组患者男性21例，女性19例；平均年龄（39.50±12.39）岁。LTBI组患者男性18例，女性17例，平均年龄（43.23±12.70）岁。对照组研究对象男性17人，女性23人，平均年龄（46.25±11.74）岁。3组研究对象一般资料比较差异均无统计学意义（P>0.05），提示3组具有可比性。见表1。

2.2　各组研究对象血清中ESR、WBC计数、LY百分比、MONO百分比、TNF-α水平和IL-10水平

与对照组比较，ATB组和LTBI组患者血清中ESR、MONO百分比、TNF-α和IL-10水平均明显升高（P<0.05），LY百分比明显降低（P<0.05）。与ATB组比较，LTBI组患者血清中ESR和IL-10水平均明显降低（P<0.05），LY百分比明显升高（P<0.05）。WBC计数组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3　各组研究对象PBMCs中CD80和CD206蛋白表达水平

与对照组比较，ATB组和LTBI组患者PBMCs中CD80和CD206蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。与ATB组比较，LTBI组患者PBMCs中CD206蛋白表达水平明显升高（P<0.05），CD80 蛋 白 表 达 水 平 明 显 降 低（P<0.05）。见图1和2。

2.4　各组研究对象PBMCs中miR-125a-5p和IL-6 mRNA表达水平

与对照组比较，ATB组和LTBI组患者PBMCs中miR-125a-5p和IL-6 mRNA表达水平均明显升高（P<0.05）。与ATB组比较，LTBI组患者PBMCs中miR-125a-5p和IL-6 mRNA表达水平均明显升高（P<0.05）。见表3。

2.5　LTBI组患者miR-125a-5p表达水平与TNF-α和IL-10水平及IL-6

mRNA表达水平的相关性

miR-125a-5p 表 达 水 平 与 TNF-α 水 平 和IL-6 mRNA表达水平呈正相关关系（r=0.406，P<0.05；r=0.351，P<0.05），与IL-10水平呈负相关关系（r=-0.368，P<0.05）。见图3。

2.6　 miR-125a-5p表达水平对于LTBI的预测价值

绘制LTBI和ATB患者PBMCs中miR-125a-5p表达水平的ROC曲线，AUC值为0.89 （P<0.01），灵敏度为0.85，特异度为0.88，提示miR-125a-5p表达水平对LTBI和ATB的诊断有意义，且诊断效能较大。见图4。

3 讨 论

PTB是主要由MTB引起的慢性传染病，主要影响肺部，全球发病率和死亡率高。中国2022年新增病例74.8万（发病率52/10万），在30个高负担国家中排名第三^［23］。在西北地区，PTB发病率更高^［24］。LTBI的检测和预防是预防PTB的重要挑战。研究^［25］比较健康个体与ATB及LTBI的基因表达，揭示了关键生物过程的调控标志，涉及炎症反应、免疫防御、细胞活化及增殖等。ATB的PBMCs和血清中miRNA表达水平存在差异，且miR-21、miR-31、miR-146a和miR-155相关miRNA参与结核病的免疫和炎症反应^［26-27］。久太等^［28］研究发现：ATB中有1个基因表达水平升高，而在LTBI中，6个基因表达增加。miRNA参与LTBI到ATB的疾病进展过程^［29］。

miRNA在调控LTBI的巨噬细胞极化中起关键作用，而MTB感染的免疫反应主要通过巨噬细胞发挥作用^［16］。巨噬细胞可极化为两种类型M1型和M2型，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和IL-4刺激的人巨噬细胞分别表现出M1型和M2型特征，CD80和CD86在两者中发挥重要作用，影响T辅助细胞1（T helper 1 cells，Th1）和T辅助细胞2（T helper 2 cells，Th2）的平衡。M1型巨噬细胞释放大量促炎因子，而M2型则增加免疫抑制因子如转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）抑制炎症，LTBI与ATB在巨噬细胞极化方向的差异^［30］。研究^［30］显示：miR-125a-5p通过抑制肿瘤坏死因子α诱导蛋白3（tumor necrosis factor α-induced protein 3，TNFAIP3）表达，促进M1标志物上调，从而调控巨噬细胞向M1极化。TLR和γ干扰素刺激信号转导与转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）1激活干扰素调节因子（interferon regulatory factor，IRF）和STAT，促进M1应答， 而IL-10则通过STAT6诱导IRF/STAT，促进M2应答^［31］。ALTB中，γ干扰素通路中的免疫抑制细胞信号转导抑制因子3（suppressor of cytokine dignaling-3， SOCS-3） 上调，进而抑制了IL-6的活化，但不抑制IL-10^［32］。也有研究^［33］证实在ATB中IL-10表达水平明显高于LTBI，这与本研究结果一致。

本研究结果显示：在LTBI患者PBMCs中CD80蛋白表达水平升高，CD206蛋白表达水平降低，提示其M1极化能力增强，miR-125a-5p呈显著高表达，IL-6 mRNA表达水平和TNF-α水平明显升高，IL-10水平明显降低，提示miR-125a-5p与巨噬细胞向M1型极化相关，从而促进IL-6和TNF-α的表达，增强免疫功能，减少M2型极化和IL-10的分泌， 促进组织修复， 进而避免ATB发生，miR-125a-5p对LTBI诱导巨噬细胞的炎症反应起正调节作用；而ATB患者PBMCs中CD80蛋白表达水平降低，CD206蛋白表达水平升高，显示M2极化能力增强，IL-6表达水平低于LTBI患者，但IL-10高表达，这与LI等^［32］研究结论一致。本研究结果显示：与对照组比较，ATB组患者PBMCs中miR-125a-5p表达水平和TNF-α水平较高，提示其依然调控M1型极化，但可能调节M1极化的能力较LTBI组弱，导致ATB的发生。本研究结果显示：miR-125a-5p的ROC曲线表现出中等区分效率，灵敏度和特异度较高，表明miR-125a-5p对LTBI具有良好的诊断价值。

综上所述，miR-125a-5p在LTBI中显著高表达，可影响巨噬细胞向M1极化。miR-125a-5p有望作为LTBI的分子诊断标志物，为LTBI提供新的诊断方向。

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基金资助

青海省科技厅基础研究计划项目(2022-ZJ-775)

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