柯萨奇病毒A16型病毒Vp1蛋白的原核表达、纯化及兔多克隆抗体的制备

Prokaryotic expression, purification of coxsackievirus A16 Vp1 protein and preparation of rabbit polyclonal antibodies

摘要

目的 构建柯萨奇病毒A16型（CA16）病毒病毒蛋白1（Vp1）的原核表达载体，并在大肠杆菌（E.coli）BL21中进行表达，纯化蛋白后制备兔多克隆抗体并对抗体免疫反应性进行鉴定。 方法 利用生物信息学在线工具对Vp1蛋白氨基酸组成、保守结构域、二级和三级结构进行预测。扩增CA16的Vp1基因，并将其克隆至原核表达载体pET28a（+）中。将pET28a-Vp1转化E.coli BL21，利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。采用Western blotting法鉴定Vp1蛋白诱导表达情况，并优化诱导时间和温度以提高表达效率。取2只雌性SPF新西兰大白兔，将纯化的重组蛋白Vp1免疫兔，制备兔抗Vp1蛋白多克隆抗体，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定抗体效价，Western blotting法对抗体的免疫反应性进行鉴定。 结果 生物信息学分析，Vp1基因编码297个氨基酸，相对分子质量为33 046.39，等电点为8.32，属于亲水性蛋白；二级结构中α-螺旋占15.15%，无规则卷曲占67.68%，延伸链占17.17%。重组质粒pET28a-Vp1测序，pET28a-Vp1质粒构建正确。Western blotting法检测，IPTG诱导组于相对分子质量33 000处有目的蛋白表达，目的蛋白主要表达于包涵体中。蛋白最佳诱导表达条件为IPTG浓度0.4 mmol·L^-1、温度16 ℃和诱导时间20 h。ELISA法检测，兔多克隆抗体效价为1∶1 024 000。Western blotting法检测，Vp1兔多克隆抗体可以与CA16感染细胞中的病毒Vp1蛋白结合。 结论 成功制备出抗CA16 Vp1的多克隆抗体，该抗体对CA16 Vp1具有明显的结合特性，可用于肠道病毒感染的诊断及治疗方法的开发。

Abstract

Objective To construct the prokaryotic expression vector of Coxsackievirus A16 （CA16） viral protein 1 （Vp1）， express it in Escherichia coli （E.coli） BL21， purify the protein， prepare rabbit polyclonal antibodies， and identify the immunoreactivity of the antibodies. Methods Bioinformatics online tools were used to predict the amino acid composition， conserved domains， secondary and tertiary structures of the Vp1 protein. The Vp1 gene of CA16 was amplified and cloned into the prokaryotic expression vector pET28a（+）. The pET28a-Vp1 was transformed into E.coli BL21， and the expression was induced using isopropyl β-D-thiogalactopyranoside （IPTG）. Western blotting method was used to identify the induced expression of Vp1 protein， and the induction time and temperature were optimized to improve the expression efficiency. Two female SPF New Zealand white rabbits were taken， and the purified recombinant protein Vp1 was used to immunize the rabbits to prepare rabbit anti-Vp1 protein polyclonal antibodies. The antibody titer was determined by ELISA method， and the immunoreactivity of the antibodies was identified by Western blotting method. Results The bioinformatics analysis results showed that the Vp1 gene encoded 297 amino acids， with a relative molecular mass of 33 046.39 and an isoelectric point of 8.32， belonging to a hydrophilic protein； in the secondary structure， α-helix accounted for 15.15%， random coil accounted for 67.68%， and extended strand accounted for 17.17%. Sequencing of the recombinant plasmid pET28a-Vp1 confirmed that the pET28a-Vp1 plasmid was correctly constructed. The Western blotting results showed that the target protein was expressed in the IPTG induction group at a relative molecular mass of 33 000， and the target protein was mainly expressed in inclusion bodies. The optimal induction conditions for protein expression were IPTG concentration of 0.4 mmol·L^-1， temperature of 16 ℃， and induction time of 20 h. The ELISA assay results showed that the titer of the rabbit polyclonal antibody was 1∶1 024 000. The Western blotting results showed that the Vp1 rabbit polyclonal antibody could bind to the viral Vp1 protein in the CA16-infected cells. Conclusion The polyclonal antibody against CA16 Vp1 is successfully prepared， and this antibody has significant binding characteristics to CA16 Vp1， which can be used for the diagnosis of enterovirus infection and the development of treatment methods.

Graphical abstract

关键词

柯萨奇病毒A16型 / 病毒蛋白1 / 原核表达 / 多克隆抗体 / 大肠杆菌

Key words

Coxsackievirus A16 / Viral protein 1 / Prokaryotic expression / Polyclonal antibody / Escherichia coli

柯萨奇病毒A16型（coxsackievirus A16， CA16）属于小核糖核酸病毒科中的肠道病毒属，属于人类肠道病毒A型 ^［1］。该病毒颗粒呈二十面体立体对称的球形结构，直径为24~30 nm，表面无包膜及突起结构^［2］。CA16病毒感染所引发的主要临床症状为手足口病 （hand-foot-mouth disease， HFMD），其特征为手部、足部及口腔出现皮疹、疱疹和水疱等表现，常伴随发热、厌食及精神萎靡等症状^［3-5］。大多数病例病情较轻且具有自限性，但也有少数病例病情进展迅速，并可能出现严重的并发症^［3-5］。近年流行病学调查^［6-9］显示：CA16感染引发的HFMD在亚太地区仍然保持高发态势。

目前，针对CA16的治疗主要以对症支持为主，尚无特效药物^［10］。中国已上市的针对肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）的灭活疫苗对CA16感染无明显交叉保护作用^［11-12］。关于CA16疫苗的研究大多处于临床前阶段，部分候选疫苗在动物模型中显示出良好的保护效果，但距离上市仍需时间^［13-14］。病毒蛋白1（viral protein 1，Vp1）是CA16最主要的衣壳蛋白之一，直接决定病毒的抗原性^［15］；其为中和抗体的重要靶位，能够影响病毒的感染性和致病性^［16-18］。尽管Vp1蛋白作为研究CA16的主要目标而被广泛关注，但是目前对CA16 Vp1免疫性方面的研究仍然较少。本研究探讨CA16 Vp1的大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）原核表达系统和表达条件，纯化蛋白并制备血清抗体，为CA16相关的基础研究及肠道病毒诊断和治疗试剂开发提供参考。

1 材料与方法

1.1　实验动物、细胞、主要试剂和仪器

2只雌性SPF级新西兰大白兔（4月龄，体质量2.1 kg）购于武汉万千佳兴生物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2007-0005。E.coli DH5α和E.coli BL21（DE3） 化 学 感 受 态 细 胞 （上 海TOLOBIO公司），原核表达载体pET28a（+）、绿猴肾细胞（Vero细胞）和CA16由江汉大学湖北省认知与情感障碍重点实验室保存。DNA无缝克隆试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），KOD-Plus-Neo聚合酶［东洋纺（上海）生物科技有限公司］，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）（德国BIOFROXX公司），抗组氨酸（histidine，His）标签抗体（美国Proteintech Group公司），HRP标记的二抗（武汉博士德公司），Premix Taq™和DNA Ladder 5000 DNA marker（DL5000 DNA marker）（日本TaKaRa公司），蛋白Marker（武汉ABclonal公司），牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）（北京Biosharp公司），考马斯亮蓝染色液（上海碧云天公司），His标签镍（Nickel，Ni）离子蛋白纯化柱（美国GenScript公司），DMEM培养基和0.25%胰酶（美国Gibco公司），弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂（美国Sigma公司），HRP标记山羊抗兔IgG（武汉迈思生物科技有限公司）。Multi skan GO酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），HF90/HF240 CO₂培养箱（上海HEAL FORCE公司），Ⅱ级生物安全柜（北京东联哈尔仪器制造有限公司），PCR仪和自动化学发光成像仪（美国Bio-Rad公司），QuickGel 6100凝胶成像系统（武汉莫纳生物科技有限公司）。

1.2　Vp1蛋白生物信息学分析

利用瑞士生物信息学数据库和资源中心Expasy网站的ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）工具及Protscale（https：//web.expasy.org/protscale/）工具分析蛋白的理化性质和亲/疏水性。采用SOPMA二级结构预测分析软件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl page=npsa_sopma.html）和瑞士生物信息学研究所同源建模服务器SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）对目的蛋白二级及三级结构进行预测。

1.3　pET28a-Vp1的构建和鉴定

根据载体pET28a（+）序列信息和CA16-Vp1的序列信息（NCBI Genebank登录号KM516102），登陆诺唯赞官网下载引物设计软件CEDesign （http：//www.vazyme.com），依据同源重组引物设计原则设计克隆引物。载体线性化引物设计：pET28a（+） F 5'- TAACAAAGCCCGAAAGGAAGC-3'；pET28a（+）R 5'-GTGATGATGATGATGATGGCTG-3'。Vp1同源重组引物设计（大写碱基为同源臂）：pET28a-Vp1 F 5'-ACGCGTCGACGTGGGGATC-CCATTGCAGACATGA-3'，pET28a-Vp1 R 5'-CCG-CTCGAGTTACAACGTTGTTATCTTATCTC-TA-3'；引物送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以pGEM-T-CA16为模板，经pET28a-Vp1-F和pET28a-Vp1-R引物进行扩增，获得Vp1片段^［19］。

CA16 Vp1片段扩增反应条件如下：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性15 s，52 ℃退火30 s，68 ℃延伸60 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，通过胶回收试剂盒进行回收。于冰上配制反应体系，线性化载体，插入目的基因片段。使用移液器吹打混匀，短暂离心后37 ℃反应30 min，立即置于冰上冷却。然后将连接后的产物转化E.coli感受态细胞DH5α。继续于37 ℃培养箱中倒置培养12~16 h后观察平板上单菌落生长情况，挑取单菌落进行菌液PCR鉴定。

取八连管，用灭菌枪头从转化平板上挑取约8个单菌落，然后将挑取单菌落的枪头依次打入对应管中，分别加入1 mL卡那霉素抗性LB培养基，37 ℃摇床培养4 h，以菌液为模板进行PCR。菌液PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，若可以扩增出单一约891 bp的条带则初步判断为鉴定阳性的菌落。鉴定阳性的菌落进一步提取质粒，送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果与目的片段相符，表明原核表达载体pET28a-Vp1构建成功。

1.4　Vp1重组蛋白诱导表达和表达条件优化

将测序正确的pET28a-Vp1质粒转化E.coli感受态BL21细胞。次日，挑取单菌落于10 mL卡那霉素抗性的液体LB培养基中，37 ℃摇床，220 r·min^-1继续培养10~12 h备用。将试管中的菌液按1∶100的比例加入到新的卡那霉素抗性的液体LB培养基中。在37 ℃摇床、220 r·min^-1继续摇菌，待菌液波长600 nm处吸光度 （A） 值达到0.4~0.6时，取出1 mL作为阴性对照（不加IPTG诱导组）。然后加入IPTG（终浓度0.4 mmol·L^-1）进行诱导。为进一步分析重组蛋白诱导表达的更优条件，选择了不同的诱导温度（20 ℃和16 ℃）和不同的诱导时间（5和20 h）。

诱导结束后，先取出1 mL（+IPTG）菌液进行检测。将取出的1 mL诱导（+IPTG）菌液和1 mL未诱导（-IPTG）阴性对照样品，12 000 r·min^-1离心1 min，弃上清。用50 μL（菌体体积的1/20）磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）重悬洗涤菌体，再次离心。加入500 μL PBS缓冲液重悬，随后各取50 μL标记为全菌样品和阴性对照（-IPTG）样品。将剩余450 μL（+IPTG）菌液用小型的超声破碎仪器进行超声，重复4~5次，直到菌体由浑浊变清亮即可。超声后菌体12 000 r·min^-1离心1 min，分离上清与沉淀。将上清和沉淀各取50 μL至新的EP管，与全菌样品和阴性对照（-IPTG）样品一起加入十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium laury sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 上 样 缓 冲 液，100 ℃煮样5 min，12 000 r·min^-1离心5 min，取上清点样。同时取2块胶进行相同样品的重复点样，其中一块胶进行考马斯亮蓝染色，另外一块胶采用Western blotting法检测His蛋白表达情况。通过考马斯亮蓝染色或采用全自动化学发光成像仪，观察各组样品中CA16-Vp1蛋白于相对分子质量33 000 附近是否有条带和条带强弱以判断蛋白表达情况。

1.5　Vp1重组蛋白包涵体纯化

pET28a-Vp1质粒在Vp1上游偶联有His标签，因此可以通过His抗体检测Vp1的表达。收集空载体组（pET空载），诱导前 （pET-Vp1-IPTG） 和诱导后 （pET-Vp1+IPTG）各组细胞样品，平行点样（相同的蛋白样品同时上样两块SDS-PAGE胶）。其中一块胶进行考马斯亮蓝染色，另外一块胶采用Western blotting法检测。蛋白纯化所用镍柱中的Ni与His蛋白和咪唑结合，首先将破碎好的目的蛋白溶液加入Ni柱中，大部分目的蛋白会结合在Ni柱上，流穿液中大多为杂蛋白。同时Ni柱上会残留少许杂蛋白，可以先用低浓度的咪唑洗脱杂蛋白。随着咪唑浓度的增加，加入咪唑后，高浓度咪唑会与目的蛋白竞争性结合Ni柱，使之前结合的目的蛋白被洗脱下来。

通过预实验检测IPTG诱导前后和蛋白超声前后的蛋白样品，预实验结果显示：重组蛋白Vp1主要分布于包涵体中，在蛋白超声后，可见蛋白液并未变得清亮，相反越来越白，提示表达的蛋白在超声破细胞后，主要以包涵体的形式存在于沉淀中，因此离心后收集沉淀。配制含8 mol·L^-1尿素PBS缓冲液40 mL（现配现用），溶解包涵体沉淀，溶解过程中可适当超声。包涵体溶解后，4 ℃、10 000 r·min^-1离心20 min后，收集上清。将上清加入预先平衡的Ni柱中使其与Ni填料结合，让Ni填料珠子与样品中的His蛋白充分混匀和结合。配制含8 mol·L^-1尿素的20、50、80、250和500 mmol·L^-1咪唑洗脱液（现配现用），并依次添加入Ni柱，以洗脱目的蛋白，同时分别收集不同洗脱组分。将收集的蛋白各自取出50 μL制样，并采用考马斯亮蓝和Western blotting法检测。通过考马斯亮蓝染色或采用全自动化学发光成像仪，观察各组样品中CA16-Vp1蛋白于相对分子质量33 000附近是否有条带和条带强弱以判断蛋白表达情况。

1.6　兔多克隆抗体的制备

选用SPF级健康雌性新西兰大白兔2只，2只兔均通过背部多点皮下免疫。初次免疫抗原为每只兔0.4 mg重组蛋白与等体积弗氏完全佐剂混匀乳化，第2、3和4次免疫抗原为每只兔0.2 mg重组蛋白与等体积弗氏不完全佐剂混匀乳化。第1次免疫：第1天，免疫用抗原为弗氏完全佐剂+重组蛋白；第2次免疫：第14天，免疫用抗原为弗氏不完全佐剂+重组蛋白；第3次免疫：第28天，免疫用抗原为弗氏不完全佐剂+重组蛋白；3次免疫后采血：第35天，耳静脉采血1 mL，离心分离血清，对血清进行梯度稀释（1~12孔），通过间接酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法进行效价测定；第4次免疫：第42天，免疫用抗原为弗氏不完全佐剂+重组蛋白；最终放血：第49天，颈动脉采全血，ELISA法检测抗血清效价。

1.7　间接ELISA法检测抗血清效价

实验同时免疫2只大白兔，分别取2只大白兔的血进行抗体滴度测定，在滴度测定时分组为Group A和Group B。对收集的血清进行梯度稀释（1~12孔），分别对血清进行1 000、2 000、4 000、8 000、16 000、32 000、64 000、128 000、256 000、512 000和1 024 000倍稀释，检测抗血清效价。将抗原用0.05 mol·L^-1碳酸盐（pH=9.6）稀释至6 mg·L^-1，每孔100 μL，4 ℃孵育过夜进行抗原包被。取出抗原用含0.05%Tween-20的PBST溶液洗板3次，每次3 min。每孔加入PBST稀释的5%脱脂奶粉150 μL封闭液，37 ℃封闭60 min。取出用含0.05%Tween-20的PBST溶液洗涤3次，每次3 min。将抗体分别按照比例稀释，37 ℃孵育1 h，加入一抗。取出抗体用含0.05%Tween-20的PBST溶液洗涤3次，每次3 min。HRP标记山羊抗兔IgG（1∶8 000），37 ℃孵育45 min，加入二抗。用含0.05%Tween-20的PBST溶液洗涤5次，每次3 min。加入底物TMB溶液，每孔100 μL，反应5~10 min，最后加入100 μL 2 mol·L^-1硫酸终止反应，显色。采用酶标仪测定波长450 nm处A值，以出现明显颜色反应血清的最大稀释倍数判定为血清效价。

1.8　兔抗Vp1抗血清的免疫反应性检测

采用制备的CA16-Vp1多克隆抗体对感染CA16的Vero细胞中的Vp1蛋白表达进行蛋白质印迹测定。将CA16按感染复数（multiplicity of infection，MOI）为0.01接种Vero细胞，37 ℃培养24 h收集蛋白样品，加入上样缓冲液，100 ℃加热8~10 min使其变性后，经12%SDS-PAGE分离，转印到PVDF膜后，置于含5%脱脂奶粉的TBST溶液中室温封闭2 h；加入Vp1抗血清（1∶1 000），4 ℃孵育过 夜；TBST溶液洗涤5~6次，加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗（l∶5 000），室温孵育2 h；TBST溶液洗涤5~6次，加入显色剂显色。采用全自动化学发光成像仪，观察各组样品中Vp1蛋白于相对分子质量33 000附近是否有条带和条带强弱以判断抗血清与病毒Vp1蛋白结合的免疫反应性。

2 结 果

2.1　Vp1蛋白的理化性质

Vp1基因含有297个氨基酸残基，相对分子质量为33 046.39，等电点为8.32，不稳定指数为41.15。氨基酸组成分析结果显示：苏氨酸占比10.1%，丙氨酸占比7.7%，脯氨酸占比7.4%。见表1。

2.2　Vp1蛋白的亲水和疏水性

亲水性最低值为第277位的脯氨酸（-2.478），疏水性最高值为第90位的缬氨酸（2.089）。见图1。低分值（分值<0分）的氨基酸占比较大，表明Vp1蛋白属于亲水性蛋白。

2.3　Vp1蛋白二级结构和三级结构

Vp1蛋白α-螺旋占15.15%，无规则卷曲占67.68%，延伸链占17.17%。见图2和3。

2.4　重组表达质粒pET28a-Vp1鉴定

于约891 bp处有扩增条带，条带大小与预期结果一致（图4A）。同时以pET28a载体为模板进行扩增，得到线性化载体，琼脂糖凝胶结果显示：于约5 300 bp处有扩增条带，与预期结果一致（图4A）。对重组质粒pET28a-Vp1通过菌液PCR进行鉴定，菌液PCR结果与预期相符（图4B）。进一步提取阳性克隆质粒并将质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司进行Sanger测序（双脱氧链终止法），测序结果与目的片段相符。

2.5　重组蛋白表达和诱导条件优化

与空载体（pET空载）和诱导前（pET-Vp1-IPTG）组比较，诱导后（pET-Vp1+IPTG）组可观察到于相对分子质量33 000处有一明显高表达的蛋白条带。而空载体组和诱导前组均未见对应的蛋白条带（图5），表明可能成功诱导表达了重组蛋白。进一步对全菌、上清和沉淀中目的蛋白的表达情况进行分析，结果显示：重组蛋白主要在沉淀中，提示该蛋白可能主要以包涵体形式表达。

比较各组总蛋白和杂蛋白条带数量，16 ℃诱导20 h组的总蛋白量较高，而且杂蛋白相对较少，更加有利于后续的纯化。因此在后续的大量诱导表达中选择了16 ℃诱导20 h。见图6~8。

考马斯亮蓝染色和Western blotting的检测结果呈现出一致性和对应性。诱导后在全菌和沉淀中于相对分子质量33 000处均有一条高表达的蛋白，该蛋白同时可以通过His抗体检测出来。见图9。

2.6　重组蛋白的包涵体纯化

250~500 mmol·L^-1咪唑可以有效洗脱出纯度较高的目的蛋白。通过跟已知浓度的BSA标准蛋白进行比较，本研究选取浓度和纯度较高的6~9管洗脱液进行后续实验。

2.7　兔多克隆抗体效价检测

1~12孔随着血清稀释度的增加，反应孔的颜色逐渐变淡。在第12孔，1∶1 024 000稀释孔仍然可以观察到黄色。根据血清效价的评价标准在1∶1 024 000稀释后，仍然可以检测到抗体，提示本研究免疫家兔制备的抗血清效价不低于1∶1 024 000，达到预期的效价。见图10和表2。

2.8　兔多克隆抗体的免疫反应性检测

与不感染病毒的对照组比较，CA16感染组中可以检测到制备的兔多克隆抗体与病毒蛋白Vp1结合的蛋白条带表达。见图11。

3 讨 论

CA16病毒的Vp1蛋白位于病毒颗粒的表面，是主要的衣壳蛋白之一^［20］。Vp1蛋白由297个氨基酸组成，Vp1中存在的“峡谷样凹陷”是病毒识别、附着及结合宿主细胞的关键位点^［21-22］。此外，Vp1蛋白中的疏水性口袋在病毒的脱衣壳过程中发挥重要作用。在基础研究中，深入理解Vp1蛋白的结构和功能有助于揭示病毒的感染机制及宿主范围，为抗病毒策略的开发提供重要依据^［15-16］。在疫苗研发方面，Vp1蛋白包含多个中和表位，是疫苗开发的关键靶点^［23］。

E.coli表达系统是一种广泛使用的原核表达系统^［24］，该蛋白表达系统的优点包括高产量、低成本、快速繁殖、遗传操作简便、转化效率高和适用于多种异源蛋白的表达^［25］。由于E.coli作为原核生物，缺乏内质网和高尔基体等真核细胞特有的细胞器，蛋白质合成后期的修饰和加工能力较差，导致合成的蛋白常以包涵体形式出现^［25］。李丹等^［26］利用E.coli BL21（DE3）、Rosetta（DE3）和BL21（PLySs）感受态细胞表达重组质粒pET28a-PPRV H，外源蛋白主要以包涵体形式表达，主要出现在沉淀中。张喜文等^［27］利用E.coli Rosetta（DE3）感受态细胞表达鸭坦布苏病毒NS1蛋白，重组蛋白呈包涵体形式表达。与此相同，本研究中CA16 Vp1蛋白呈包涵体形式表达，因此CA16 Vp1包涵体形式表达是今后需解决的问题之一。本研究以pET-28a为载体，选择E.coli作为原核表达体系进行实验，观察到重组Vp1蛋白的高表达。相关结果进一步证实了pET-28a作为载体和E.coli作为原核表达系统的有效性。

融合蛋白表达条件会对蛋白表达产量产生影响。张树军等^［28］研究发现：IPTG的加入时机，诱导剂IPTG的终浓度以及IPTG的诱导表达时间都是需要综合考虑的因素。已有研究^［29］表明：在0.2~1.2 mmol·L^-1浓度范围内，不同浓度IPTG对诱导表达的影响并不显著，因此选择IPTG浓度为0.4 mmol·L^-1。本研究主要调整了诱导表达的温度和时间，通过比较诱导5和20 h及16 ℃和20 ℃的条件，发现目的蛋白的表达量并未明显增加。然而，在16 ℃诱导20 h的实验组中，杂蛋白的数量，尤其是沉淀中杂蛋白的数量明显减少，目的蛋白的条带相对较为单一。因此，在后续的大规模诱导实验中，选择了16 ℃诱导20 h的条件。

镍离子亲和层析柱（Nickel-nitrilotriacetic acid affinity chromatography column，Ni-NTA）纯化蛋白的原理主要基于His标签（通常为6个连续的组氨酸残基，也称为6His）与Ni²⁺之间的高亲和力结合^［30］。在本研究中，Vp1基因被构建在pET28a载体上，在目的基因的上游连接了His标签，因此可以通过Ni-NTA进行有效纯化。Ni-NTA纯化介质为Ni离子金属螯合介质，其中的Ni²⁺能够特异性地与带有His标签的碱性蛋白结合，而其他杂蛋白则不与之结合。同时Ni²⁺也能够与咪唑结合，因此可以通过低浓度的咪唑洗脱杂蛋白，而高浓度的咪唑则能够竞争性地结合Ni²⁺，从而使目的蛋白被洗脱下来^［30］。

针对不同病毒的抗体交叉反应性对于诊断和免疫保护至关重要。ZHOU等^［31］研究发现：针对EV71和CA16的双特异性工程抗体表现出显著的交叉保护效果，在小鼠水平上不管是单个病毒感染还是共感染都表现出较好的保护效果，相关研究为用于抗肠道病毒感染的双特异性抗体工程的应用提供了重要见解。在另外一项研究^［32］中，利用EV71抗原免疫鸡，从鸡卵黄分离纯化IgY，结果显示：IgY在EV71和CA16株中均具有交叉结合特性，且IgY能剂量依赖性交叉阻断EV71和CA16菌株在RD细胞中的感染。本研究采用CA16 Vp1抗原免疫家兔制备多克隆抗体，结果显示：该抗体对EV71和CA16均具有交叉结合特性，提示在CA16 Vp1上可能存在可引发交叉反应的优势表位，具体位点尚待进一步深入研究。

综上所述，本研究采用E.coli原核表达系统，成功诱导表达重组Vp1蛋白重组蛋白免疫家兔制备抗血清，抗体的效价高达1∶1 024 000。制备的兔抗Vp1蛋白多克隆抗体能够结合CA16和EV71病毒蛋白Vp1。

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基金资助

国家自然科学基金青年基金项目(82202494)

湖北省科技厅自然科学基金项目(2018CFB254)

湖北省武汉市卫健委新冠肺炎应急科研专项项目(EX20D04)

江汉大学校级科研资助计划项目(2023KJZX27)

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