沉默GPR139基因对乳腺癌细胞增殖、凋亡和自噬的影响及其机制

Effect of silencing GPR139 gene on proliferation, apoptosis and autophagy of breast cancer cells and its mechanism

摘要

目的 探讨沉默G蛋白偶联受体139（GPR139）基因对乳腺癌细胞增殖、凋亡和自噬的影响，并阐明其可能的作用机制。 方法 通过癌症基因组图谱（TCGA）和人类蛋白质图谱（HPA）数据库下载GPR139 mRNA和蛋白在乳腺癌组织与正常组织中的表达情况。利用慢病毒干扰技术将GPR139短发夹RNA（shRNA）转染至人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞系中，分为sh-NC组（感染阴性对照慢病毒）、sh-GPR139（感染GPR139 shRNA干扰慢病毒）和sh-NC+F05组（感染阴性对照慢病毒后，加入GPR139拮抗剂NCRW0005-F05）。采用噻唑蓝（MTT）法检测各组乳腺癌细胞增殖活性，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法和Western blotting法检测各组乳腺癌细胞中细胞增殖标志物Ki-67、细胞周期素（Cyclin）D1、Cyclin E1和P21 mRNA及蛋白表达水平，流式细胞术检测各组乳腺癌细胞凋亡率，Western blotting法检测各组乳腺癌细胞中腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、磷酸化AMPK、Unc-51样自噬激活激酶1（ULK1）、磷酸化ULK1、微管相关蛋白1轻链3A/B（LC3A/B）和P62蛋白表达水平，免疫荧光法检测各组乳腺癌细胞中LC3A/B蛋白表达水平。 结果 TCGA和HPA数据库，在人乳腺癌组织中的GPR139 mRNA表达水平明显高于正常组织（P<0.001），GPR139蛋白表达量明显高于正常组织。MTT法，与sh-NC组比较，sh-GPR139组和sh-NC+F05组乳腺癌细胞增殖活性明显降低（P<0.01）。Western blotting法，与sh-NC组比较，sh-GPR139组和sh-NC+F05组乳腺癌细胞中GPR139、Ki67、Cyclin D1和Cyclin E1蛋白表达水平降低（P<0.05或P<0.01），P21蛋白表达水平升高（P<0.01）。RT-qPCR法，与sh-NC组比较，sh-GPR139组和sh-NC+F05组乳腺癌细胞中GPR139、Ki67、Cyclin D1和Cyclin E1 mRNA表达水平降低（P<0.05或P<0.01），P21 mRNA表达水平升高（P<0.01）。流式细胞术，与sh-NC组比较，sh-GPR139组和sh-NC+F05组乳腺癌细胞凋亡率明显增加（P<0.01）。免疫荧光法，在MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞中，与sh-NC组比较，sh-GPR139组和sh-NC+F05组细胞中LC3A/B蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。Western blotting法，与sh-NC组比较，sh-GPR139组和sh-NC+F05组LC3A/B、p-AMPK和p-ULK1蛋白表达水平明显升高（P<0.01），P62蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01）。 结论 沉默GPR139基因可诱导乳腺癌细胞自噬和凋亡，抑制细胞增殖，其机制可能与升高细胞中AMPK和ULK1磷酸化水平有关。

Abstract

Objective To discuss the effect of silencing G protein-coupled receptor 139 （GPR139） gene on the proliferation， apoptosis and autophagy of breast cancer cells， and to clarify its possible mechanism. Methods The expression of GPR139 mRNA and protein in breast cancer tissue and normal tissue was downloaded from The Cancer Genome Atlas （TCGA） and Human Protein Atlas （HPA） databases； the GPR139 short hairpin RNA （shRNA） was transfected into the human breast cancer MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines by lentiviral interference technology， and the cells were divided into sh-NC group （infected with negative control lentivirus）， sh-GPR139 group （infected with GPR139 shRNA interference lentivirus）， and sh-NC+F05 group （after infected with negative control lentivirus， GPR139 antagonist NCRW0005-F05 was added）； methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide（MTT） method was used to detect the proliferation activities of the cells in various groups； Western blotting and real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） methods were used to detect the expression levels of proliferation markers Ki-67， Cyclin D1， Cyclin E1， and P21 mRNA and proteins in the cells in various groups； flow cytometry was used to detect the apoptotic rates of the breast cancer cells in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of adenosine monophosphate-activated protein kinase （AMPK）， phosphorylated AMPK， Unc-51 like autophagy activating kinase 1 （ULK1）， phosphorylated ULK1， microtubule-associated protein 1 light chain 3A/B （LC3A/B）， and P62 proteins in the cells in various groups； immunofluorescence method was used to detected the expression level of LC3A/B protein in the breast cancer cells in various groups. Results The TCGA and HPA database results showed that the expression level of GPR139 mRNA in human breast cancer tissue was significantly higher than that in normal tissue （P<0.001）， and the expression level of GPR139 protein was significantly higher than that in normal tissue. The MTT assay results showed that compared with sh-NC group， the proliferation activities of the breast cancer cells in sh-GPR139 group and sh-NC+F05 group were significantly decreased （P<0.01）. The Western blotting results showed that compared with sh-NC group， the expression levels of GPR139， Ki67， Cyclin D1 and Cyclin E1 proteins in the breast cancer cells in sh-GPR139 group and sh-NC+F05 group were decreased （P<0.05 or P<0.01）， and the expression level of P21 protein was increased （P<0.01）. The RT-qPCR results showed that compared with sh-NC group， the expression levels of GPR139， Ki67， Cyclin D1 and Cyclin E1 mRNA in the breast cancer cells in sh-GPR139 group and sh-NC+F05 group were decreased （P<0.05 or P<0.01）， and the expression level of P21 mRNA was increased （P<0.01）. The flow cytometry results showed that compared with sh-NC group， the apoptotic rates of the breast cancer cells in sh-GPR139 group and sh-NC+F05 group were significantly increased （P<0.01）. The immunofluorescence results showed that in MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells， compared with sh-NC group， the expression levels of LC3A/B protein in the cells in sh-GPR139 group and sh-NC+F05 group were significantly increased （P<0.01）. The Western blotting results showed that compared with sh-NC group， the expression levels of LC3A/B， p-AMPK and p-ULK1 proteins in sh-GPR139 group and sh-NC+F05 group were significantly increased （P<0.01）， and the expression level of P62 protein was significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion Silencing GPR139 gene can induce autophagy and apoptosis of breast cancer cells and inhibit cell proliferation， and its mechanism may be related to the increased phosphorylation levels of AMPK and ULK1 in the cells.

Graphical abstract

关键词

乳腺癌 / G蛋白偶联受体139 / 细胞增殖 / 细胞凋亡 / 自噬 / 腺苷酸活化蛋白激酶

Key words

Breast cancer / G protein-coupled receptor 139 / Cell proliferation / Apoptosis / Autophagy / Adenosine monophosphate-activated protein kinase

乳腺癌是女性最常见的癌症类型，其占女性癌症死亡总数的6.10%^［1-2］。2022年全球乳腺癌新发病例数为230万例，全球乳腺癌死亡病例数为67万例^［3］。乳腺癌治疗以手术切除为主，但其复发率较高，为11.8%^［4-5］。因此深入探索并阐明乳腺癌发生发展机制可为乳腺癌的治疗提供新的作用靶点。G蛋白偶联受体139（G protein-coupled receptor 139，GPR139）是一种 G蛋白偶联受体蛋白，其基因位于16p12.3，相对分子质量为45 000。GPR139主要通过偶联Gα_q/11蛋白来激活下游钙离子和环磷酸腺苷等信号分子调节神经递质释放、能量代谢和摄食行为^［6-7］。研究^［8-9］显示：GPR139在多种肿瘤中高表达，通过激活细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）和蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）等信号通路促进肿瘤的增殖、存活和转移。目前GPR139在乳腺癌中的功能和作用机制还未见相关报道。本研究探讨沉默GPR139基因对乳腺癌细胞增殖、凋亡和自噬的影响并阐明其作用机制，为乳腺癌的治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1　细胞、主要试剂和仪器

人乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231（美国ATCC公司）。高糖培养基（美国Hyclone公司），胎牛血清和胰酶（美国Gibco公司），GPR139拮抗剂NCRW0005-F05（美国MCE公司），反转录试剂盒和qPCR试剂盒（日本TaKaRa公司），GPR139短发夹RNA （short hairpin RNA， shRNA）干扰慢病毒和阴性对照慢病毒（上海吉玛基因公司），qPCR引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］。噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium promide，MTT）和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（上海碧云天公司），二喹啉甲酸（2-quinolinecarboxylic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒、蛋白Marker、凝胶预混液和超敏化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒（上海雅酶生物公司），GPR139、Ki-67、细胞周期素（Cyclin）D1、Cyclin E1、P21和β-肌动蛋白（β-actin）抗体（英国 Abcam 公 司），微管相关蛋白1轻链3A/B（microtubule-associated protein 1 light chain 3A/B，LC3A/B）、P62、腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、磷酸化AMPK（phosphorylated-AMPK， p-AMPK）、Unc-51样自噬激活激酶1（Unc-51 like autophagy activating kinase 1， ULK1） 和 磷 酸 化ULK1（phosphorylated ULK1，p-ULK1）抗 体（美 国CST公司），荧光二抗（美国Thermo公司）。细胞恒温培养箱（型号：150i， 美国Thermo公司）， 曝光仪（型号：ChemiDoc XRS）和PCR仪（型号：CFX96）（美国Bio-Rad公司），流式细胞仪（型号：BD FACSCanto™ Ⅱ，美国BD公司）。

1.2　数据库资料分析

通过癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库^［10］ （https：//portal.gdc.cancer.gov/）下载乳腺癌转录组数据集TCGA-BRCA，其中正常组织113例，乳腺癌组织1 109例。使用R软件Limma（V3.60.3）包对TCGA-BRCA数据集进行分析，计算倍数变化（fold change，FC），以P<0.05、|log₂FC|>3为阈值筛选出差异表达基因GPR139。通过人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas，HPA）数据库^［11］（https：//www.proteinatlas.org/） 查找GPR139在乳腺癌组织和正常组织中的蛋白表达情况。

1.3　细胞培养、慢病毒感染和细胞分组

采用含10%胎牛血清和1%青-链霉素的高糖培养基培养MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞。将细胞置于37 ℃、5%CO₂培养箱中，待细胞生长至90%时胰酶消化传代。收集处于对数生长期的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔5×10⁵个细胞。第2天，采用慢病毒转染体系将shRNA分别转染MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞，分为sh-NC组（感染阴性对照慢病毒）和sh-GPR139组 （感染GPR139 shRNA干扰慢病毒），感染48 h。感染阴性对照慢病毒48 h后，消化细胞传代铺板，加入100 nmol·L^-1 GPR139拮抗剂NCRW0005-F05刺 激 细 胞 24 h 后 收 样， 即 为 sh-NC+F05 组（GPR139拮抗剂干预组）。

1.4　实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR， RT-qPCR）法检测各组细胞中GPR139、Ki-67、Cyclin D1、Cyclin E1和P21 mRNA表达水平

采用TRIzol法提取各组细胞中总RNA，按照TaKaRa反转录试剂盒合成cDNA。反转录条件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s。以cDNA为模板加入引物和TBgreen进行RT-qPCR反应。扩增条件：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，60 ℃、60 s，共40个循环。以β-actin为内参基因，采用2^-∆∆Ct法计算目的基因表达水平。引物序列见表1。

1.5　MTT法检测各组乳腺癌细胞增殖活性

将转染或F05刺激后的处于对数生长期的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞胰酶消化后计数，每孔4 000个细胞接种于96孔细胞培养板中，置于细胞培养箱中分别培养24、48和72 h。每孔加入5 g·L^-1 MTT工作液，继续孵育培养2 h后加入特定溶剂溶解甲臜，用酶标仪于波长570 nm处测定每孔吸光度（A）值，以A值表示细胞增殖活性。

1.6　Western blotting法检测各组乳腺癌细胞中GPR139、Ki-67、P21、LC3A/B、P62、p-AMPK、AMPK、p-ULK1和ULK1蛋白表达水平

用RIPA裂解液裂解不同处理的各组细胞，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r·min^-1离心15 min后取上清进行蛋白定量。取30 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）电泳后转印至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入GPR139（1∶1 000）、Ki-67（1∶1 000）、 P21（1∶1 000）、 LC3A/B（1∶1 000）、P62（1∶1 000）、p-AMPK（1∶500）、AMPK（1∶1 000）、 p-ULK1 （1 ∶ 1 000）、 ULK1 （1 ∶ 1 000） 和 β-actin（1∶3 000） 等抗体于4 ℃冰箱中过夜孵育。第2天，用Tris缓冲盐溶液-吐温20（Tris-buffered saline with Tween-20，TBST）溶液洗涤条带3次，每次10 min。加入1∶3 000稀释的二抗室温低速孵育1 h，用TBST溶液洗涤条带3次，每次10 min。加入超灵敏ECL化学发光液，用Bio-Rad成像系统进行曝光。采用Image J软件进行灰度分析，并计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/β-actin蛋白条带灰度值，实验重复3次。

1.7　流式细胞术检测各组乳腺癌细胞凋亡率

取处于对数生长期的各组乳腺癌细胞，1 000 r·min^-1离心5 min，收集细胞沉淀。加入磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）稀释的1%胎牛血清白蛋白洗涤重悬细胞，1 000 r·min^-1离心5 min，收集细胞沉淀。加入Binding buffer稀释的碘化丙啶（propidium iodide，PI）、异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白Ⅴ（annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate，Annexin Ⅴ-FITC） 流式抗体轻轻混匀， 室温避光孵育15 min。加入适量Binding buffer，上机检测细胞凋亡情况。早期凋亡细胞为FITC+和PI-，晚期凋亡细胞为FITC+和PI+。细胞凋亡率=（早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数）/细胞总数×100%。

1.8　免疫荧光法检测各组乳腺癌细胞中LC3A/B蛋白表达水平

各组细胞计数1×10⁵个，接种于12孔细胞培养板中，贴壁培养过夜。弃掉培养基，加入4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min。加入PBS缓冲液稀释的0.1% Triton X-100破膜15 min，PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min。加入PBS缓冲液稀释的1% BSA室温封闭30 min，加入LC3A/B一抗（1∶200）4 ℃冰箱低速孵育过夜。第2天，回收一抗，加入PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min，加入Alexa Fluor 488标记的荧光二抗（1∶400），室温避光孵育1 h后，加入DAPI染液对细胞核进行复染，PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min。在共聚焦显微镜100倍视野下拍照保存，绿色明亮斑点为染色阳性的自噬斑点，以荧光强度代表蛋白表达水平。

1.9　统计学分析

采用GraphPad Prism 9软件绘图和进行统计学分析。各组细胞中GPR139、Ki-67、Cyclin D1、Cyclin E1和P21 mRNA表达水平，细胞增殖活性，乳腺癌细胞中GPR139、Ki-67、P21、LC3A/B、P62、p-AMPK、AMPK、p-ULK1和ULK1蛋白表达水平，细胞凋亡率，细胞中LC3A/B蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　乳腺癌组织和正常组织中GPR139 mRNA表达水平

TCGA数据库资料分析结果显示：在人乳腺癌组织中GPR139 mRNA表达水平明显高于正常组织（P<0.001）。见图1A。HPA数据库中免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）检测结果显示：GPR139蛋白在正常组织中低表达，在乳腺癌组织中高表达。见图1B和1C。

2.2　各组乳腺癌细胞增殖活性

在MCF-7细胞中，与sh-NC组（0.803±0.033）比较，sh-GPR139组和sh-NC+F05组细胞的增殖活性（0.546±0.044和0.601±0.043） 明显降低（P<0.01）。在MDA-MB-231细胞中，与sh-NC组（0.662±0.030）比较，sh-GPR139组和sh-NC+F05组细胞的增殖活性（0.526±0.012和0.513±0.011）明显降低（P<0.01）。

2.3　各组乳腺癌细胞中GPR139、Ki-67、Cyclin D1、Cyclin E1和P21 mRNA及蛋白表达水平

RT-qPCR法检测结果显示：在MCF-7和MDA-MB-231细胞中，与sh-NC组比较，sh-GPR139组和sh-NC+F05组乳腺癌细胞中GPR139、Ki-67、Cyclin D1和Cyclin E1 mRNA表达水平降低（P<0.05或P<0.01），P21 mRNA表达水平升高（P<0.01）。见图2。Western blotting法检测结果显示：在MCF-7和MDA-MB-231细胞中，与sh-NC组比较，sh-GPR139组和sh-NC+F05组细胞中GPR139、Ki-67、Cyclin D1和Cyclin E1蛋白表达水平降低（P<0.05或P<0.01），P21蛋白表达水平升高（P<0.01），与RT-qPCR法检测结果一致。见图3、表2和表3。

2.4　各组乳腺癌细胞凋亡率

在MCF-7细胞中，与sh-NC组（2.663%±0.492%）比较，sh-GPR139组（8.260%±0.485%）和sh-NC+F05组（9.850%± 0.787%） 细胞凋亡率明显升高（P<0.01）。见图4A。在MDA-MB-231细胞中，与sh-NC组（2.750%±0.565%）比较，sh-GPR139组（8.663%± 0.125%） 和sh-NC+F05组 （7.970%±1.189%）细胞凋亡率均明显升高（P<0.01）。见图4B。

2.5　各组乳腺癌细胞中LC3A/B蛋白表达水平

在MCF-7细胞中，与sh-NC组（25.72±1.84）比较，sh-GPR139组（68.04±3.48）和sh-NC+F05组（64.45±2.70）细胞中LC3A/B蛋白表达水平升高（P<0.001）。在MDA-MB-231细胞中，与sh-NC组（17.29±2.34）比较，sh-GPR139组（49.92±3.26）和sh-NC+F05组（60.13±2.53）细胞中LC3A/B蛋白表达水平升高（P<0.001）。见图5。

2.6　各组乳腺癌细胞中LC3A/B、P62、p-AMPK、AMPK、p-ULK1和ULK1蛋白表达水平

在MCF-7细胞中，与sh-NC组比较，sh-GPR139组和sh-NC+F05组细胞中LC3A/B蛋白表达水平升高以及p-AMPK和p-ULK1蛋白表达水平升高（P<0.01），P62蛋白表达水平降低（P<0.01），AMPK和ULK1蛋白表达水平无明显改变，差异无统计学意义（P>0.05）。见图6A和6B。在MDA-MB-231细 胞 中，与sh-NC 组 比 较，sh-GPR139 组 和 sh-NC+F05组中LC3A/B蛋白表达水平升高以及p-AMPK和p-ULK1蛋白表达水平升高 （P<0.01），P62蛋白表达水平降低（P<0.05或P<0.01），AMPK和ULK1蛋白表达水平无明显改变，差异无统计学意义（P>0.05）。见图6A和6C。

3 讨 论

乳腺癌是全球女性健康的主要威胁，其发病率高，是女性癌症死亡的主要原因之一^［12］。近年来在乳腺癌的诊断和治疗方面取得了一定进展，但其高复发率和高死亡率仍然是临床面临的重大挑战^［13］。GPR139在胶质母细胞瘤、低级别胶质瘤、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤中高表达，通过激活环磷酸酰胺 （cyclic adenosine monophosphate， cAMP） 等反应元件促进肿瘤的增殖和转移^［7］。G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR）家族成员G蛋白偶联受体C组5成员A（G protein-coupled receptor class C group 5 member A，GPRC5A）在乳腺癌和结直肠癌中通过抑制表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）及其下游信号通路发挥抗肿瘤作用^［14］。GPCR是自噬的直接调节因子，GPCR家族蛋白毒蕈碱受体、β-肾上腺素受体和味觉受体等与自噬的关系已被广泛研究^［15-16］。

本研究结果显示：与正常组织比较，GPR139蛋白在乳腺癌组织中高表达。sh-GPR139组即沉默GPR139基因可明显降低乳腺癌细胞的增殖活性，抑制增殖标志物Ki-67、Cyclin D1和Cyclin E1的表达，促进P21的表达。sh-NC+F05组即GPR139拮抗剂NCRW0005-F05处理组通过竞争性结合，可短暂抑制GPR139蛋白表达，明显降低乳腺癌细胞的增殖活性，与sh-GPR139组结果类似。研究^［13］显示：Ki-67的高表达与乳腺癌细胞的增殖活性呈正相关关系，是评估乳腺癌患者预后的重要指标。Cyclin D1基因扩增或蛋白过表达与乳腺癌的进展和不良预后有关，具有促进乳腺癌发展的作用^［14］，与本研究结果类似。Cyclin E1蛋白可被长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）稳定，阻碍其泛素化降解，从而加速细胞周期的进程，使得乳腺癌细胞产生耐药性^［17］。研究^［18］显示：高表达的P21通过抑制Cyclin-周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，Cdk）复合物的活性，在G₁期诱导细胞周期阻滞，从而抑制乳腺癌细胞增殖。本研究结果提示：沉默GPR139基因可明显抑制乳腺癌细胞的增殖。

细胞自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程，通过溶酶体降解受损、衰老或过剩的生物大分子和细胞器，释放出游离小分子供细胞回收利用^［19-20］。细胞自噬在维持细胞稳态、应对营养应激和清除有害物质等过程中发挥关键作用^［21］。微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3， LC3）A/B是自噬过程中的核心蛋白，通过LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化参与自噬体的形成、底物识别和降解^［22］。LC3A/B是评估自噬活性的重要标志物，在细胞稳态、疾病发生和免疫防御中具有重要作用。本研究结果显示：沉默GPR139基因后，乳腺癌细胞中自噬蛋白LC3A/B蛋白表达水平升高，P62蛋白表达水平降低，AMPK和ULK1磷酸化水平升高。研究^［23-24］显示：P62的低表达可通过细胞周期阻滞和调节免疫细胞浸润进而抑制乳腺癌细胞的增殖，促进细胞凋亡。AMPK和ULK1磷酸化水平升高，启动AMPK/ULK1信号通路，激活细胞自噬，从而抑制乳腺癌细胞的增殖和转移^［25］，与本研究结果一致。本研究结果提示：沉默GPR139基因可诱导乳腺癌细胞自噬和凋亡，其作用机制可能与AMPK和ULK1磷酸化水平升高有关。

综上所述，GPR139在乳腺癌组织中呈高表达，沉默GPR139基因可抑制细胞增殖，促进乳腺癌细胞自噬和凋亡，其作用机制可能与AMPK和ULK1磷酸化水平升高有关。基于此，通过设计GPR139、Ki-67和Cyclin D1等分子的特异性抑制剂，AMPK和P21等分子的特异性激活剂或靶向治疗的核酸序列，有望抑制乳腺癌细胞的生长，为乳腺癌诊疗提供新思路。

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基金资助

国家自然科学基金青年科学基金项目(82303343)