RNA解旋酶DHX37基因不同功能结构域载体的构建及鉴定

Construction and identification of vectors with different functional domains of RNA helicase DHX37 gene

摘要

目的 通过在线网站和软件预测人源RNA解旋酶DHX37基因的功能结构域，构建其不同功能结构域缺失载体，并验证构建载体的正确性。 方法 以人源DEAH-box解旋酶37（hDHX37）质粒作为模板，基于同源重组克隆技术，应用SnapGene V 6.0.2软件设计截短体ATP结合结构域（ΔATP binding）、C末端结构域（CTD）、HA2亚基（HA2）和Oligos/Accharide结合折叠域（O/A binding fold）的功能结构域特异性引物；采用高保真DNA聚合酶Prime STAR GXL polymerase进行PCR 扩增截短体目的片段ATP binding、c-terminal-1、c-terminal-2、HA2-1、HA2-2和O/A binding fold；利用重组克隆试剂盒将截短体片段定向克隆至经双酶切的 pCMV-MCS-3×HA-Neo空载体；将重组载体转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞后，通过限制性内切酶Hind Ⅲ酶切、琼脂糖凝胶电泳和DNA测序验证功能结构域载体的正确性。 结果 PCR 法扩增的目的片段ATP binding（2 148 bp）、c-terminal-1（1 326 bp）、c-terminal-2（1 269 bp）、HA2-1（2 205 bp）、HA2-2（894 bp）和O/A binding（2 583 bp）长度与设计一致；Hind Ⅲ单酶切突变质粒ΔATP binding、Δc-terminal、ΔHA2和ΔO/A binding fold，得到线性化DNA片段，长度分别为8 939、7 589、8 036、8 540和8 027 bp，产物条带大小均与设计相符。DNA测序Blast对比分析，ΔATP binding缺失ATP binding结构域（1~442）、Δc-terminal缺失c-terminal结构域（443~735）、ΔHA2缺失HA2结构域（736~861）和ΔO/A binding fold缺失O/A binding fold结构域（862~1 158），分别缺失1 326、879、375和891 bp，各突变质粒缺失的结构域位置和长度与设计完全一致。 结论 成功构建hDHX37基因的ΔATP binding、Δc-terminal、ΔHA2和ΔO/A binding fold 4个不同功能结构域载体。

Abstract

Objective To discuss the functional domains of the human RNA helicase DHX37 gene predicted by online websites and software， to construct its different functional domain deletion vectors， and to verify the correctness of the constructed vectors 27. Methods Using the human DEAH-box helicase 37 （hDHX37） plasmid as a template， based on homologous recombination cloning technology， SnapGene V 6.0.2 software was used to design functional domain-specific primers for the truncations ATP binding domain （ATP binding）， C-terminal domain （CTD）， HA2 subunit （HA2）， and Oligos/Accharide binding fold domain （O/A binding fold）； prime STAR GXL polymerase， a high-fidelity DNA polymerase， was used to perform PCR amplification of the truncated target fragments ATP binding， c-terminal-1， c-terminal-2， HA2-1， HA2-2， and O/A binding； a recombination cloning kit was used to directionally clone the truncated fragments into the double-digested pCMV-MCS-3×HA-Neo empty vector； after transforming the recombinant vectors into E.coli DH5α competent cells， the correctness of the functional domain vectors was verified by restriction enzyme Hind Ⅲ digestion， agarose nucleic acid gel electrophoresis， and DNA sequencing. Results The lengths of the target fragments amplified by PCR， ATP binding （2 148 bp）， c-terminal-1 （1 326 bp）， c-terminal-2 （1 269 bp）， HA2-1 （2 205 bp）， HA2-2 （894 bp）， and O/A binding fold （2 583 bp）， were consistent with the design； Hind Ⅲ single enzyme digestion of the mutant plasmids ΔATP binding， Δc-terminal， ΔHA2， and ΔO/A binding fold yielded linearized DNA fragments with lengths of 8 939， 7 589， 8 036， 8 540， and 8 027 bp， respectively， and the product band sizes all matched the design. The DNA sequencing Blast comparative analysis results showed that ΔATP binding lacked the ATP binding domain （1-442）， Δc-terminal lacked the c-terminal domain （443-735）， ΔHA2 lacked the HA2 domain （736-861）， and ΔO/A binding fold lacked the O/A binding fold domain （862-1 158）， with deletions of 1 326， 879， 375， and 891 bp， respectively； the positions and lengths of the deleted domains in each mutant plasmid were completely consistent with the design. Conclusion The four different functional domain vectors of human DHX37 gene， ΔATP binding， Δc-terminal， ΔHA2， and ΔO/A binding fold， are successfully constructed.

Graphical abstract

关键词

DEAH-box解旋酶37 / 功能结构域载体 / 重组克隆 / 限制性酶切 / 聚合酶链式反应

Key words

DEAH-box helicase 37 / Functional domain vector / Recombinan clone / Restriction enzyme digestion / Polymerase chain reaction

RNA解旋酶作为一种重要的分子伴侣，通过调控转录、翻译和RNA剪接及转运等生物过程，广泛参与先天性免疫反应、肿瘤发生和炎症调控等一系列重要的生理过程^［1-3］。人源DEAH-box解旋酶37（human DEAH-box helicase 37，hDHX37）属于DEAH-box RNA解旋酶家族成员之一，其结构高度保守，具有特定的三维结构和功能域。DEAH-box RNA解旋酶家族由串联的 RecA 样结构域、C-末端结构域（C-terminal domain，CTD）和柔性连接子组成。串联的RecA样结构域是DHX37的核心结构，通常包含2个相似的亚结构域，亚结构域相互靠近形成一个整体，是发挥解旋酶活性的关键区域。该结构域中含有能与ATP特异性结合的氨基酸残基，ATP结合后在特定酶活性位点水解，释放能量供DHX37执行解旋等功能。CTD包括翼状螺旋（winged helix，WH）、螺旋束（helical-bundle，HB）和寡糖结合折叠（oligosaccharide binding，OB）子结构域。WH子结构域可与特定的RNA序列或结构特异性结合，DHX37精准定位到需要解旋的RNA区域。HB子结构域有助于维持DHX37整体结构的稳定性，并可能参与其他蛋白质或RNA分子的相互作用。OB子结构域能够与寡糖分子或其他小分子配体结合，调节DHX37的活性和其他分子的相互作用^［4-6］。上述结构域赋予DHX37动态参与RNA代谢的功能。细胞周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）是由人类CCND1基因编码的一种蛋白质，位于人类染色体11q13.3区域。CCND1是细胞周期中的关键调节因子，主要功能是促进细胞从G₁期进入S期，从而调控细胞增殖。研究^［7］表明：DHX37与多效调控因子1（pleiotropic regulator 1，PLRG1）相互作用，通过其启动子和超级增强子元件的共占用，转录激活CCND1的表达，促进肝癌细胞增殖，并与肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者不良预后有关。DHX37还参与核糖体的生物合成^［8-9］、抗病毒应答和免疫调控^［10］。在T淋巴细胞中敲除DHX37增强了抗体特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CD8⁺T）细胞对体内三阴性乳腺癌的抗肿瘤活性。DHX37与核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65和程序性死亡11（programmed cell death 11，PDCD11）相互作用，并调节CD8⁺T细胞中NF-κB通路的活性，抑制CD8⁺T细胞在抗原刺激下的活性^［11］。生物信息学分析进一步揭示DHX37在肝癌等恶性肿瘤中呈现高表达特征，且与肿瘤免疫微环境重塑存在密切关联^［12-13］，证实了其作为治疗靶点的潜在价值。然而，目前对于DHX37在影响肿瘤的发生和免疫调节中的结构域基础及分子机制的研究尚未完全阐明。本课题组前期研究^［14］显示：DHX37的高表达是导致HCC预后不良的独立危险因素，且靶向DHX37可提高化疗药物对HCC的敏感性，因此DHX37有望成为抑制肿瘤发展的潜在靶点，有助于提高抗肿瘤免疫治疗效果。为深入探讨DHX37功能结构域与其肿瘤调控活性的因果关系，本研究通过同源重组技术构建其ATP结合结构域（ATP binding domain，ATP binding）、CTD（包括c-terminal-1 和 c-terminal-2）、 HA2 亚 基 （HA2 subunit，HA2）和 Oligos/Accharide 结 合 折 叠 域（O/A binding fold domain，O/A binding fold）载体，为进一步阐明DHX37的生物学功能并在后续实验中探讨其调控机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1　细胞、主要试剂和仪器

人胚肾细胞HEK293T细胞系购于美国模式菌种收集中心。pCMV-hDHX37-3×HA-Neo质粒购于武汉淼灵生物科技有限公司，大肠杆菌DH5α 购于北京全式金生物技术有限公司，单片段重组克隆试剂盒、快速克隆试剂盒、DNA凝胶纯化回收试剂盒和质粒抽提试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；预混型高保真PCR酶（PrimeSTAR^® GXL Premix）、Quick Cut Hind Ⅲ、Quick Cut Xho Ⅰ和Marker（北京宝日医生物技术有限公司），GelRed核酸染料（苏州优逸兰迪生物科技有限公司），BsmB Ⅰ（北京纽英伦生物技术有限公司）。Nano Drop 2000超微量分光光度计（美国赛默飞世尔科技公司）， T100^TM PCR仪 （美国伯乐公司），Bio-Rad凝胶成像仪（美国伯乐公司）。

1.2　引物设计及DNA片段制备

应用SnapGene V 6.0.2软件设计特异性引物，使插入DNA片段5'端和3'端带有载体两端15~25 bp的重叠序列，引物序列见表1。以hDHX37为模板，PCR法扩增各目的DNA片段。PCR法反应体系总体积50 μL：hDHX37质粒1 μL、GXL Buffer 10 μL、上游引物（10 μmol·L^-1）1 μL、下游引物（10 μmol·L^-1）1 μL、dNTP Mix 4 μL、Prime STAR GXL polymerase 1 μL和ddH₂O 32 μL。反应条件：变性98 ℃、 10 s；70 ℃~60 ℃、 梯度退火；68 ℃、 1 min/kb延伸，共30个循环，产物4 ℃暂存。将扩增的目的产物利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物条带长度是否与设计相符。切取带有目的条带的胶，加入PC溶液，水浴至胶融化。将液体转入吸附柱中，放置3 min，12 000 r·min^-1离心60 s，弃掉管底的液体；吸附柱中加入漂洗液600 μL，12 000 r·min^-1离心60 s，弃掉管底液体；用漂洗液重复漂洗1次，弃掉管底液体；12 000 r·min^-1离心2 min，将吸附柱转至新离心管中，静置10 min；吸附柱中加入50 μL ddH₂O，放置2 min，12 000 r·min^-1离心2 min；将离心管底部的溶液重新加到吸附柱中，放置2 min，12 000 r·min^-1离心2 min。离心管底部溶液即高纯度的DNA溶液，Nano Drop 2000超微量分光光度计检测DNA浓度。

1.3　酶切及线性化载体的制备

hDHX37质粒经Quick Cut Hind Ⅲ/Quick cut Xho Ⅰ双酶切。酶切反应体系：10×Quick Cut Buffer 5 μL、hDHX37 5 μL（约5 μg）、 Quick Cut Hind Ⅲ 5 μL、 Quick cut XhoⅠ 5 μL，加ddH₂O至50 μL。将体系混匀后瞬离，30 ℃恒温水浴锅中反应15 min。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，经胶回收，获得hDHX37的线性化载体pCMV-hDHX37-3×HA-Neo（vector）。

1.4　载体与目的片段的重组克隆

为将片段定向克隆至pCMV-MCS-3×HA-Neo（vector）空载体中，利用Easy Geno快速重组试剂盒构建hDHX37基因的4个不同功能结构域缺失的载体。构建过程见图1。重组克隆实验体系：vector 1 μL、插入片段（表2）、2×EasyGeno组装混合液（2×EasyGeno Assembly Mix）5 μL、ddH₂O补至10 μL。共4个重组克隆实验体系，其中ATP binding和O/A binding是单片段克隆重组体系，是2个重组克隆体系，c-terminal-1和c-terminal-2；HA2-1和HA2-2是多片段重组克隆体系，是2个重组体系。DNA与vector摩尔比为3∶1，vector 50 ng，各DNA加入量见表2，共4个重组克隆样品；50 ℃恒温水浴锅，反应15 min。瞬时离心，用于后续实验。

1.5　突变载体的转化

取-80 ℃保存的DH5α 感受态细胞冰上融化，将“1.4”的产物分别吸取5 μL加入到DH5α 中。混合均匀，冰上放置30 min；42 ℃恒温水浴锅中热击90 s；冰浴2 min；加入0.9 mL溶菌肉汤（Luria-Bertani，LB）（不含氨苄青霉素）培养基；将离心管置于37 ℃恒温摇床，200 r·min^-1摇菌1 h。3 000 r·min^-1离心2 min，留100 μL悬液混匀，涂布棒分别将样品涂布至LB固体培养基（含100 mg·L^-1氨苄青霉素），将平板倒置于37 ℃恒温培养箱中过夜。挑选单克隆，置于含50 mg·L^-1氨苄青霉素的LB培养基中，置于37 ℃恒温摇床，180 r·min^-1振荡12 h，过夜扩大培养。

1.6　突变载体的抽提和测序

将过夜培养的菌液12 000 r·min^-1离心60 s，尽量吸除上清；向沉淀菌体中加入250 μL的溶液P1，涡旋振荡使沉淀悬浮；加入250 μL的溶液P2，温和翻转6次，室温放置2 min，使菌体充分裂解；加入350 μL溶液P3，温和上下翻转离心管6次，可见白色絮状沉淀；12 000 r·min^-1离心10 min；将上清吸至过滤柱内，过滤柱放入收集管中，室温放置2 min，12 000 r·min^-1离心60 s，弃除底部液体；在过滤柱内加入750 μL漂洗液，12 000 r·min^-1离心60 s，弃除底部液体，在过滤柱内加入 750 μL 漂洗液再漂洗 1 次；12 000 r·min^-1离心2 min，室温静置10 min；将过滤柱转至新的离心管中，向过滤柱中加入50 μL ddH₂O，放置2 min，12 000 r·min^-1离心2 min；将底部溶液重新加到过滤柱中，放置2 min，12 000 r·min^-1离心2 min，离心管底部溶液即突变载体溶液。分别取5 μL样品送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

2 结 果

2.1　获得的目的DNA片段

以hDHX37（8 939 bp）为模板，采用特异性的引物通过PCR法分别扩增6个DNA片段（图2）。分别为ATP binding（2 148 bp）、c-terminal-1（1 326 bp）、c-terminal-2（1 269 bp）、HA2-1（2 205 bp）、HA2-2（894 bp）和O/A binding fold（2 583 bp）。各目的片段长度与设计一致，成功制备了6个DHX37基因不同功能结构域的片段。

2.2　核酸电泳法鉴定不同结构域的载体

hDHX37及各突变载体模式见图3。根据hDHX37功能结构域缺失的位置，突变载体分别命名为ΔATP binding、Δc-terminal、ΔHA2和ΔO/A binding fold，其中ΔATP binding和ΔO/A binding fold为单片段重组克隆实验构建，Δc-terminal和 ΔHA2为多片段重组克隆实验构建。hDHX37及各突变质粒ΔATP binding、Δc-terminal、ΔHA2和 ΔO/A binding fold经Hind Ⅲ单酶切，得到线性化DNA片段， 长度分别为8 939、 7 589、 8 036、 8 540和8 027 bp。琼脂糖凝胶电泳结果（图4）显示：hDHX37各突变载体ΔATP binding、Δc-terminal、ΔHA2和ΔO/A binding fold的片段长度与NCBI设计一致，表明目的片段与载体连接成功，hDHX37的4个突变载体构建成功。

2.3　DNA测序鉴定不同结构域载体

经核酸电泳初步验证的4个突变载体（ΔATP binding、Δc-terminal、ΔHA2 和 ΔO/A binding fold），分别取5 μL送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行DNA测序。应用SnapGene V 6.0.2软件分析DNA序列，DNA测序Blast对比分析结果显示：ΔATP binding缺失ATP binding结构域（1~442）、Δc-terminal缺失c-termina结构域（443~735）、ΔHA2缺失HA2结构域（736~861）和ΔO/A binding fold缺失O/A binding fold结构域（862~1 158），分别缺失1 326、879、375和891 bp（图5），表明hDHX37各突变载体缺失结构域位置和长度与NCBI设计一致，再次验证hDHX37的4个突变载体构建成功。

3 讨 论

DHX37作为高度保守的DEAH-box RNA解旋酶家族中至关重要的一员，在众多不同的RNA代谢过程中发挥关键的调控功能^［15］。研究^［4，16］显示：DHX37不仅参与转录调控、翻译过程、翻译后修饰和RNA剪接以及转运等一系列基本的生物过程，还可能通过影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等对肿瘤的发展起到促进或抑制作用^［17］。通过对癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）中肝细胞性肝癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）数据集的分析，同时结合已有文献报道，发现DHX37在肝癌组织中呈显著高表达，且其表达水平与患者预后情况呈明显负相关关系（P<0.01），证实了DHX37在HCC中的促癌功能^{［13，18］}，最新研究^［14］也揭示了DHX37在调节先天性免疫反应和炎症过程中的重要作用，提示其可能作为肿瘤免疫治疗的潜在靶点。尽管DHX37在肿瘤发生和免疫调控中的重要性已得到初步证实，但其具体分子调控机制，特别是功能结构域与靶蛋白的相互作用网络^［13-14］仍未完全阐明，限制了研究者对其生物学功能的全面理解。

为了系统解析DHX37不同功能结构域在蛋白质相互作用网络中的具体作用，首先基于UniProt蛋白质数据库（https：//www.uniprot.org/）的预测信息和相关文献^［19-20］报道，确定了DHX37蛋白的4个进化保守的关键功能结构域：①ATP binding，包含Walker A/B基序，负责ATP结合和水解功能；②CTD，由WH、HB和OB亚基组成，参与RNA识别与分子互作；③HA2结构域，介导蛋白质复合物组装；④O/A binding fold，决定底物特异性识别。本文作者以NCBI数据库中的hDHX37基因序列（NM_032656.4）为模板，通过高保真PCR扩增获得编码区全长片段，将其克隆至pCMV-MCS-3×HA-Neo载体中，经测序和酶切验证成功构建了hDHX37野生型过表达载体^［21］。本文作者采用结构域特异性缺失策略，针对每个功能结构域设计特异性扩增引物，通过PCR扩增获得相应的缺失突变体片段。使用Quick Cut Hind Ⅲ和Quick Cut Xho Ⅰ双酶切系统处理空载体，并通过快速重组克隆技术将扩增的片段插入载体中，经转化、筛选和质粒提取后，通过Sanger测序和酶切验证，成功构建了ΔATP binding、Δc-terminal、ΔHA2和ΔO/A-binding fold 4个结构域缺失突变体^［22-23］。

本研究的创新之处在于系统构建了DHX37不同关键功能结构域的载体，为深入解析DHX37与靶蛋白相互作用的分子机制提供了重要的实验工具。上述载体的成功构建不仅有助于阐明DHX37各功能结构域在RNA代谢和信号转导中的具体作用，还将为揭示DHX37在肿瘤发生、免疫调控和炎症反应中的分子机制提供新的研究思路。在后续研究中，本课题组将利用上述突变体开展蛋白质相互作用组学分析，以期全面解析DHX37的功能网络，为开发基于DHX37的肿瘤治疗策略提供理论依据。

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基金资助

国家自然科学基金项目(81802456)

陕西省科技厅自然科学基金面上项目(2024JC-YBMS-691)