GRIK2过表达对七氟烷暴露幼鼠空间学习和记忆能力的改善作用及其机制

Improvement effect of GRIK2 overexpression on spatial learning and memory ability of sevoflurane-exposed young rats and its mechanism

摘要

目的 探讨过表达红藻氨酸受体亚基（GluK）2对于七氟烷（Sevo）暴露幼鼠空间学习和记忆能力的改善作用，并阐明其可能的分子机制。 方法 将44只C57BL/6J新生仔鼠随机分为对照组、Sevo组、Sevo+OE-NC组（病毒空载组）和Sevo+OE-GRIK2组（GRIK2过表达组）。分子实验每组3只，行为学实验每组8只。Morris水迷宫实验检测各组幼鼠的逃避潜伏期、在目标象限停留时间和穿越隐藏平台次数。仔鼠于出生后第6天（P6）构建Sevo麻醉模型，免疫荧光法观察各组幼鼠海马组织中GluK2蛋白表达情况及病毒转染情况。Western blotting法检测各组幼鼠海马组织中钠钾氯转运体1（NKCC1）、钾氯共转运体2（KCC2）和GluK2蛋白表达情况。 结果 Morris水迷宫实验训练第3、4和5天，与对照组比较，Sevo组幼鼠逃避潜伏期明显延长（P<0.05或P<0.01）。Morris水迷宫实验训练第4和5天，与Sevo组比较，Sevo+OE-GRIK2组幼鼠逃避潜伏期明显缩短（P<0.05或P<0.01）；与Sevo+OE-NC组比较，Sevo+OE-GRIK2组幼鼠逃避潜伏期明显缩短（P<0.05或P<0.01）。与对照组比较，Sevo组幼鼠在目标象限停留时间减少（P<0.05）；与Sevo组比较，Sevo+OE-GRIK2组幼鼠在目标象限停留时间增加（P<0.01）；与Sevo+OE-NC组比较，Sevo+OE-GRIK2组幼鼠在目标象限停留时间增加（P<0.01）。与对照组比较，Sevo组幼鼠穿越隐藏平台次数减少（P<0.001）；与Sevo组比较，Sevo+OE-GRIK2组幼鼠穿越隐藏平台次数增加（P<0.001）；与Sevo+OE-NC组比较，Sevo+OE-GRIK2组幼鼠穿越隐藏平台次数增加（P<0.001）。免疫荧光法，与对照组比较，Sevo组幼鼠海马组织中GluK2蛋白荧光强度降低（P<0.05）；与Sevo组比较，Sevo+OE-GRIK2组幼鼠海马组织中GluK2蛋白荧光强度升高（P<0.01）；与Sevo+OE-NC组比较，Sevo+OE-GRIK2组幼鼠海马组织中GluK2蛋白荧光强度升高（P<0.01）。Western blotting法，与对照组比较，Sevo组幼鼠海马组织中KCC2和GluK2蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.001），NKCC1/KCC2比值明显升高（P<0.05）；与Sevo组比较，Sevo+OE-GRIK2组幼鼠海马组织中KCC2和GluK2蛋白表达水平升高（P<0.001），NKCC1/KCC2比值降低（P<0.05）；与Sevo+OE-NC组比较，Sevo+OE-GRIK2组幼鼠海马组织中KCC2和GluK2蛋白表达水平升高（P<0.001），NKCC1/KCC2比值降低（P<0.05）。 结论 GRIK2过表达使Sevo暴露的仔鼠海马组织中GluK2和KCC2蛋白表达上调，改善幼鼠空间学习和记忆能力，其机制可能与降低海马组织中NKCC1/KCC2比值有关。

Abstract

Objective To discuss the improvement effect of overexpressing kainate receptor subunit （GluK） 2 on the spatial learning and memory abilities of juvenile mice exposed to sevoflurane （Sevo）， and to clarify its possible molecular mechanism. Methods A total of 44 C57BL/6J neonatal mice were randomly divided into control group， Sevo group， Sevo+OE-NC group （virus empty vector group）， and Sevo+OE-GRIK2 group （GRIK2 overexpression group）. There were 3 mice in each group for molecular experiments and 8 mice in each group for behavioral experiments. Morris water maze test was used to detect the escape latency， the residence time in the target quadrant， and the number of platform crossings of the juvenile mice in various groups. The Sevo anesthesia model was established in the mice on postnatal day 6 （P6）； immunofluorescence method was used to observe the expression of GluK2 protein and the virus transfection situation in hippocampus tissue of the juvenile mice in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of sodium-potassium-chloride cotransporter 1 （NKCC1）， potassium-chloride cotransporter 2 （KCC2）， and GluK2 proteins in hippocampus tissue of the juvenile mice in various groups. Results The Morris water maze test results showed that on days 3， 4， and 5 of training， compared with control group， the escape latency of the young mice in Sevo group was significantly prolonged （P<0.05 or P<0.01）. The Morris water maze test results showed that on days 4 and 5 of training， compared with Sevo group， the escape latency of the young mice in Sevo+OE-GRIK2 group was significantly shortened （P<0.05 or P<0.01）； compared with Sevo+OE-NC group， the escape latency of the young mice in Sevo+OE-GRIK2 group was significantly shortened （P<0.05 or P<0.01）. The Morris water maze test results showed that compared with control group， the residence time in the target quadrant of the young mice in Sevo group was decreased （P<0.05）； compared with Sevo group， the residence time in the target quadrant of the young mice in Sevo+OE-GRIK2 group was increased （P<0.01）； compared with Sevo+OE-NC group， the residence time in the target quadrant of the young mice in Sevo+OE-GRIK2 group was increased （P<0.01）. The Morris water maze test results showed that compared with control group， the number of platform crossings of the young mice in Sevo group was decreased （P<0.001）； compared with Sevo group， the number of platform crossings of the young mice in Sevo+OE-GRIK2 group was increased （P<0.001）； compared with Sevo+OE-NC group， the number of platform crossings of the young mice in Sevo+OE-GRIK2 group was increased （P<0.001）. The immunofluorescence results showed that compared with control group， the expression level of GluK2 protein in hippocampus tissue of the young mice in Sevo group was decreased （P<0.05）； compared with Sevo group， the expression level of GluK2 protein in hippocampus tissue of the young mice in Sevo+OE-GRIK2 group was increased （P<0.01）； compared with Sevo+OE-NC group， the expression level of GluK2 protein in hippocampus tissue of the young mice in Sevo+OE-GRIK2 group was increased （P<0.01）. The Western blotting results showed that compared with control group， the expression levels of KCC2 and GluK2 proteins in hippocampus tissue of the young mice in Sevo group were decreased （P<0.05 or P<0.01）， and the NKCC1/KCC2 ratio was increased （P<0.05）； compared with Sevo group， the expression levels of KCC2 and GluK2 proteins in hippocampus tissue of the young mice in Sevo+OE-GRIK2 group were increased （P<0.001）， and the NKCC1/KCC2 ratio was decreased （P<0.05）； compared with Sevo+OE-NC group， the expression levels of KCC2 and GluK2 proteins in hippocampus tissue of the young mice in Sevo+OE-GRIK2 group were increased （P<0.001）， and the NKCC1/KCC2 ratio was decreased （P<0.05）. Conclusion Overexpression of GRIK2 upregulates the expression levels of GluK2 and KCC2 proteins in hippocampus tissue of Sevo-exposed juvenile mice and improves the spatial learning and memory abilities of juvenile mice， and its mechanism may be related to reducing the NKCC1/KCC2 ratio in hippocampus tissue.

Graphical abstract

关键词

七氟烷 / 全麻药物 / 红藻氨酸受体亚基2 / 钠钾氯转运体1 / 钾氯共转运体2

Key words

Sevoflurane / General anesthetics / Kainate receptor subunit 2 / Sodium-potassium-chloride cotransporter 1 / Potassium-chloride cotransporter 2

随着舒适化医疗的普及，许多婴幼儿选择在全麻药物的诱导下进行手术或者操作治疗，全麻药物对于大脑发育的影响越来越受到广泛关注。七氟烷（sevoflurane，Sevo）作为临床上常见的麻醉药物，因其相对安全和快速诱导恢复的特性常被应用于婴幼儿的全身麻醉诱导。虽然幼年单次或短暂吸入Sevo已经被证实不会对大脑发育产生影响^［1-2］。然而近期的研究^［3］表明：反复或长时程暴露于Sevo会引起儿童成年后精细活动和数学能力障碍，然而其具体的病理学机制尚不明确。谷氨酸能和γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）能信号传递的相互作用对于促进神经网络突触连接的精细化和成熟至关重要。神经递质传递平衡的损害可能导致多种神经发育和精神疾病^［4-6］。红藻氨酸受体亚基（glutamate receptors，GluK）2是由其基因GRIK2所编码的离子型谷氨酸通道亚基，研究^［7］表 明：GluK2与钾氯共转运体2（K⁺-Cl^- co-transporter 2，KCC2）相互作用，调节其在海马区神经元的转运和表达。KCC2与钠钾氯转运体1（Na⁺-K⁺-Cl^- co-transporter 1，NKCC1）是氯离子转运蛋白，其表达平衡维持着神经元内外的氯离子稳态^［8］。在大脑发育早期，神经元NKCC1的表达较KCC2多，导致细胞内高氯状态，GABA因此产生去极化的兴奋性电刺激，这种机制具有增强发育期神经网络兴奋性的作用^［9-10］。相关研究^［11］表明：Sevo暴露的小鼠在麻醉诱导期和恢复期海马区含GluK2亚基的红藻氨酸受体（kainic acid receptors，KARs）过表达，小鼠在恢复期产生癫痫的异常行为。然而，其具体的机制尚需要深入探讨。基于以上理论依据，本研究通过建立Sevo长时程暴露麻醉模型，通过观察小鼠在出生后第14天（P14）海马组织中KCC2、NKCC1和GluK2蛋白的表达情况，采用腺相关病毒转染技术调控GluK2表达，并基于观察NKCC1/KCC2比值及小鼠成年后的行为学改变进一步探讨Sevo长时程麻醉所致神经发育毒性的具体病理学机制，为疾病提供新的研究靶点和治疗思路。

1 材料与方法

1.1　实验动物、主要试剂和仪器

20只SPF级繁育雌鼠C57BL/6J（8周龄）购自北京斯贝福生物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（新）2023-0003。动物饲养于石河子大学实验动物中心，动物使用许可证号：SYXK（新）2023-0003。饲养期间维持恒定温度（24 ℃±2 ℃），维持相对湿度（60%±5%），光照/黑暗交替时间控制在12 h/12 h。所有动物在饲养期间均被提供充足的水和食物，母鼠繁育后与幼崽同笼继续饲养，直至幼崽出生后第21天分笼。每笼3~4只幼崽。在整个动物实验中尽最大限度缓解动物的痛苦，实验由石河子大学实验动物伦理委员会批准（伦理学批准号：A2023-233-98），并严格遵守石河子大学动物实验要求与准则。Sevo购自华中海威基因科技有限公司，双辛可宁酸测定法（bicinchoninic acid assay，BCA）试剂盒和GluK2抗体购自美国赛默飞世尔有限公司，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染液、KCC2抗体、NKCC1抗体和异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）山羊抗兔IgA抗体购自美国Abcam公司，辣根酶标记山羊抗兔IgG和辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥公司，rAAV-hSyn-Grik2-mCherry和rAAV-hSyn-mCherry购自武汉枢密公司，聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜购自北京索莱宝公司，组织固定液、电泳缓冲液干粉和电转电泳缓冲液干粉购自武汉赛维尔公司。微量注射泵购自深圳瑞沃德公司，小鼠脑立体定位仪（型号：71001-S） 购自瑞沃德公司，动物行为分析系统V3.0（型号：ID26G）购自北京众实迪创公司，荧光显微镜（型号：LSM880）购自德国蔡司公司。

1.2　仔鼠Sevo麻醉、实验分组和处理

采用随机数字表法将44只C57/BL6J幼鼠随机分为4组，即对照组、Sevo组、Sevo麻醉+病毒空载对照组（Sevo+OE-NC组）和Sevo麻醉+GRIK2过表达组（Sevo+OE-GRIK2组）；分子实验每组3只，行为学实验每组8只。具体处理：①对照组，仔鼠出生后第6天接受6 h的30% O₂和70% N₂处理，处理结束后放回母鼠笼内，等待至P21分笼，在P27进行Morris水迷宫实验。②Sevo组，仔鼠出生后第6天接受6 h的3% Sevo暴露处理，结束后放回母鼠笼内，等待至P21分笼，在P27进行Morris水迷宫实验。③Sevo+OE-NC组，仔鼠在出生当天接受rAAV-hSyn-mCherry注射，在出生后第6天接受6 h的3% Sevo暴露处理，待翻正反射恢复，放回母鼠笼内，等待至P21分笼，在P27进行Morris水迷宫实验。④Sevo+OE-GRIK2组，仔鼠在出生当天接受rAAV-hSyn-Grik2-mCherry病毒注射，在出生后第6天接受6 h的3% Sevo暴露处理，结束后放回母鼠笼内，等待至P21分笼，在P27进行Morris水迷宫实验。

仔鼠出生后第6天与母鼠暂时分离，放入一个特制的动物麻醉箱（20 cm×20 cm×40 cm），箱底部铺上石灰石用于吸收呼出的CO₂。麻醉设备安装依次为制氧机、空气泵、麻醉挥发罐、麻醉诱导箱和麻醉药浓度监测仪。设置Sevo浓度为3%，对照组为30% O₂和70% N₂持续暴露6 h。麻醉期间观察仔鼠的呼吸频率和皮肤颜色以确保仔鼠在麻醉期间不会缺氧。麻醉后整窝放入母鼠笼内，等待后续的实验操作。

1.3　脑立体定位海马区注射rAAV

实验方案基于现有的文献^［12］描述，稍作调整。将刚出生的仔鼠置于冰上冷冻麻醉5~6 min，放置在脑立体定位上固定其头部，由于小鼠前囟点未发育完全，故以后囟点为定位原点，注射过表达病毒rAAV-hSyn-Grik2-mCherry与病毒载具rAAV-hSyn-mCherry，仔鼠海马区注射坐标为后囟向前1 mm，左右旁开1 mm，深度1.2 mm。注射速度为100 nL·min^-1，注射量为每侧海马区500 nL，注射完毕后针头留置5 min，缓慢移除。

1.4　Morris水迷宫检测各组幼鼠空间学习和记忆能力

水迷宫场地为直径120 cm、深度15 cm的圆型水池，隐藏平台为直径10 cm、高度6 cm的圆柱。实验开始前，将28 ℃~29 ℃的水加到隐藏平台上1~2 cm，在水迷宫的4个象限悬挂不同颜色的导航图形，并将幼鼠提前放入行为学室适应30 min。实验分为2个部分：定向巡航实验和空间探索实验。①定向巡航实验：此实验目的为评估幼鼠的学习能力，实验周期为5 d。将幼鼠依次从4个象限放入水池中，同时跟踪计时60 s，如在60 s内幼鼠未找到隐藏平台则记录60 s，并用引导棒将幼鼠引导至隐藏平台，任其停留记忆1 min后拿出，待烘干毛发，放回鼠笼。②空间探索实验：此实验目的为评估幼鼠空间记忆能力，实验周期为1 d，在定向巡航实验结束后1 d进行。撤去隐藏平台，将幼鼠从随机1个象限放入水池，跟踪记录60 s，最后评估其穿越隐藏平台区域次数。

1.5　免疫荧光法检测各组幼鼠海马组织中GluK2蛋白表达情况

P14仔鼠深度麻醉后开胸灌流，于冰上快速取脑，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗后放入4%多聚甲醛溶液固定后冷冻切片。切片从冰箱取出复温30 min，PBS缓冲液冲洗3遍，放入5%胎牛血清中封闭过夜，PBS缓冲液冲洗3遍后滴加抗GluK2抗体（1∶200）后放入4 ℃冰箱孵育过夜。PBS缓冲液冲洗3次后滴加山羊抗兔IgG（1∶200）后放入38 ℃水浴中避光孵育2 h，PBS缓冲液清洗二抗，滴加配置好的DAPI溶液，染核5 min。滴加抗荧光衰减封片剂后封片，待显微镜观察。

1.6　Western blotting法检测各组幼鼠海马组织中NKCC1、KCC2和GluK2蛋白表达水平

仔鼠于P14深度麻醉后开胸灌流，于冰上快速取海马组织，PBS缓冲液清洗后加入匀浆。采用BCA法测定蛋白浓度后于100 ℃水域煮10 min以固定，冷却后放入冰箱。经过上样、电泳、电转后用5%脱脂奶粉封闭2 h，Tris缓冲盐吐温溶液（Tris-buffered saline with Tween^® 20，TBST）清洗后滴加配置好的内参抗体GAPDH（1∶1 000），抗KCC2（1∶1 500），抗NKCC1（1∶1 500），-4 ℃摇床过夜。清洗一抗，滴加山羊抗兔IgG（1∶2 000），室温2 h，TBST溶液清洗后按A液∶B液为1∶1加入配置好的发光液，充分接触PVDF膜后上机曝光。采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平＝目的蛋白条带灰度值/GAPDH蛋白条带灰度值。

1.7　统计学分析

采用GraphPad Prism 10.1.2软件进行统计学分析。各组幼鼠逃避潜伏期时间、穿越象限次数、象限停留时间以及各组幼鼠海马组织中GluK2、NKCC1和KCC2蛋白表达水平均符合正态分布，以\overline{x}±s表示，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用Dunnett’t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　各组幼鼠的学习能力

Morris水迷宫实验结果显示：在定向巡航实验的第1和2天各组小鼠逃避潜伏期比较差异无统计学意义（P>0.05）。第3和4天，与对照组比较，Sevo组小鼠逃避潜伏期延长（P<0.01）；第5天，与对照组比较，Sevo组小鼠逃避潜伏期延长（P<0.05）。第1~5天，与Sevo组比较，Sevo+OE-NC组小鼠逃避潜伏期无明显改变，差异无统计学意义（P>0.05）。第4天，与Sevo组比较，Sevo+OE-GRIK2组小鼠逃避潜伏期缩短（P<0.01）；与Sevo+OE-NC组比较，Sevo+OE-GRIK2组小鼠逃避潜伏期缩短（P<0.01）。第5天，与Sevo组比较，Sevo+OE-GRIK2组小鼠逃避潜伏期缩短（P<0.05）；与Sevo+OE-NC组比较，Sevo+OE-GRIK2组小鼠逃避潜伏期缩短（P<0.05）。见图1和表1。

2.2　各组幼鼠空间记忆能力

Morris水迷宫空间探索能力检测结果显示：与对照组比较，Sevo组幼鼠在目标象限停留时间减少（P<0.05），穿越隐藏平台次数减少（P<0.01）。与Sevo组比较，Sevo+OE-NC组幼鼠在目标象限停留时间和穿越隐藏平台次数无明显改变，差异无统计学意义（P>0.05）。与Sevo组比较，Sevo+OE-GRIK2组幼鼠目标象限停留时间增加（P<0.01），穿越隐藏平台次数增加（P<0.001）；与Sevo+OE-NC组比较，Sevo+OE-GRIK2组幼鼠在目标象限停留时间增加（P<0.01），穿越隐藏平台次数增加（P<0.001）。见图2和表2。

2.3　各组幼鼠海马组织中NKCC1、KCC2和GluK2蛋白表达水平以及NKCC1/KCC2比值

Western blotting法检测结果显示：与对照组比较，Sevo组幼鼠海马组织中NKCC1蛋白表达水平无明显改变，差异无统计学意义（P>0.05）；Sevo组幼鼠海马组织中KCC2和GluK2蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.001）；Sevo组幼鼠海马组织中NKCC1/KCC2比值明显升高（P<0.05）。见图3。

2.4　各组幼鼠海马组织中GluK2蛋白表达情况

在荧光显微镜下观察病毒转染情况，可见病毒扩散至小鼠海马区，病毒表达为红色荧光，蓝色为神经元细胞核。免疫荧光法检测结果显示：与对照组比较，Sevo组幼鼠海马组织中GluK2蛋白荧光强度降低（P<0.05）。与Sevo组比较，Sevo+OE-NC组幼鼠海马组织中GluK2蛋白荧光强度无明显改变，差异无统计学意义（P>0.05）。与Sevo组比较，Sevo+OE-GRIK2组幼鼠海马组织中GluK2蛋白荧光强度明显增加（P<0.01）；与Sevo+OE-NC组比较，Sevo+OE-GRIK2组幼鼠海马组织中GluK2蛋白荧光强度明显增加（P<0.01）。见图4。

2.5　各组幼鼠海马组织中NKCC1、KCC2和GluK2蛋白表达水平及NKCC1/KCC2比值

Western blotting法检测结果显示：与Sevo组比较，Sevo+OE-NC组幼鼠海马组织中NKCC1蛋白表达水平无明显改变，差异无统计学意义（P>0.05）；与Sevo+OE-NC组比较，Sevo+OE-GRIK2组幼鼠海马组织中NKCC1蛋白表达水平无明显改变，差异无统计学意义（P>0.05）。与Sevo组比较，Sevo+OE-NC组幼鼠海马组织中KCC2蛋白表达水平无明显改变，差异无统计学意义（P>0.05）；与Sevo组比较，Sevo+OE-GRIK2组幼鼠海马组织中KCC2蛋白表达水平升高（P<0.001）；与Sevo+OE-NC组比较，Sevo+OE-GRIK2组幼鼠海马组织中KCC2蛋白表达水平升高（P<0.001）。与Sevo组比较，Sevo+OE-NC组幼鼠海马组织中GluK2蛋白表达水平无明显改变，差异无统计学意义（P>0.05）； 与Sevo组比较， Sevo+OE-GRIK2组幼鼠海马组织中GluK2蛋白表达水平升高（P<0.001）；与Sevo+OE-NC组比较，Sevo+OE-GRIK2组幼鼠海马组织中GluK2蛋白表达水平升高（P<0.001）。与Sevo组比较，Sevo+OE-NC组幼鼠海马组织中NKCC1/KCC2比值无明显改变，差异无统计学意义（P>0.05）；与Sevo组比较，Sevo+OE-GRIK2组幼鼠海马组织中NKCC1/KCC2比值降低（P<0.05）；与Sevo+OE-NC组比较，Sevo+OE-GRIK2组幼鼠海马组织中NKCC1/KCC2比值降低（P<0.05）。见图5。

3 讨 论

随着医疗科技的进步，全麻药物得到了广泛的应用，其对于大脑发育的影响越来越受到人们的关注。幼年反复多次或长时程地接受Sevo暴露会导致成年产生行为障碍。动物实验^［13］结果表明：幼年的反复多次或长时程的Sevo暴露会引起神经元凋亡和突触可塑性受损等神经病理变化。本研究的造模时间选择了P6仔鼠是因这一时间点处于仔鼠大脑突触发育的高峰期，此期神经元快速分化、迁徙以及突触形成，相当于人类妊娠晚期至新生儿时期，对麻醉药物十分敏感^［14］。3%的Sevo主要是基于此浓度为Sevo诱导神经发育毒性的常用诱导剂量，能够维持稳定的麻醉状态，同时避免过深麻醉导致的不良反应，如呼吸抑制、心脏抑制或死亡等。在临床上婴幼儿的Sevo麻醉维持浓度通常为2.5%~3.0%。小鼠实验中应用3%浓度的麻醉，与临床麻醉药浓度相接近，且能较好地观察Sevo所引起的神经发育毒性机制^［15-16］。麻醉时间的选择则是基于6 h的Sevo麻醉可导致幼鼠产生神经炎症和远期的认知障碍^［17-18］。6 h的Sevo麻醉可导致幼鼠海马组织中NKCC1/KCC2比值增大^［19］。

GluK2作为离子型谷氨酸受体亚基，在发育海马中通过调节谷氨酸释放来调节神经网络的自发电活性和电同步化从而影响幼鼠大脑的突触可塑性^［20-21］。GluK2的缺失或基因突变可引发多种神经发育类疾病，如精神分裂症、孤独症以及智力发育障碍等^［22-23］。本研究结果显示：在P14 Sevo暴露组幼鼠海马组织中GluK2蛋白表达降低，并伴随远期空间学习和记忆能力受损。而通过过表达GluK2蛋白，幼鼠远期空间学习和记忆能力得到改善。这表明GluK2参与了Sevo暴露所引起的幼鼠远期空间学习和记忆能力受损的分子机制。

仔鼠长时程Sevo暴露可能是通过下调GluK2蛋白表达、增大NKCC1/KCC2比值导致幼鼠远期空间学习和记忆能力障碍。NKCC1/KCC2介导的氯离子稳态在大脑发育过程中扮演着重要的调控作用，未成熟的大脑NKCC1蛋白表达水平较高，其作用是将氯离子转运至细胞内而维持胞内的高氯状态，此时的GABA作为兴奋性递质，可增强发育大脑内的电活性，促进神经网络的成熟。而成年后KCC2逐渐增多，其作用是将氯离子转运出细胞而维持胞内的低氯状态，此时GABA作为抑制性递质，标志着大脑发育的相对成熟状态，这一时期在小鼠出生后的第2周^［24-25］。既往研究^［26］表明：GluK2可通过与KCC2结合维持海马神经元的氯离子稳态。结合本研究结果表明：长时程Sevo暴露仔鼠海马组织中GluK2/KCC2的比值下降，NKCC1/KCC2的比值增大，同时影响幼鼠远期的空间学习和记忆能力。过表达幼鼠海马组织中GluK2上调KCC2表达水平，降低NKCC1/KCC2比值改善了Sevo所致的幼鼠远期空间学习和记忆能力。这提示上调GluK2可能是通过改善幼鼠海马组织中的氯离子稳态而改善Sevo暴露所致的远期空间学习和记忆能力。

综上所述，GRIK2过表达使Sevo暴露的仔鼠海马组织中GluK2和KCC2蛋白表达上调，改善幼鼠空间学习和记忆能力，其机制可能与降低海马组织中NKCC1/KCC2比值导致氯离子稳态失衡有关。

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基金资助

国家自然科学基金项目(82160235)

石河子大学第一附属医院博士基金项目(BS202101)