缓激肽B1受体拮抗剂ELN441958通过调节Akt/FoxO3a信号通路对肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用

Inhibitory effect of Bradykinin 1 receptor antagonist ELN441958 on proliferation of HepG2 cells by regulating Akt/FoxO3a signaling pathway

摘要

目的 探讨缓激肽B1受体（B1R）拮抗剂ELN441958对肝癌HepG2细胞的生长抑制作用及其对蛋白激酶B（Akt）/叉头框O 3a（FoxO3a）信号通路的调控机制，阐明B1R拮抗剂ELN441958在肝癌中的抗肿瘤作用。 方法 HepG2细胞经不同剂量（0、2.5、5.0、10.0和20.0 μmol·L^-1）ELN441958处理24、48和72 h后，0 μmol·L^-1 ELN441958作为对照组，采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测各组细胞增殖抑制率。 将HepG2细胞分为对照组、 5.0 μmol·L^-1 ELN441958组、10.0 μmol·L^-1 ELN441958组和15.0 μmol·L^-1 ELN441958组，采用5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷（EdU）染色检测各组HepG2细胞的EdU阳性细胞率，流式细胞术检测各组细胞凋亡率及处于不同细胞周期的细胞比例，免疫荧光法检测各组HepG2细胞中B1R蛋白表达水平，Western blotting法检测各组HepG2细胞中B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）、B1R、Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、FoxO3a和磷酸化FoxO3a（p-FoxO3a）蛋白表达水平。将HepG2细胞分为对照组、B1R激动剂des-Arg9-BK（1.0 μmol·L^-1 des-Arg9-BK）组和BK+ELN441958组，Western blotting法检测各组HepG2细胞中Bcl-2、Bax、Cyclin D1、CDK4、Akt、p-Akt、FoxO3a和p-FoxO3a蛋白表达水平。将HepG2细胞分为对照组、Akt激动剂SC79组和SC79+ELN441958组，Western blotting法检测各组HepG2细胞中Bcl-2、Bax、Cyclin D1、CDK4、Akt、p-Akt、FoxO3a和p-FoxO3a蛋白表达水平。 结果 CCK-8法，与对照组比较，当作用时间相同， HepG2细胞增殖抑制率随ELN441958剂量升高而明显升高（P<0.05或P<0.01）；当ELN441958剂量相同时，HepG2细胞增殖抑制率随作用时间增加而明显升高（P<0.05或P<0.01）。ELN441958作用24、48和72 h的半数抑制浓度 （IC₅₀） 分别为 （21.4±1.1）、 （10.5±0.3）和（3.2±0.3）μmol·L^-1。与对照组比较，5.0、10.0和15.0 μmol·L^-1 ELN441958组HepG2细胞的EdU阳性细胞率明显降低（P<0.05或P<0.01）。流式细胞术，与对照组比较，不同剂量ELN441958组HepG2细胞凋亡率明显升高（P<0.05或P<0.01），G₀/G₁期细胞百分率明显升高（P<0.05或P<0.01）。Western blotting法，与对照组比较，5.0、10.0和15.0 μmol·L^-1 ELN441958组HepG2细胞中Bcl-2、CDK4和Cyclin D1蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01），Bax蛋白表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）。免疫荧光法，与对照组比较，15.0 μmol·L^-1 ELN441958组HepG2细胞中B1R荧光强度明显降低（P<0.01）。Western blotting法，与对照组比较，10.0和15.0 μmol·L^-1 ELN441958组HepG2细胞中B1R蛋白表达水平明显降低（P<0.01），5、10和15 μmol·L^-1 ELN441958组HepG2细胞中p-Akt和p-FoxO3a蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01）；与B1R激动剂des-Arg9-BK组比较，BK+ELN441958组HepG2细胞中Bcl-2、CDK4、Cyclin D1、B1R、p-Akt和p-FoxO3a蛋白表达水平明显降低（P<0.01），Bax蛋白表达水平明显升高（P<0.01）；与SC79组比较，SC79+ELN441958组HepG2细胞中Bcl-2、CDK4、Cyclin D1、B1R、p-Akt和p-FoxO3a蛋白表达水平明显降低（P<0.01），Bax蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。 结论 B1R拮抗剂ELN441958能够抑制HepG2细胞增殖，并诱导HepG2细胞凋亡和G₀/G₁期细胞周期阻滞，其作用机制可能与调节Akt/FoxO3a信号轴有关。

Abstract

Objective To discuss the inhibitory effect of the bradykinin B1 receptor （B1R） antagonist ELN441958 on the growth of hepatocellular carcinoma HepG2 cells and its regulatory mechanism on the protein kinase B （Akt）/forkhead box O3a （FoxO3a） signaling pathway， and to clarify the anti-tumor effect of the B1R antagonist ELN441958 in liver cancer. Methods After the HepG2 cells were treated with different doses （0， 2.5， 5.0， 10.0， and 20.0 μmol·L^-1） of ELN441958 for 24， 48， and 72 h， 0 μmol·L^-1 ELN441958 was regared as control group. CCK-8 method was used to detect the inhibitory rate of proliferation of the cells in various groups. The HepG2 cells were divided into control group， 5.0 μmol·L^-1 ELN441958 group， 10.0 μmol·L^-1 ELN441958 group， and 15.0 μmol·L^-1 ELN441958 group； 5-ethynyl-2'-deoxyuridine （EdU） staining was used to detect the EdU positive cell rates of the HepG2 cells in various groups； flow cytometry was used to detect the apoptotic rates of the cells in various groups and the proportions of the cells at different cell cycles； immunofluorescence method was used to detect the expression level of B1R protein in the HepG2 cells in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of B-cell lymphoma 2 （Bcl-2）， Bcl-2-associated X protein （Bax）， cyclin D1 （Cyclin D1）， cyclin-dependent kinase 4 （CDK4）， B1R， Akt， phosphorylated Akt （p-Akt）， FoxO3a， and phosphorylated FoxO3a （p-FoxO3a） proteins in the HepG2 cells in various groups. The HepG2 cells were divided into control group， B1R agonist des-Arg9-BK （1.0 μmol·L^-1 des-Arg9-BK） group， and BK+ELN441958 group； Western blotting method was used to detect the expression levels of Bcl-2， Bax， Cyclin D1， CDK4， Akt， p-Akt， FoxO3a， and p-FoxO3a proteins in the HepG2 cells in various groups. The HepG2 cells were divided into control group， Akt agonist SC79 group， and SC79+ELN441958 group； Western blotting method was used to detect the expression levels of Bcl-2， Bax， Cyclin D1， CDK4， Akt， p-Akt， FoxO3a， and p-FoxO3a proteins in the HepG2 cells in various groups. Results The CCK-8 assay results showed that compared with control group， when the action time was the same， the inhibitory rate of proliferation of the HepG2 cells was significantly increased with the increase of ELN441958 dose （P<0.05 or P<0.01）； when the dose of ELN441958 was the same， the inhibitory rate of proliferation of the HepG2 cells was significantly increased with the extension of action time （P<0.05 or P<0.01）. The half maximal inhibitory concentration （IC₅₀） values of ELN441958 at 24， 48， and 72 h were （21.4±1.1）， （10.5±0.3）， and （3.2±0.3） μmol·L⁻¹， respectively. Compared with control group， the EdU positive cell rates of the HepG2 cells in 5.0， 10.0， and 15.0 μmol·L⁻¹ ELN441958 groups were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）. The flow cytometry results showed that compared with control group， the apoptotic rates of the HepG2 cells in different doses of ELN441958 groups were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）， and the percentages of the cells at G0/G1 phase were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. The Western blotting results showed that compared with control group， the； the expression levels of Bcl-2， CDK4， and Cyclin D1 proteins in the HepG2 cells in 5.0， 10.0 and 15.0 μmol·L^-1 ELN441958 groups were significantly decreased （P<0.01）， and the expression level of Bax protein was significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. The immunofluorescence results showed that compared with control group， the fluorescence intensity of B1R in the HepG2 cells in 15.0 μmol·L^-1 ELN441958 group was significantly decreased （P<0.01）. The Western blotting results showed that compared with control group， the expression level of B1R， p-Akt， and p-FoxO3a proteins in the HepG2 cells in 10.0 and 15.0 μmol·L^-1 ELN441958 groups were significantly decreased （P<0.01）； the expressions p-Akt， and p-FoxO3a proteins were decreased （P<0.05 or P<0.01） compared with B1R agonist des-Arg9-BK group， the expression levels of Bcl-2， CDK4， Cyclin D1， B1R， p-Akt， and p-FoxO3a proteins in the HepG2 cells in BK+ELN441958 group were significantly decreased （P<0.01）， and the expression level of Bax protein was significantly increased （P<0.01）； compared with SC79 group， the expression levels of Bcl-2， CDK4， Cyclin D1， B1R， p-Akt， and p-FoxO3a proteins in the HepG2 cells in SC79+ELN441958 group were significantly decreased （P<0.01）， and the expression level of Bax protein was significantly increased （P<0.01）. Conclusion The B1R antagonist ELN441958 can inhibit the proliferation of HepG2 cells， and induce the apoptosis and G₀/G₁ phase cell cycle arrest of HepG2 cells， and its mechanism may be related to the regulation of Akt/FoxO3a signaling axis.

Graphical abstract

关键词

ELN441958 / 肝肿瘤 / 蛋白激酶B / 叉头框O 3a / 细胞凋亡 / 细胞周期

Key words

ELN441958 / Liver neoplasms / Protein kinase B / Forkhead box O3a / Apoptosis / Cell cycle

肝癌是一种常见的恶性肿瘤，2020年我国癌症数据统计结果显示：中国癌症发病率中肝癌位居第5位，而死亡率高居第2位^［1］。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占所有肝癌病例的90%以上，其治疗方式主要以手术、免疫治疗放射治疗和化学治疗为主^［2］。肝癌患者常在晚期被确诊，有效治疗药物较为匮乏，预后较差。因此，寻找较低全身毒性和较少不良反应的抗癌药物以期获得更好的预后成为目前肝癌治疗的研究热点。异吲哚酮是生物碱、药物和天然产物中常见的分子骨架。异吲哚酮结构类化合物具有显著的生物活性，如抗炎、抗菌和抗病毒活性^［3］，防治心血管疾病^［4-5］，抗肿瘤活性^［6-7］及神经保护活性^［8］等。异吲哚酮化合物ELN441958是一种缓激肽B1受体（bradykinin B1 receptor，B1R）拮抗剂^［9］，B1R拮抗剂具有抗炎^［10］和镇痛^［11］作用，且对子宫内膜异位症也起到一定的治疗作用^［12］。目前B1R拮抗剂已被证实在多种肿瘤^［13-14］中具有治疗作用，其作用机制可能与磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）信号通路等有关^［15］。但B1R拮抗剂ELN441958在肝癌中的作用鲜有报道，为了明确其体外抗肝癌活性及相关机制，本研究通过探讨B1R拮抗剂ELN441958对肝癌HepG2细胞的生长抑制作用及其对Akt/叉头框O 3a（forkhead box O3a，FoxO3a）信号通路的调控机制，阐明B1R拮抗剂ELN441958在肝癌中的抗肿瘤作用，为该类化合物在肝癌治疗方面的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1　细胞、主要试剂和仪器

人HCC细胞系（HepG2细胞）购自武汉Procell生物科技有限公司。纯度大于98%的索拉非尼（Sorafenib）购自上海Yuanye生物技术有限公司，细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8，CCK-8）、ELN441958、B1R激动剂des-Arg9-Bradykinin和Akt激动剂SC79购自美国MCE生物公司，Annexin Ⅴ/PI试剂盒购自南京Vazyme生物技术有限公司，细胞周期检测试剂盒购自江苏KeyGEN BioTECH有限公司。B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、细胞周期蛋白依赖性激酶4（Cyclin-dependent kinase 4，CDK4）、FoxO3a、磷酸化FoxO3a（phosphorylated FoxO3a，p-FoxO3a）和过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗购自武汉博士德 生 物 工 程 有 限 公 司， Akt 和 磷 酸 化 Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）一抗购自美国Abcam技术公司，GAPDH抗体购自沈阳万类生物科技有限公司。酶标仪（型号357-906872，美国Thermo Multiskan FC），倒置荧光显微镜（型号：IX51，日 本 Olympus 公 司）， 凝 胶 成 像 仪 （型 号：ChemiDocXRS+，美国Bio-Rad公司）。

1.2　细胞培养

将HepG2细胞接种于含10%胎牛血清、100 U·mL^-1 青霉素和100 mg·L^-1链霉素的DMEM培养基（以下简称DMEM完全培养基）中，于培养箱（37 ℃、5% CO₂培养条件）中培养，每2~3 d换液1次，待细胞生长至对数生长期时进行实验。

1.3　CCK-8法检测各组HepG2细胞增殖抑制率

取处于对数生长期的HepG2细胞，以2×10³个细胞的密度均匀接种于96孔细胞培养板中，置于培养箱中培养24 h后，向各组分别加入0、2.5、5.0、10.0和20.0 μmol·L^-1 ELN441958，每组设3个复孔，0 μmol·L^-1 ELN441958 组作为对照组。作用24、48和72 h后，吸除细胞培养液，向每孔中加入100 μL 10%的CCK-8溶液，置于培养箱（37 ℃、5% CO₂培养条件）中继续孵育2 h，观察到颜色变化后使用酶标仪在波长450 nm处测量吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率=（1-实验组A值/对照组A值）×100%。利用GraphPad Prism 9软件计算半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC₅₀）。

1.4　5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）染色检测各组HepG2细胞的EdU阳性细胞率

取处于对数生长期的HepG2细胞，以每孔3×10³ 个细胞的密度均匀接种于96孔细胞培养板中，分为0、5.0、10.0和15.0 μmol·L^-1 ELN441958组，0 μmol·L^-1 ELN441958组为对照组，干预48 h后进行实验。配置工作液，37 ℃预热后均匀地加入上述96孔细胞培养板中，置于培养箱中继续孵育2 h进行EdU标记。标记完成后，去除培养液，每孔加入1 mL固定液室温固定15 min。固定完成后，洗涤液洗涤3次，每孔加入1 mL通透液室温孵育15 min。去除通透液，洗涤液洗涤2次。最后配制反应液加入96孔细胞培养板中，室温避光孵育30 min。孵育结束后吸除反应液，洗涤液洗涤3次。使用Hoechst33342进行细胞核染色，室温避光孵育10 min。孵育完成后用洗涤液洗涤3次，即可进行荧光检测。采用Image J软件定量分析各组HepG2细胞的EdU阳性细胞数和总细胞数，计算EdU阳性细胞率。EdU阳性细胞率=EdU阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.5　Annexin Ⅴ-FITC/PI染色结合流式细胞术检测各组HepG2细胞凋亡率

细胞分组见“1.4”。将处于对数生长期的HepG2细胞均匀地接种于6孔细胞培养板中，置于培养箱中培养，待细胞贴壁后，按照分组方法进行给药处理48 h。收集细胞，使用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）重悬细胞进行计数。取含5×10⁴ 个细胞的细胞悬液离心，去除上清液后，使用195 μL Annexin Ⅴ-FITC结合液重悬细胞，加入5 μL的Annexin Ⅴ-FITC和相应体积的PI染料，室温避光孵育，10 min后将其置于冰浴中，上机检测，使用流式细胞术分析细胞凋亡情况。细胞凋亡率=早期细胞凋亡率+晚期细胞凋亡率。

1.6　流式细胞术检测各组HepG2细胞周期分布

细胞分组见“1.4”。将处于对数生长期的HepG2细胞均匀地接种于6孔细胞培养板中，置于培养箱中培养，待细胞贴壁后，按照分组方法进行给药处理48 h。收集各组细胞，PBS缓冲液洗涤后，使用70%乙醇重悬，置于4 ℃固定过夜。固定完成后进行离心并用PBS缓冲液再次洗涤。洗涤完成后加入含RNaseA的PI溶液，37 ℃避光孵育30 min后即可上机检测。用流式细胞仪分析染色细胞，使用Modfit 5.0软件分析细胞周期分布。

1.7　免疫荧光法检测各组HepG2细胞中B1R蛋白表达水平

将处于对数生长期的HepG2细胞均匀地接种于6孔细胞培养板中，置于培养箱中培养，待细胞贴壁后，分为0和15.0 μmol·L^-1 ELN441958组，0 μmol·L^-1 ELN441958 组为对照组，干预48 h后使用多聚甲醛固定细胞，固定后用PBS缓冲液洗涤3次。使用10%的山羊血清在37 ℃下封闭细胞30 min。加入特异性一抗，在4 ℃下孵育过夜。采用PBS缓冲液洗涤3次，加入荧光标记的二抗，在37 ℃下孵育1 h，使用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）对细胞核进行染色，避光保存10 min。PBS缓冲液洗涤3次，在载玻片上滴加抗荧光淬灭剂，将爬片覆盖在含抗荧光淬灭剂的封片剂上。将准备好的载玻片放在激光共聚焦显微镜下检测，分析实验结果。

1.8　Western blotting法检测各组HepG2细胞中相关蛋白表达水平

细胞分组见“1.4”。将处于对数生长期的HepG2细胞均匀地接种于6孔细胞培养板中，置于培养箱中培养，待细胞贴壁后，按照分组方法给予药物处理48 h。用PBS缓冲液洗涤3次后，收集细胞沉淀。将蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和放射免疫沉淀分析（radio immunoprecipitation assay，RIPA）缓冲液以1∶1∶100的比例混匀配置蛋白裂解液。向每组细胞沉淀分别加入150 μL上述裂解液，冰上裂解30 min后离心收集上清液。向收集的上清液中加入1/4体积的5×Loading Buffer，涡旋充分混匀并于95 ℃金属浴煮10 min，进行蛋白变性处理。总蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离后，转移至聚二偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用5%脱脂牛奶封闭2 h后，于4 ℃孵育一抗（Bcl-2、Bax、Cyclin D1、CDK4、p-Akt、FoxO3a和p-FoxO3a的稀释比例均为1∶1 000，Akt和GAPDH的稀释比例为1∶10 000）。16~18 h后回收一抗并使用1×含吐温的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris-buffered saline with Tween 20，TBST）洗膜6次，每次5 min。室温孵育二抗（稀释比例为1∶1 000），1 h后再次洗膜6次，每次5 min，配置显影液后，即可上机显影，观察免疫反应条带。使用Image J软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。同时将HepG2细胞分为对 照 组、B1R 激 动 剂 des-Arg9-BK 组 和 BK+ELN441958组，其中对照组采用不加药物的空白培养基，B1R激动剂des-Arg9-BK组加入1.0 μmol·L^-1 BK，BK+ELN441958组加入1.0 μmol·L^-1 BK和15.0 μmol·L^-1 ELN441958，采用Western blotting法检测各组HepG2细胞中相关蛋白表达水平。将HepG2细胞分为对照组、SC79组和SC79+ELN441958组，对照组采用不加药物的空白培养基，SC79 组 加 入 10.0 μmol·L^-1 SC79， SC79+ELN441958 组 加 入 10.0 μmol·L^-1 SC79 和15.0 μmol·L^-1 ELN441958，采用Western blotting法检测各组HepG2细胞中相关蛋白表达水平。

1.9　统计学分析

采用Graphpad Prism 9软件进行统计学分析。各组细胞增殖抑制率、EdU阳性细胞率、细胞凋亡率以及HepG2细胞中Bcl-2、Bax、Cyclin D1、CDK4、Akt、p-Akt、FoxO3a和p-FoxO3a蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　各组HepG2细胞增殖抑制率、IC₅₀和EdU阳性细胞率

CCK-8法检测结果显示：与对照组比较，5.0、10.0和20.0 μmol·L^-1 ELN441958组处理HepG2细胞24、48和72 h时细胞增殖抑制率明显升高（P<0.05或P<0.01）。见表1。不同剂量ELN441958作用于HepG2细胞24、48和72 h的IC₅₀ 分 别 为（21.4 ± 1.1）、 （10.5 ± 0.3） 和（3.2±0.3）μmol·L^-1。

EdU染色检测结果显示：与对照组（31.78%± 1.67%） 比 较， 5.0、 10.0 和 15.0 μmol·L^-1 ELN441958组处理48 h后EdU阳性细胞率（21.86%±0.78%、17.67%±0.67%和6.98%± 1.07%）明显降低（P<0.05或P<0.01），且随着药物剂量升高，降低越明显。见图1。

2.2　各组HepG2细胞凋亡率以及Bax和Bcl-2蛋白表达水平

Annexin Ⅴ-PI 染色法检测结果显示：与对照组（6.10%±0.87%）比较，5.0、10.0和15.0 μmol·L^-1 ELN441958组细胞凋亡率（21.90%± 1.06%、32.60%±1.54%和87.10%±0.97%）增加了3.6~14.2倍（P<0.05或P<0.01）（图2A~2D），且比例随药物剂量的增加而明显升高。Western blotting法检测结果显示：与对照组（Bax：1.00 ± 0.04； Bcl-2：1.00 ± 0.06） 比 较，5.0、10.0和15.0 μmol·L^-1 ELN441958组处理48 h后，HepG2细胞中Bax（1.16±0.26、1.27±1.26和1.48±0.82）蛋白表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01），而Bcl-2（0.71±0.04、0.42±0.06和0.18±0.03）蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01），且呈剂量依赖性。见图2E。

2.3　各组HepG2细胞周期分布以及Cyclin D1和CDK4蛋白表达水平

与对照组（50.76%± 0.87%） 比 较， 5.0、 10.0 和 15.0 μmol·L^-1 ELN441958组G₀/G₁期细胞比例（60.32%± 1.31%、63.95%±0.07%和74.97%±0.29%）明显升高（P<0.05或P<0.01），且呈剂量依赖性。Western blotting法检测结果显示：与对照组（Cyclin D1：1.00±0.03；CDK4：1.00±0.05）比较，5.0、10.0和15.0 μmol·L^-1 ELN441958处理48 h后HepG2细胞中Cyclin D1（0.86±0.04、0.61±0.12和0.52±0.07）和CDK4（0.82±0.12、0.61±0.05和0.53±0.06）蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01）。见图3。

2.4　各组HepG2细胞中BIR的蛋白表达水平

与对照组（1.00±0.05）比较，5.0 μmol·L^-1 ELN441958组HepG2细胞中B1R蛋白表达水平（0.87±0.09）降低，但差异无统计学意义（P>0.05）；10.0和15.0 μmol·L^-1 ELN441958组HepG2细胞中B1R蛋白表达水平（0.69±0.04和0.46±0.08）明显降低（P<0.01）。见图4A。免疫荧光法检测结果显示：与对照组（1.00±0.05）比较，15.0 μmol·L^-1 ELN441958组HepG2细胞中B1R 荧 光 强 度（0.73 ± 0.02） 明 显 降 低（P<0.01）。见图4B。

2.5　各组HepG2细胞中Akt、p-Akt、FoxO3a和p-FoxO3a蛋白表达水平

与对照组比较，5.0、10.0和15.0 μmol·L^-1 ELN441958组HepG2细胞中Akt和FoxO3a蛋白表达水平无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）；与对照组（p-AKT：1.00±0.03，p-FoxO3a：1.00±0.02）比较，5.0、10.0和15.0 μmol·L^-1 ELN441958组HepG2细胞中p-Akt（0.86±0.06、0.72±0.08和0.58±0.06）和p-FoxO3a（0.76±0.08、0.68±0.04和0.46±0.09）蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01）。见图5。

2.6　B1R激动剂BK处理后HepG2细胞中相关蛋白表达水平

与B1R激动剂des-Arg9-BK组（B1R：1.56±0.17， p-Akt： 1.43±0.08， p-FoxO3a：1.49±0.21） 比较，BK+ELN441958组HepG2细胞中B1R（0.63±0.08）、p-Akt（0.72±0.06）和p-FoxO3a（0.65±0.07）蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。与B1R激动剂des-Arg9-BK组（Bcl-2：1.76±0.13， Cyclin D1： 1.61±0.09， CDK4：1.58±0.11）比较，BK+ELN441958组HepG2细胞中Bcl-2（0.68±0.06）、Cyclin D1（0.56±0.08）和CDK4（0.57±0.06） 蛋白表达水平明显降低 （P<0.01）。与B1R激动剂des-Arg9-BK组（Bax：0.77±0.07）比较，BK+ELN441958组HepG2细胞中Bax蛋白表达水平（1.53±0.06）明显升高（P<0.01）。见图6。

2.7　Akt激动剂SC79处理后HepG2细胞相关蛋白表达水平

与SC79组（p-Akt：1.27±0.18，p-FoxO3a：1.31±0.03）比较，SC79+ELN441958组HepG2细胞中p-Akt（0.75±0.11）和p-FoxO3a（0.81±0.07）蛋白表达水平明显降低（P<0.01）；与SC79组（Bcl-2：1.34±0.07，Cyclin D1：1.17±0.06，CDK4：1.23±0.09）比较，SC79+ELN441958 组 Bcl-2（0.58 ± 0.13）、 Cyclin D1（0.79±0.04）和CDK4（0.82±0.06） 蛋白表达水平明显降低 （P<0.01）；与SC79组（Bax：0.68±0.07）比较，SC79+ ELN441958组HepG2细胞中Bax蛋白表达水平（1.18±0.09）明显升高（P<0.01）。 与 SC79 组（BIR：1.16 ± 0.17） 比 较，SC79+ELN441958组HepG2细胞中BIR蛋白表达水平（0.98±0.09）无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。见图7。

3 讨 论

B1Rs作为调控激肽系统的重要受体蛋白^［16-17］，主要用于炎症和疼痛等相关疾病治疗靶点研究^［18］。近年来，多项研究^［19］表明：B1R在多种肿瘤中高表达，并可促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。在炎症、细胞因子刺激或组织损伤，尤其是癌症发生时，B1R蛋白表达水平会升高^［20］。因此，B1R作为潜在的抗肿瘤靶点受到越来越多的关注。异吲哚酮类化合物ELN441958是一种新型的小分子B1Rs拮抗剂，在恒河猴炎性疼痛中具有较高的口服生物利用度和强大的全身疗效^［9］。然而，B1R拮抗剂ELN441958在HCC中的抗肿瘤活性及其潜在机制尚未明确。

本研究结果显示： ELN441958能显著抑制HepG2细胞的增殖。细胞凋亡的激活是有效抗癌治疗的关键机制之一， 本研究进一步发现ELN441958可显著增加HepG2细胞的凋亡比例，凋亡相关Western blotting法分析进一步支持了上述发现，与对照组比较，随着药物剂量的增加，ELN441958处理组中Bcl-2蛋白表达水平降低，Bax蛋白表达水平升高， 以上结果均表明ELN441958可能通过诱导细胞凋亡而抑制肝癌HepG2细胞增殖。细胞周期的异常调控是癌细胞不受控制增殖的重要原因，本研究通过流式细胞术和Western blotting法检测发现：ELN441958可能通过降低Cyclin D1和CDK4蛋白表达，导致G₀/G₁期细胞周期阻滞而抑制HepG2细胞的增殖。

ELN441958作为一种已知的B1R拮抗剂，通过降低激动剂配体亲和力，发挥其对B1R的拮抗作用^［9］。NICOLETTI等^［21］研究显示：B1R拮抗剂SSR240612在人胶质母细胞瘤中通过下调B1受体的表达，发挥抑制增殖和促凋亡活性。参考SSR240612的抗肿瘤作用机制，本研究采用Western blotting法检测ELN441958是否对肝癌HepG2细胞内B1R信号轴产生影响，结果显示：ELN441958处理HepG2细胞后，B1R蛋白表达水平显著降低，免疫荧光法检测结果也证实ELN441958能够降低HepG2细胞B1R荧光强度。PI3K/Akt 信号通路在调控肿瘤细胞增殖、凋亡和细胞周期等恶性生物学行为中发挥关键作用^［22-23］，并且作为B1R信号轴中一条重要的下游通路^［15］。本研究结果显示：ELN441958能够显著抑制Akt磷酸化表达水平，提示ELN441958可能通过调控B1R/Akt信号轴抑制来HepG2细胞生长。

PI3K/Akt途径能够介导激活FoxO3a磷酸化^［24］，FoxO3a是肝细胞表达的中心因子，FoxO3a的高表达与HCC的预后不良相关，是HCC监测的新型诊断和预后生物标志物^［25］。本研究结果表明：ELN441958对HepG2细胞FoxO3a磷酸化表达有影响，提示ELN441958可能影响了HepG2细胞中B1R/Akt/FoxO3a信号通路中的关键蛋白活性。

为了进一步验证ELN441958诱导肝癌HepG2细胞凋亡以及G₀/G₁期细胞周期阻滞的机制，本研究使用B1R激动剂des-Arg9-BK处理，结果显示：ELN441958能够逆转des-Arg9-BK引起的细胞周期、细胞凋亡和Akt/FoxO3a信号通路相关蛋白的表达变化，同时，进一步使用Akt激动剂SC79进行验证，发现ELN441958逆转了SC79引起信号周期、细胞凋亡和Akt/FoxO3a信号通路相关蛋白的表达。上述结果均提示，在B1R拮抗剂ELN441958诱导HepG2细胞凋亡和阻滞细胞周期的过程中，Akt/FoxO3a细胞通路起到关键作用。

尽管本研究揭示了ELN441958在HepG2细胞中具有抗肿瘤作用，但仍存在一定局限，如尚未在动物模型中进行验证。未来的研究将在动物模型中评估ELN441958的抗肿瘤效果，并探索其与Sorafenib或PD-1抑制剂等标准疗法的联合应用，以优化治疗策略，为后续临床转化提供更充分的实验依据。

综上所述，B1R拮抗剂ELN441958具有抑制肝癌HepG2细胞增殖的作用，其机制可能是通过抑制B1R、下调Akt/FoxO3a信号通路蛋白表达，进而诱导肝癌细胞凋亡和G₀/G₁细胞周期阻滞来实现的。

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基金资助

山东省科技厅自然科学基金项目(ZR2021MH173)

山东省卫健委齐鲁卫生与健康杰出青年人才项目(鲁卫人才字〔2020〕3号)