特发性肺纤维化组织中脂肪酸代谢相关基因的生物信息学分析及实验验证

Bioinformatics analysis and experimental validation of fatty acid metabolism-related genes in idiopathic pulmonary fibrosis tissue

摘要

目的 采用生物信息学方法鉴定特发性肺纤维化（IPF）组织中的核心脂肪酸代谢相关基因（FAMRGs），并通过实验验证上述基因是否在IPF组织和正常肺组织中呈显著差异表达。 方法 从基因表达综合数据库（GEO）下载2个IPF基因芯片数据集，包括GSE47460数据集和GSE150910数据集，人类基因综合数据库（GeneCards）中筛选FAMRGs，GEO2R工具筛选出GSE47460数据集中IPF组织和正常肺组织的差异表达基因（DEGs），通过对DEGs与FAMRGs绘制韦恩图，获得差异表达的FAMRGs。采用仙桃学术工具对上述基因进行富集分析，STRING数据库分析并导入Cytoscape软件建立蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络图并筛选出关键FAMRGs，通过GSE150910数据集对上述基因的表达水平进行验证，并绘制受试者工作特征（ROC）曲线，筛选出核心FAMRGs。采用CIBERSORT网站分析在IPF组织中核心FAMRGs表达水平与免疫细胞浸润的关系。选取18只健康雄性SD大鼠，随机分为对照组、IPF组和吡非尼酮组，每组6只。IPF组和吡非尼酮组大鼠气管内注射博来霉素以制备肺纤维化模型，对照组大鼠气管内注射等量生理盐水。造模成功后，对照组和IPF组大鼠以10 mL·kg^-1·d^-1生理盐水灌胃，吡非尼酮组大鼠以10 mL·kg^-1·d^-1吡非尼酮混悬液灌胃，药物干预14 d后处死，取出肺组织。采用Masson染色观察3组大鼠肺组织纤维化程度，Western blotting法检测3组大鼠肺组织中的FAMRGs蛋白表达情况。 结果 共筛选出182个差异表达的FAMRGs。基因本体论（GO），上述FAMRGs主要涉及激素调节、对肽类物质的反应、信号受体激动剂活性和细胞因子活性等功能。京都基因与基因组百科全书（KEGG），上述FAMRGs主要富集于白细胞介素17（IL-17）信号通路、晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体（AGE-RAGE）信号通路和缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路等。从PPI网络中鉴定出前10位关键FAMRGs，通过GSE150910数据集的验证，确定基质金属蛋白酶3（MMP3）、分泌型磷蛋白1（SPP1）和胰岛素样生长因子1（IGF1）为IPF组织中核心FAMRGs，与正常肺组织比较呈明显高表达（P<0.001）。免疫浸润分析，在IPF组织中浆细胞、调节性T细胞、M0型巨噬细胞和静息肥大细胞的表达明显上调（P<0.05），静息CD4记忆T细胞、静息自然杀伤（NK）细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的表达则明显下调（P<0.05），Spearman相关性，在IPF组织中SPP1与M0型巨噬细胞表达水平呈正相关关系（P<0.001），与单核细胞表达水平呈负相关关系（P<0.001）。Masson染色，与对照组比较，IPF组大鼠肺组织中胶原纤维沉积明显增多；与IPF组比较，吡非尼酮组大鼠肺组织中胶原纤维沉积明显减少。Western blotting法，与对照组比较，IPF组大鼠肺组织中的MMP3、SPP1和IGF1蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；与IPF组比较，吡非尼酮组大鼠肺组织中的MMP3、SPP1和IGF1蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。 结论 MMP3、SPP1和IGF1为IPF组织中的核心FAMRGs，可作为未来IPF治疗的潜在靶点。

Abstract

Objective To identify the core fatty acid metabolism-related genes （FAMRGs） in idiopathic pulmonary fibrosis （IPF） tissue using bioinformatics methods， and to experimentally verify whether these genes are significantly differentially expressed in IPF tissue and normal lung tissue. Methods Two IPF gene chip datasets， including the GSE47460 dataset and the GSE150910 dataset， were downloaded from the Gene Expression Omnibus （GEO） database； FAMRGs were screened from the Human Gene Comprehensive Database （GeneCards） database； the GEO2R tool was used to screen the differentially expressed genes （DEGs） between IPF tissue and normal lung tissue in GSE47460 dataset； Venn diagram was drawn between the DEGs and FAMRGs to obtain the differentially expressed FAMRGs. Xiantao Academic Tool was used to perform functional enrichment analysis on the above genes； the STRING database was used for analysis and Cytoscape software was used to establish a protein-protein interaction （PPI） network and screen the key FAMRGs； the GSE150910 dataset was used to verify the expression levels of the above genes， and receiver operating characteristic （ROC） curves were plotted to screen the core FAMRGs. The CIBERSORT database was used to analyze the relationship between the core FAMRGs and immune cell infiltration in IPF tissue. Eighteen healthy male SD rats were selected and randomly divided into control group， IPF group， and pirfenidone group， with 6 rats in each group. The rats in IPF group and pirfenidone group were intratracheally injected with bleomycin to establish the pulmonary fibrosis model， and the rats in control group were intratracheally injected with an equal volume of normal saline. After successful modeling， the rats in control group and IPF group were given 10 mL·kg^-1·d^-1 normal saline by gavage， and the rats in pirfenidone group were given 10 mL·kg^-1·d^-1 pirfenidone suspension by gavage； after 14 d of drug intervention， the rats were sacrificed and lung tissue was taken. Masson staining was used to observe the degree of fibrosis in lung tissue of the rats in the three groups； Western blotting method was used to detect the expression of FAMRGs proteins in lung tissue of the rats in three groups. Results A total of 182 differentially expressed FAMRGs were screened. The Gene Ontology （GO） analysis results showed that the above FAMRGs were mainly involved in functions such as hormone regulation， response to peptide substances， signaling receptor agonist activity， and cytokine activity. The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） analysis results showed that the above FAMRGs were mainly enriched in signaling pathways such as interleukin-17 （IL-17） signaling pathway， advanced glycation end products-receptor for advanced glycation end products （AGE-RAGE） signaling pathway， and hypoxia-inducible factor-1（HIF-1） signaling pathway. Ten key FAMRGs were identified from the PPI network. Through validation with the GSE150910 dataset， matrix metalloproteinase 3 （MMP3）， secreted phosphoprotein 1 （SPP1）， and insulin-like growth factor 1 （IGF1） were determined as the core FAMRGs in IPF tissue， and their expressions were significantly higher compared with normal lung tissue （P<0.001）. The immune infiltration analysis results showed that in IPF tissue， the expressions of plasma cells， regulatory T cells， M0 macrophages， and resting mast cells were significantly up-regulated （P<0.05）， while the expressions of resting CD4 memory T cells， resting natural killer （NK） cells， monocytes， eosinophils， and neutrophils were significantly down-regulated （P<0.05）； the Spearman correlation analysis results showed that in IPF tissue， the expression level of SPP1 was positively correlated with the expression level of M0 macrophages （P<0.001）， and negatively correlated with the expression level of monocytes （P<0.001）. The Masson staining results showed that compared with control group， the collagen fiber deposition in lung tissue of the rats in IPF group was significantly increased； compared with IPF group， collagen fiber deposition in lung tissue of the rats in pirfenidone group was significantly decreased. The Western blotting results showed that compared with control group， the expression levels of MMP3， SPP1， and IGF1 proteins in lung tissue of the rats in IPF group were significantly increased （P<0.05）； compared with IPF group， the expression levels of MMP3， SPP1， and IGF1 proteins in lung tissue of the rats in pirfenidone group were significantly decreased （P<0.05）. Conclusion MMP3， SPP1， and IGF1 are the FAMRGs in IPF tissue and can serve as potential targets for future IPF treatment.

Graphical abstract

关键词

特发性肺纤维化 / 脂肪酸代谢 / 生物信息学 / 免疫浸润 / 吡非尼酮

Key words

Idiopathic pulmonary fibrosis / Fatty acid metabolism / Bioinformatics / Immune infiltration / Pirfenidone

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种病因不明的慢性、进行性纤维化的间质性肺病，伴随呼吸道症状的持续恶化及肺功能的降低，最终导致死亡^［1］。IPF预后差，诊断后的中位生存期为3~5年^［2］。吡非尼酮和尼达尼布是目前美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准用于治疗IPF的药物，然而上述药物只能延缓疾病的进展，不能逆转或预防IPF^［3］。因此，探索IPF可能的发病机制并识别特定的关键基因是实现精准医疗并改善患者预后的有效策略。脂质代谢与IPF的发展之间存在一定的关联，如前列腺素E2作为脂质代谢中花生四烯酸环氧合酶的代谢产物，在IPF小鼠模型中可抑制成纤维细胞的增殖及其向肌成纤维细胞的转化，具有保护作用^［4］。研究^［5］显示：抑制IPF小鼠模型中脂肪酸合酶的表达可降低转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）诱导的肺纤维化程度。他汀类药物广泛应用于高脂血症的治疗，可降低IPF急性加重患者的住院次数和死亡率^［6］，间接提示脂肪酸代谢可能参与了肺纤维化的发病过程。目前脂肪酸代谢与IPF关系的研究报道较少，故有必要寻找新的脂肪酸代谢相关基因（fatty acid metabolism-related genes，FAMRGs）或分子通路以了解IPF的发病机制。本研究首先通过生物信息学方法确定IPF组织中的核心FAMRGs，然后通过外部实验验证上述基因在IPF大鼠肺组织模型中的表达，旨在为IPF患者探索新的治疗靶点提供理论基础。

1 材料与方法

1.1　公共数据来源

在基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo） 中以“interstitial lung disease”和“pulmonary fibrosis”为关键词进行检索，筛选条件需满足样本量>20，同时包含IPF患者和健康对照者的肺组织样本，最终下载2个基因芯片数据集（GSE47460 和 GSE150910）作 为 分 析 对 象。GSE47460数据集有2个平台（GPL6480和GPL14550），本研究选择GPL14550平台下的GSE47460数据集作为训练集，其中包含122例IPF患者和91名健康对照者的肺组织。GSE150910数据集作为验证集，其中包含103例IPF患者和103名健康对照者的肺组织。本研究从人类基因综合数据库（GeneCards）（https：//www.genecards.org/）中筛选FAMRGs，以“fatty acid metabolism”为关键词检索相关基因，根据既往文献［7-8］，按照数据库检索出的基因相关性评分>7分作为筛选条件，共得到3 754个FAMRGs。

1.2　实验动物、主要试剂和仪器

18只8周龄SPF级健康雄性SD大鼠购自北京斯贝福生物科技股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2024-0001，体质量（200±20）g。将大鼠安置于动物房饲养，通风好，室温20 ℃~26 ℃，湿度40%~70%，每日光照时间12 h，定时喂食、喂水及更换饲料，适应性饲养7 d后进行研究。博来霉素购自北京索莱宝科技有限公司（规格：每瓶125 mg），用生理盐水配置成6 g·L^-1的溶液；吡非尼酮胶囊购自北京康蒂尼药业股份有限公司（规格：每粒100 mg），溶于生理盐水中配置成10 g·L^-1混悬液；Masson三色染色液、羊抗鼠辣根过氧化物酶标记抗体和羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体均购自武汉赛维尔生物科技有限公司；兔抗基质金属蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3，MMP3）单克隆抗体和兔抗分泌型磷蛋白1（secreted phosphoprotein 1，SPP1）单克隆抗体均购自美国ImmunoWay公司；兔抗胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）单克隆抗体购自北京全氏金生物技术有限公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜购自美国Millipore公司；放射免疫沉淀（radioimm unoprecipitation，RIPA）细胞裂解液购自北京普利莱基因技术有限公司；增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）液购自美国赛默飞公司；BCA蛋白定量试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司。组织脱水机购自金华市科迪仪器设备有限公司，石蜡包埋机、切片机和摊片机均购自德国Leica公司，光学显微镜（型号：BX43）购自日本奥林巴斯公司，全自动化学发光成像系统（型号：Tanon-5200）购自上海天能科技有限公司，低温高速离心机（型号：5424R）购自德国Eppendorf公司，全自动酶标仪（型号：SuPerMax 3100）购自上海闪谱生物科技有限公司，蛋白垂直电泳仪（型号：DYY-6C）购自北京六一仪器厂。

1.3　差异表达FAMRGs的筛选

GEO2R在线工具 （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r） 筛选GSE47460数据集中IPF组织和正常肺组织的差异表达基因 （differentially expressed genes， DEGs），筛选条件为|log₂FC|>1且校正后P<0.05。仙桃学术工具 （https：//www.xiantaozi.com） 绘制DEGs的火山图和热图以及DEGs与FAMRGs的韦恩图，从而获得差异表达的FAMRGs。

1.4　基因本体论（Gene Ontology， GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）信号通路富集分析

仙桃学术工具对差异表达FAMRGs进行GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析。以P<0.05作为筛选条件，选取GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析排名前5位的条目（表1），并绘制GO气泡图和KEGG弦图。

1.5　差异表达FAMRGs编码的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction， PPI）分析及关键基因筛选

STRING数据库 （http：//string-db.org） 对差异表达FAMRGs进行PPI分析，并导入Cytoscape 3.7.1软件以进一步绘制PPI网络图。采用CytoHubba插件下的MCC算法，计算出得分前10位的关键FAMRGs。

1.6　关键FAMRGs表达水平的验证

GSE150910数据集用于验证关键FAMRGs在IPF组织和正常肺组织的表达差异，同时绘制上述基因在训练集和验证集中的受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，以确定核心FAMRGs。

1.7　IPF免疫浸润分析和核心FAMRGs与免疫细胞浸润的关系

通过在线CIBERSORT网站（https：//cibersort.stanford.edu/） 评估GSE47460和GSE150910数据集中IPF组织和正常肺组织的各型免疫细胞表达，筛选出上述2个数据集中IPF组织和正常肺组织呈差异表达的免疫细胞类型。进一步分析在IPF组织中核心FAMRGs表达水平与差异表达免疫细胞浸润之间的相关性。

1.8　实验动物模型制备和给药

将18只大鼠随机分为对照组、IPF组和吡非尼酮组，每组6只。麻醉大鼠，仰卧位固定于手术台，常规备皮、消毒后，于颈部正中行纵向切口，逐层分开并分离组织，暴露气管，从气管软骨环间隙进针，IPF组和吡非尼酮组大鼠气管内注射配置好的6 mg·kg^-1博来霉素溶液，对照组向大鼠气管内注射同等体积的生理盐水。注射完毕后将大鼠直立、旋转10次，再缝合切口。造模1 d后，对照组和IPF组大鼠分别以10 mL·kg^-1·d^-1生理盐水灌胃，吡非尼酮组大鼠给予配置好的吡非尼酮混悬液以10 mL·kg^-1·d^-1灌胃。上述药物干预后，于第14天处死大鼠并取材。

1.9　Masson染色评估各组大鼠肺纤维化程度

处死大鼠后，摘取肺组织。对肺组织进行切片、烤片、脱蜡和水化后，进行Masson染色，依次经重铬酸钾染液染色3 min、苏木素染色3 min，酸性乙醇分化液分化后，丽春红酸性品红染色液染色10 min，磷钼酸处理10 min后，甲苯胺蓝染色5 min，切片脱水后用二甲苯透明切片，封片，光学显微镜观察各组大鼠肺间质、支气管壁及血管壁蓝色胶原纤维沉积情况以评估肺组织纤维化程度。

1.10　Western blotting法检测各组大鼠肺组织中MMP3、SPP1和IGF1蛋白表达情况

取出大鼠肺组织，加入RIPA裂解液，用组织研磨仪进行研磨，提取组织总蛋白，12 000 r·min^-1离心10 min，采用BCA蛋白定量试剂盒测定各组大鼠肺组织上清液总蛋白浓度。将蛋白质加热变性后，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polycrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）1.5 h，后用300 mA恒流转膜1 h。PVDF膜用脱脂奶粉封闭后，MMP3抗体、SPP1抗体和IGF1抗体及GAPDH抗体4 ℃孵育过夜，次日PVDF膜室温孵育二抗2 h，用ECL液浸湿PVDF膜，置于化学发光成像系统中显影，并采用Image-Pro软件分析蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.11　统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。生物信息学部分采用Wilcoxon检验分析IPF组和健康对照组基因表达水平及免疫细胞浸润的差异，采用Spearman相关性分析检测IPF组织中核心FAMRGs表达水平与差异表达免疫细胞浸润之间的相关性。实验部分中各组大鼠肺组织中MMP3、SPP1和IGF1蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　IPF组织中差异表达FAMRGs的筛选

针对GSE47460数据集进行差异表达分析，如图1A火山图所示，共鉴定出870个DEGs，包括578个上调基因和292个下调基因。图1B和C分别显示了前50个上调基因和前50个下调基因的热图。将FAMRGs与鉴定出来的DEGs进行交叉分析，最终筛选出182个差异表达FAMRGs（图1D）。

2.2　IPF组织中差异表达FAMRGs的富集分析

对182个差异表达FAMRGs进行GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析。GO功能富集分析结果显示：生物过程（biological process， BP）方面，上述基因主要富集于激素调节水平、对肽类物质的反应和对外源性刺激的反应等（图2A）；细胞组成（cellular component，CC）方面，主要富集于含胶原蛋白的细胞外基质、内质网腔和分泌颗粒腔等（图2B）；分子功能（molecular function，MF）涉及信号受体激动剂活性、受体配体活性和细胞因子活性等（图2 C）。KEGG信号通路富集分析结果显示：上述基因主要与白细胞介素17（interleukin-17，IL-17）信号通路、晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体（advanced glycation end product-receptor of advanced glycation end product，AGE-RAGE）信号通路和缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信号通路等有关（图2D和表1）。

2.3　PPI网络构建及IPF组织中关键FAMRGs的鉴定

将差异表达FAMRGs导入到STRING在线数据库进行PPI分析，然后采用Cytoscape软件获得1个由181个节点和947条连线构成的PPI网络图（图3A）。采用CytoHubba插件下的MCC算法获得前10位关键FAMRGs，并构建PPI网络图（图3B），上述10个基因分别为白细胞介素6（interleukin-6， IL-6）、 MMP3、 白 细 胞 介 素 1α（interleukin-1α， IL-1α）、 前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2， PTGS2）、SPP1、 基质金属蛋白酶1 （matrix metalloproteinase 1，MMP1）、 IGF1、丝氨酸蛋白酶抑制剂家族E成员1（serpin family E member 1，SERPINE1）、Fos原癌基因（Fos proto-oncogene，FOS）和集落刺激因子3（colony stimulating factor 3，CSF3）。

2.4　关键FAMRGs在GSE150910数据集中的验证

通过在GSE150910数据集中验证上述10个关键FAMRGs在IPF组织和正常肺组织中的表达差异，结果显示：MMP3、SPP1和IGF1基因在GSE150910和GSE47460数据集中均呈现显著差异表达，与正常肺组织比较，上述3个基因在IPF组织中明显高表达（P<0.001）（图4A）。进一步绘制上述3个FAMRGs在这2个数据集中的诊断ROC曲线（图4B），结果显示：在GSE150910数据集中，MMP3、SPP1和IGF1基因的ROC曲线下面积（area under the curve，AUC）分别为0.729［95%置信区间（confidence interval，CI）：0.659~0.799， P<0.001］、 0.852（95%CI：0.799~0.905，P<0.001）和0.896（95%CI：0.852~0.939，P<0.001）；在GSE47460数据集中，MMP3、SPP1和IGF1基因的AUC分别为0.838（95%CI：0.784~0.892， P<0.001）、0.854 （95%CI：0.804~0.905，P<0.001）和0.918（95%CI：0.881~0.955，P<0.001）。上述3个基因在IPF诊断方面具有良好的准确性，因此，最终确定MMP3、SPP1和IGF1为核心FAMRGs。

2.5　IPF免疫浸润和核心FAMRGs与免疫细胞浸润的关系

对GSE47460和GSE150910数据集进行免疫浸润分析，如图5A和5B所示，与正常肺组织比较，在2个数据集中IPF组织中浆细胞、调节性T细胞、M0型巨噬细胞和静息肥大细胞表达均明显上调（P<0.05），而静息CD4记忆T细胞、静息自然杀伤（natural killer，NK）细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞表达均明显下调（P<0.05），最终筛选出9种在IPF组织和正常肺组织中呈差异表达的免疫细胞类型。将IPF组织中MMP3、SPP1和IGF1基因的表达水平与上述9种免疫细胞的表达水平进行相关性分析，如图5C和D所示，在这2个数据集中，SPP1基因表达水平与M0型巨噬细胞表达水平均呈显著正相关关系（GSE47460：r=0.606，P<0.001；GSE150910：r=0.535，P<0.001），与单核细胞的表达水平均呈显著负相关关系（GSE47460：r=-0.578，P<0.001；GSE150910：r=-0.453，P<0.001）。

2.6　3组大鼠肺组织纤维化程度和肺组织中MMP3、SPP1和IGF1蛋白表达水平

3组大鼠肺组织进行Masson染色，结果如图6所示，对照组大鼠肺组织仅见支气管壁周围少量纤维化，IPF组大鼠肺组织可见肺间质、支气管壁及血管壁大量蓝色胶原纤维沉积；与IPF组比较，吡非尼酮组大鼠肺组织可见胶原纤维沉积明显减少。Western blotting法检测结果显示：与对照组比较，IPF组大鼠肺组织中MMP3、SPP1和IGF1蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；与IPF组比较，吡非尼酮组大鼠肺组织中MMP3、SPP1和IGF1蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。见图7。通过外部实验，最终验证了MMP3、SPP1和IGF1为IPF组织中的核心FAMRGs。

3 讨 论

本研究共筛选出182个差异表达的FAMRGs，GO功能富集分析提示上述基因主要涉及激素调节、对肽类物质的反应、信号受体激动剂活性和细胞因子活性等功能，CC主要涉及细胞外基质和内质网腔等。研究^［9］显示：脂肪酸的合成和代谢与甲状腺激素的调节具有密切联系，甲状腺激素可能通过调节核受体亚家族2 F组成员2（nuclear receptor subfamily 2 group F member 2，NR2F2）基因抑制成纤维细胞活化和细胞外基质产生，改善小鼠肺纤维化^［10］，但目前脂肪酸代谢紊乱是否涉及甲状腺激素信号传导参与IPF发病尚未见相关报道，有待进一步探索。瘦素和脂联素是由脂肪组织产生的肽类物质，在调控脂肪酸代谢中发挥重要作用，目前这2种物质如何参与IPF发病存在争议，ENOMOTO等^［11］发现血清瘦素和脂联素水平在IPF急性加重期患者中明显升高，但WANG等^［12］发现脂联素通过抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路降低肺组织中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6和白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）等细胞因子水平，发挥抗纤维化作用。本研究中KEGG信号通路主要富集于IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路和缺氧诱导因子-1信号通路等，IL-17作为一种促炎细胞因子，其通过调节脂肪酸代谢中的关键基因促进肝脂肪变性^［13］，而IL-17与肺纤维化的发病和进展密切相关。IL-17A通过产生TGF-β诱导肺泡上皮细胞的上皮-间质转化，并抑制自噬，达到促纤维化效应^［14］。AGEs是由蛋白质和脂质在衰老过程中与各种氧化剂的非酶促反应中获得，RAGE与肺泡稳态和肺纤维化有关，而内源性分泌RAGE可抑制RAGE与配体相互作用影响IPF发病进程^［15］。

本研究结果显示：MMP3、SPP1和IGF1基因为在IPF组织中上调的FAMRGs。MMP3作为MMP家族中的一员，其与脂肪酸代谢调节存在密切关联。DENG等^［16］发现：棕榈酸可上调MMP3 mRNA的表达，促进软骨细胞炎症反应，而二十碳五烯酸可抑制MMP3和MMP13表达，从而抑制棕榈酸对软骨细胞的炎症作用。多数MMP均具有促进肺纤维化的作用，其中MMP3可通过多种途径促进IPF，包括激活肺上皮细胞中的β-连环蛋白（β-catenin）信号转导促进上皮-间质转化以及抑制肺泡上皮细胞修复，促进其凋亡等^［17］。SPP1与骨骼矿化和重塑、细胞黏附和炎症反应等功能有关，敲除小鼠肝细胞中SPP1表达可促进脂肪酸氧化并改善酒精相关性肝病^［18］，而SPP1已被发现具有普遍的促纤维化作用，MORSE等^［19］发现SPP1在IPF的巨噬细胞亚群中表达水平升高，YUE等^［20］研究表明：SPP1过表达通过磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路促进IPF成纤维细胞增殖。IGF1具有促进生长、调节代谢和免疫等作用，也参与脂肪酸代谢调节。游离脂肪酸可诱导内质网应激并抑制软骨细胞中IGF1介导的信号转导，促进骨关节炎的发展^［21］。IGF-1及其信号通路也被证实广泛参与肺纤维化的发展，ZHANG等^［22］发现IGF1通过ROS介导的AKT/糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）信号驱动NF-κB/NOD样受体家族3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）通路，刺激煤尘颗粒诱导肺纤维化。DING等^［23］发现中药红景天可抑制IGF1信号通路从而改善肺泡上皮细胞衰老，抑制IPF发展。

免疫细胞浸润和免疫微环境失调参与IPF进展。本研究对GSE47460和GSE150910数据集进行免疫浸润分析，结果显示：与正常肺组织比较，IPF组织中浆细胞、调节性T细胞、M0型巨噬细胞和静息肥大细胞的表达水平明显升高，与WU等^［24］研究结果一致。在IPF组织中，SPP1表达水平与M0型巨噬细胞表达水平呈正相关关系，与单核细胞表达水平呈负相关关系。肺泡损伤会促进单核细胞衍生的巨噬细胞募集以及巨噬细胞的极化，通过释放促纤维化介质激活成纤维细胞分化、积累，促进IPF发生^［25］。YANG等^［26］研究表明：SPP1基因在IPF患者肺组织中呈现高表达，并与巨噬细胞活性呈正相关关系，敲低SPP1基因抑制巨噬细胞纤维化相关因子的分泌以及上皮细胞与成纤维细胞的上皮-间质转化。基于这一发现，以SPP1基因及其下游免疫信号通路作为靶点有望为新型靶向治疗的研发提供线索。

综上所述，本研究最终确定了MMP3、SPP1和IGF1基因为IPF组织中的FAMRGs，并探讨了上述基因与IPF免疫微环境之间的关系，这一发现对于突破IPF治疗瓶颈，开发新型靶向治疗药物提供了策略。未来需进一步深入探索上述基因如何介导脂肪酸代谢相关分子通路参与IPF的发病机制。

参考文献

[1] 张明悦， 侯 艳. 脂联素在特发性肺纤维化中的作用机制及应用研究进展［J/OL］. 解放军医学杂志， 1-12［2025-11-1］.

[2] MARTINEZ F J， COLLARD H R， PARDO A， et al. Idiopathic pulmonary fibrosis［J］. Nat Rev Dis Primers， 2017， 3： 17074.

[3] LI X H， WANG Y H， LIANG J J， et al. Bergenin attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice via inhibiting TGF-β1 signaling pathway［J］. Phytother Res， 2021， 35（10）： 5808-5822.

[4] BERHAN A， HARRIS T， JAFFAR J， et al. Cellular microenvironment stiffness regulates eicosanoid production and signaling pathways［J］. Am J Respir Cell Mol Biol， 2020， 63（6）： 819-830.

[5] JUNG M Y， KANG J H， HERNANDEZ D M， et al. Fatty acid synthase is required for profibrotic TGF-β signaling［J］. FASEB J， 2018， 32（7）： 3803-3815.

[6] KREUTER M， BONELLA F， MAHER T M， et al. Effect of statins on disease-related outcomes in patients with idiopathic pulmonary fibrosis［J］. Thorax， 2017， 72（2）： 148-153.

[7] XU M M， ZHOU H， HU P， et al. Identification and validation of immune and oxidative stress-related diagnostic markers for diabetic nephropathy by WGCNA and machine learning［J］. Front Immunol， 2023， 14： 1084531.

[8] XU S， LI X Z， ZHANG S H， et al. Oxidative stress gene expression， DNA methylation， and gut microbiota interaction trigger Crohn’s disease： a multi-omics Mendelian randomization study［J］. BMC Med， 2023， 21（1）： 179.

[9] SINHA R A， SINGH B K， YEN P M. Direct effects of thyroid hormones on hepatic lipid metabolism［J］. Nat Rev Endocrinol， 2018， 14（5）： 259-269.

[10] WANG L， LI Z Z， WAN R Y， et al. Single-cell RNA sequencing provides new insights into therapeutic roles of thyroid hormone in idiopathic pulmonary fibrosis［J］. Am J Respir Cell Mol Biol， 2023， 69（4）： 456-469.

[11] ENOMOTO N， OYAMA Y， YASUI H， et al. Analysis of serum adiponectin and leptin in patients with acute exacerbation of idiopathic pulmonary fibrosis［J］. Sci Rep， 2019， 9（1）： 10484.

[12] WANG X， YANG J， WU L Q， et al. Adiponectin inhibits the activation of lung fibroblasts and pulmonary fibrosis by regulating the nuclear factor kappa B （NF-κB） pathway［J］. Bioengineered， 2022， 13（4）： 10098-10110.

[13] SHI W D， ZHU Q， GU J， et al. Anti-IL-17 antibody improves hepatic steatosis by suppressing interleukin-17-related fatty acid synthesis and metabolism［J］. Clin Dev Immunol， 2013， 2013： 253046.

[14] SENOO S， HIGO H， TANIGUCHI A， et al. Pulmonary fibrosis and type-17 immunity［J］. Respir Investig， 2023， 61（5）： 553-562.

[15] YAMAGUCHI K， IWAMOTO H， MAZUR W， et al. Reduced endogenous secretory RAGE in blood and bronchoalveolar lavage fluid is associated with poor prognosis in idiopathic pulmonary fibrosis［J］. Respir Res， 2020， 21（1）：145.

[16] DENG C H， PRESLE N， PIZARD A， et al. Beneficial impact of eicosapentaenoic acid on the adverse effects induced by palmitate and hyperglycemia on healthy rat chondrocyte［J］. Int J Mol Sci， 2024， 25（3）：1810.

[17] CRAIG V J， ZHANG L， HAGOOD J S， et al. Matrix metalloproteinases as therapeutic targets for idiopathic pulmonary fibrosis［J］. Am J Respir Cell Mol Biol， 2015， 53（5）： 585-600.

[18] DAS S， SUBRAMANIYAM N， ALÉN R， et al. Ablation of secreted phosphoprotein-1 in hepatocytes increases fatty acid oxidation and ameliorates alcohol-associated liver disease［J］. Alcohol Clin Exp Res （Hoboken）， 2024， 48（5）： 781-794.

[19] MORSE C， TABIB T， SEMBRAT J， et al. Proliferating SPP1/MERTK-expressing macrophages in idiopathic pulmonary fibrosis［J］. Eur Respir J， 2019， 54（2）： 1802441.

[20] YUE B Q， XIONG D， CHEN J， et al. SPP1 induces idiopathic pulmonary fibrosis and NSCLC progression via the PI3K/Akt/mTOR pathway［J］. Respir Res， 2024， 25（1）： 362.

[21] NAZLI S A， LOESER R F， CHUBINSKAYA S， et al. High fat-diet and saturated fatty acid palmitate inhibits IGF-1 function in chondrocytes［J］. Osteoarthritis Cartilage， 2017， 25（9）： 1516-1521.

[22] ZHANG Y C， LIANG J J， CAO N D， et al. Coal dust nanoparticles induced pulmonary fibrosis by promoting inflammation and epithelial-mesenchymal transition via the NF-κB/NLRP3 pathway driven by IGF1/ROS-mediated AKT/GSK3β signals［J］. Cell Death Discov， 2022， 8（1）： 500.

[23] DING C C， GUO Z Z， LIAO Q， et al. Network pharmacology and machine learning reveal salidroside’s mechanisms in idiopathic pulmonary fibrosis treatment［J］. J Inflamm Res， 2024， 17： 9453-9467.

[24] WU Z N， CHEN H， KE S W， et al. Identifying potential biomarkers of idiopathic pulmonary fibrosis through machine learning analysis［J］. Sci Rep， 2023， 13（1）： 16559.

[25] PERROT C Y， KARAMPITSAKOS T， HERAZO-MAYA J D. Monocytes and macrophages： emerging mechanisms and novel therapeutic targets in pulmonary fibrosis［J］. Am J Physiol Cell Physiol， 2023， 325（4）： C1046-C1057.

[26] YANG X L， LIU Z Q， ZHOU J W， et al. SPP1 promotes the polarization of M2 macrophages through the Jak2/Stat3 signaling pathway and accelerates the progression of idiopathic pulmonary fibrosis［J］. Int J Mol Med， 2024， 54（4）： 89.

基金资助

福建省科技厅科技创新联合资金项目(2024Y9024)

福建省科技厅自然科学基金 （青年创新） 项目(2023J05229)