miR-378对缺氧/复氧引发心肌细胞损伤的保护作用及其机制

Protective effect of miR-378 on myocardial cell injury induced by hypoxia/reoxygenation and its mechanism

摘要

目的 探讨微小RNA（miR）-378在心肌缺血再灌注（I/R）引起的心肌细胞损伤中的作用，并阐明其作用机制。 方法 培养人心肌细胞AC16和人单核巨噬细胞THP-1，首先将miR-378模拟物（mimics）及其阴性对照（miR-NC）分别转染至THP-1细胞中，分为对照组、miR-NC组和miR-378 mimics组，对照组THP-1细胞正常培养，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测转染后各组THP-1细胞中miR-378表达水平以及M1型巨噬细胞分泌物［诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素6（IL-6）］和M2型巨噬细胞分泌物［精氨酸酶1（Arg-1）、 转化生长因子β1（TGF-β1）、 白细胞介素4（IL-4）和白细胞介素10（IL-10）］mRNA表达水平，Western blotting法检测各组THP-1细胞中M1型巨噬细胞表面标志蛋白分化簇86（CD86）和M2型巨噬细胞表面标志蛋白分化簇206（CD206）表达水平。AC16细胞进行缺氧/复氧（H/R）处理模拟I/R心肌细胞损伤，并与不同处理的THP-1细胞建立共培养体系，分为对照组（上室为AC16细胞，下室为THP-1细胞）、H/R组（上室为H/R诱导的AC16细胞，下室为THP-1细胞）、miR-NC+H/R组（上室为H/R诱导的AC16细胞，下室为转染miR-NC 的THP-1细胞）和miR-378 mimics+H/R组（上室为H/R诱导的AC16细胞，下室为转染miR-378 mimics的THP-1细胞）。采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测各组AC16细胞活性，试剂盒检测各组AC16细胞中丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）水平及超氧化物歧化酶（SOD）活性以及细胞上清液中乳酸脱氢酶（LDH）活性。 结果 RT-qPCR法和Western blotting法，与对照组和miR-NC组比较，miR-378 mimics组THP-1细胞中miR-378表达水平明显升高（P<0.05），THP-1细胞中iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平和CD86蛋白表达水平明显降低（P<0.05），THP-1细胞中Arg-1、TGF-β1、IL-4和IL-10 mRNA表达水平以及CD206蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；CCK-8法和试剂盒法，与对照组比较，H/R组AC16细胞活性明显降低（P<0.05），细胞中MDA和ROS水平明显升高（P<0.05），SOD活性明显降低（P<0.05），细胞上清液中LDH活性明显升高（P<0.05）；与H/R组比较，miR-378 mimics+H/R组AC16细胞活性明显升高（P<0.05），细胞中MDA和ROS水平明显降低（P<0.05），SOD活性明显升高（P<0.05），细胞上清液中LDH活性明显降低（P<0.05）。 结论 miR-378可减轻H/R所致的心肌细胞损伤，其作用机制可能与调节巨噬细胞向M2型极化有关。

Abstract

Objective To discuss the role of microRNA （miR）-378 in cardiomyocyte injury induced by myocardial ischemia reperfusion （I/R）， and to clarify its mechanism. Methods The human cardiomyocytes AC16 and human monocyte macrophages THP-1 were cultured. Firstly， miR-378 mimics and its negative control （miR-NC） were transfected into the THP-1 cells respectively.The cells were divided into control group， miR-NC group and miR-378 mimics group， the THP-1 cells in control group were cultured normally. Real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） method was used to detect the expression level of miR-378 and the expression levels of M1 macrophage secreted factors ［inducible nitric oxide synthase （iNOS）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β） and interleukin-6 （IL-6）］ and M2 macrophage secreted factors ［arginase-1 （Arg-1）， transforming growth factor-β1 （TGF-β1）， interleukin-4 （IL-4） and interleukin-10 （IL-10）］ in the THP-1 cells after transfected； Western blotting method was used to detect the expression levels of M1 macrophage surface marker protein cluster of differentiation 86 （CD86） and M2 macrophage surface marker protein cluster of differentiation 206 （CD206）. The AC16 cells underwent hypoxia/reoxygenation （H/R） treatment to simulate I/R cardiomyocyte injury， and were co-cultured with differently treated THP-1 cells. The cells were divided into control group （upper chamber containing AC16 cells， lower chamber containing THP-1 cells）， H/R group （upper chamber containing H/R-induced AC16 cells， lower chamber containing THP-1 cells）， miR-NC+H/R group （upper chamber containing H/R-induced AC16 cells， lower chamber containing THP-1 cells transfected with miR-NC） and miR-378 mimics+H/R group （upper chamber containing H/R-induced AC16 cells， lower chamber containing THP-1 cells transfected with miR-378 mimics）. Cell counting kit-8 （CCK-8） method was used to detect the activities of the AC16 cells in various groups； kits were used to detect the levels of malondialdehyde （MDA） and reactive oxygen species （ROS） and the activity of superoxide dismutase （SOD） in the AC16 cells in various groups as well as the lactate dehydrogenase （LDH） activity in the cell supernatant. Results The RT-qPCR method and Western blotting method results showed that compared with control group and miR-NC group， the expression level of miR-378 in the THP-1 cells in miR-378 mimics group was significantly increased （P<0.05）； the expression levels of iNOS， TNF-α， IL-1β， and IL-6 mRNA and the expression level of CD86 protein in the THP-1 cells were significantly decreased （P<0.05）； the expression levels of Arg-1， TGF-β1， IL-4， and IL-10 mRNA and the expression level of CD206 protein in the THP-1 cells were significantly increased （P<0.05）. The CCK-8 method and kit method results showed that compared with control group， the activity of the AC16 cells in H/R group was significantly decreased （P<0.05）， the levels of MDA and ROS in the cells were significantly increased （P<0.05）， the activity of SOD was significantly decreased （P<0.05）， and the LDH activity in the cell supernatant was significantly increased （P<0.05）. Compared with H/R group， the activity of the AC16 cells in miR-378 mimics+H/R group was significantly increased （P<0.05）， the levels of MDA and ROS in the cells were significantly decreased （P<0.05）， the activity of SOD was significantly increased （P<0.05）， and the LDH activity in the cell supernatant was significantly decreased （P<0.05）. Conclusion miR-378 can alleviate H/R-induced cardiomyocyte injury， and its mechanism may be related to regulating macrophage polarization towards the M2 phenotype.

Graphical abstract

关键词

心肌缺血再灌注 / 微小RNA-378 / 心肌细胞 / 巨噬细胞 / 缺氧/复氧

Key words

Myocardial ischemia-reperfusion / MicroRNA-378 / Cardiomyocytes / Macrophages / Hypoxia/reoxygenation

随着现代生活方式和饮食习惯的显著变化，冠状动脉疾病逐渐成为全球范围内危害人类健康的主要疾病之一。冠状动脉的严重狭窄或急性闭塞可能导致心肌缺血甚至心肌坏死，因此，尽早实施心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）治疗以恢复心肌血供，是目前最有效的干预措施^［1］。然而，在I/R治疗过程中，缺血心肌血供的快速恢复并不会改善已受损的组织，反而可能加重并延长心肌细胞的损伤，这种现象被称为I/R损伤^［2-3］。目前尚缺乏有效的治疗方法来减轻心肌I/R损伤。微小RNA（microRNA，miRNA）是一大类在转录后水平调控靶基因表达的短链非编码RNA分子，长度为21~24个核苷酸。miRNA广泛存在于不同类型的细胞中，并在多种人类疾病中发挥重要作用。近年来，研究^［4］表明：miRNA在心肌I/R损伤中发挥关键作用，部分miRNA可能作为临床治疗的新靶点。研究^［5］显示：在过氧化氢诱导的心肌细胞损伤中miR-378表达水平降低，提高其表达水平可通过抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase） 3/9活性，减少过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡和炎症细胞因子释放。在结扎小鼠左前降支冠状动脉建立的心肌I/R损伤模型中，过表达miR-378能够减轻心肌损伤并抑制炎症浸润^［6］。然而，miR-378在心肌I/R损伤中的具体作用机制仍未完全阐明。因此，本研究探讨miR-378在体外缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）诱导的心肌细胞I/R损伤中的作用，并初步阐明其作用机制，为临床治疗心肌I/R损伤提供实验依据。

1 材料与方法

1.1　细胞、主要试剂和仪器

人心肌细胞AC16购自上海匹拓生物科技有限公司，人单核细胞白血病细胞THP-1购自武汉尚恩生物技术有限公司。胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司，1%青-链霉素双抗液、RPMI-1640培养基和DMEM培养基购自美国HyClone公司， Lipofectamine RNAiMAX购自美国Invitrogen公司，TRIzol和反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司，miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒和二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白质定量试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，PowerUp SYBR Green Master试剂盒购自美国ABI公司，快速蛋白裂解液购自上海圻明生物科技有限公司，Transwell细胞共培养室购自上海睿安生物科技有限公司，细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8，CCK-8）试剂购自上海贝博生物科技有限公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒购自上海吉至生化科技有限公司，活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒购自上海优利科生命科学有限公司，乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检测试剂盒购自北京伊塔生物科技有限公司，兔抗分化簇86（cluster of differentiation 86，CD86）多克隆抗体、兔抗分化簇206（cluster of differentiation 206，CD206）多克隆抗体和兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗体购自英国Abcam公司。基因引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，miR-378模拟物（mimics）及其阴性对照（miR-NC）由上海吉凯基因有限公司设计并合成。BSC-180C型细胞培养箱购自广州科文生物技术有限公司，THZ-24-S型摇床购自江苏新春兰科学仪器有限公司，AU680型酶标仪购自美国Beckman Coulter公司，CFX96型实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）系统购自美国Bio-Rad公司，EPS-200型电转仪购自北京尤尼普实验仪器有限公司。

1.2　AC16细胞和THP-1细胞培养

AC16细胞培养于含有10%胎牛血清、1%青-链霉素双抗液的DMEM培养基中。THP-1细胞培养于含有10%胎牛血清、1%青-链霉素双抗液的RPMI-1640培养基中，上述2种细胞均于37 ℃、5%CO₂的培养箱中静置培养，当细胞生长至对数生长期时，取细胞进行后续实验研究。

1.3　THP-1细胞转染miR-378模拟物（miR-378 mimics）

将培养的巨噬细胞接种于6孔细胞培养板，密度为每孔5×10⁴个细胞，转染时细胞融合度为80%，分3组进行转染：对照组、miR-NC组和miR-378 mimics组。采用Lipofectamine RNAiMAX试剂进行转染，将Opti-MEM分别与miR-NC和miR-378 mimics混合，再将混合物添加到THP-1细胞中，分别记为miR-NC组和miR-378 mimics组，以未经转染、正常培养的THP-1细胞作为对照组。将培养板置于37 ℃、5% CO₂的培养箱中，4 h后更换为新鲜培养基继续培养，48 h后收集细胞，进行后续实验。

1.4　RT-qPCR法检测各组THP-1细胞中miR-378和巨噬细胞分泌物mRNA表达水平

收集转染后的各组THP-1细胞，采用TRIzol法从细胞中分离总RNA，再将其逆转录为cDNA，保存于-20 ℃冰箱中。采用RT-qPCR实验扩增目的基因，检测miR-378以及诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase， iNOS）、 肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白 细 胞 介 素 1β（interleukin-1β， IL-1β）、 白细胞介素6 （interleukin-6，IL-6）、精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）、转化生长因子β1 （transforming growth factor-β1， TGF-β1）、白细胞介素4 （interleukin-4， IL-4） 和白细胞介素10（interleukin-10，IL-10）mRNA表达水平，以U6作为miR-378内参，用miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒进行检测；以GAPDH作为其余基因的内参，用PowerUp SYBR Green Master试剂盒进行检测。反应结束后，采用2^-ΔΔCt法计算各目的基因mRNA表达水平。引物序列见表1。

1.5　Western blotting法检测各组THP-1细胞中M1型巨噬细胞表面标志蛋白CD86和M2型巨噬细胞表面标志蛋白CD206表达水平

使用蛋白裂解液提取转染后的各组THP-1细胞总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。将等量蛋白上样至凝胶孔，在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）上进行电泳，分离后的蛋白电转至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，脱脂奶粉封闭1 h后，依次加入稀释后的兔抗CD86多克隆抗体（1∶1 000）、兔抗CD206多克隆抗体（1∶1 000），以兔抗GAPDH多克隆抗体（1∶1 000）作为内参，置于4 ℃摇床，将抗体与膜共孵育。次日，加入稀释的二抗（1∶5 000），置于室温下孵育1 h。结束后，采用增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）技术显色，凝胶系统成像拍照，Image J软件分析蛋白条带灰度值，并计算CD86和CD206蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参GAPDH蛋白条带灰度值。

1.6　共培养体系的构建、分组和处理

使用Transwell细胞共培养室进行THP-1细胞与AC16细胞的共培养，将AC16细胞以每孔2×10⁵个的密度接种到共培养室的上室，将THP-1细胞以每孔2×10⁶个的密度接种到共培养室的下室，中间有0.4 μm微孔膜，确保培养液及可溶性分析可以透过。实验分为4组，具体分组及处理方法如下：①对照组，上室为AC16细胞，下室为THP-1细胞；②H/R组，上室为H/R诱导的AC16细胞，下室为THP-1细胞；③miR-NC+H/R组，上室为H/R诱导的AC16细胞，下室为转染miR-NC的THP-1细胞；④miR-378 mimics+H/R组，上室为H/R诱导的AC16细胞，下室为转染miR-378 mimics的THP-1细胞，于37 ℃、5% CO₂的培养箱中共培养 24 h。在共培养前，参考文献［7］方法对AC16细胞进行H/R处理模拟I/R心肌细胞损伤：将不含糖和血清的DMEM培养基经过95% N₂和5% CO₂混合气体平衡2 h，作为饱和缺氧液，除对照组外的其余3组AC16细胞均换用此饱和缺氧液，置于37 ℃、95% N₂和5% CO₂的缺氧培养箱中培养8 h，进行缺氧处理；再换用含糖和血清的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO₂的正常培养箱中培养8 h，进行复氧处理。

1.7　CCK-8法检测各组AC16细胞活性

收集“1.2”处理后的AC16细胞，调整细胞以每孔5×10⁴个的密度接种于96孔细胞培养板中，常规过夜培养后，向每孔细胞中加入10 μL CCK-8试剂，再将细胞置于37 ℃、5% CO₂的培养箱中静置孵育2 h。采用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度（A）值，计算细胞活性。细胞活性=（实验孔A值-空白孔A值）/（对照孔A值-空白孔A值）×100%。

1.8　采用试剂盒检测各组AC16细胞中MDA和ROS水平及SOD活性以及细胞上清液中LDH活性

AC16细胞按照“1.2”分组处理后，分别收集细胞和细胞培养基上清液，按照MDA、ROS、SOD和LDH检测试剂盒说明书操作，测定各组细胞中MDA和ROS水平及SOD活性以及细胞上清液中LDH活性。

1.9　统计学分析

采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。各组THP-1细胞中miR-378表达水平，M1型巨噬细胞分泌物iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平，M2型巨噬细胞分泌物Arg-1、TGF-β1、IL-4和IL-10 mRNA表达水平，巨噬细胞表面标志蛋白CD86和CD206表达水平，各组AC16细胞活性，AC16细胞中MDA和ROS水平及SOD活性以及细胞上清液中LDH活性均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　各组THP-1细胞中miR-378表达水平

THP-1细胞转染后，RT-qPCR法检测结果显示：与对照组（1.00±0.04）和miR-NC组（1.02±0.08）比较，miR-378 mimics组THP-1细胞中miR-378表达水平（3.75±0.39）明显升高（P<0.05）。

2.2　各组THP-1细胞中巨噬细胞分泌物mRNA表达水平

RT-qPCR法检测结果显示：与对照组和miR-NC组比较，miR-378 mimics组THP-1细胞中M1型巨噬细胞分泌物iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平明显降低（P<0.05），M2型巨噬细胞分泌物Arg-1、TGF-β1、IL-4和IL-10 mRNA表达水平明显升高（P<0.05）。见表2。

2.3　各组THP-1细胞中巨噬细胞表面标志蛋白CD86和CD206表达水平

Western blotting法检测结果显示：miR-378 mimics组THP-1细胞中CD86蛋白表达水平明显低于对照组和miR-NC组（P<0.05），而CD206蛋白表达水平明显高于对照组和miR-NC组（P<0.05）。见图1。

2.4　各组AC16细胞活性

CCK-8法检测结果显示：与对照组（100.00%±9.29%）比较，H/R组AC16细胞活性（62.56%±6.70%）明显降低（P<0.05）；与H/R组比较，miR-378 mimics+H/R组AC16细胞活性（83.95%±8.67%）明显升高（P<0.05），miR-NC+H/R组AC16细胞活性（64.68%±6.68%）未发生明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.5　各组AC16细胞中MDA和ROS水平及SOD活性

与对照组比较，H/R组AC16细胞中MDA和ROS水平明显升高（P<0.05），SOD活性明显降低（P<0.05）；与H/R组比较，miR-378 mimics+H/R组AC16细胞中MDA和ROS水平明显降低（P<0.05），SOD活性明显升高（P<0.05），而miR-NC+H/R组AC16细胞中MDA 和ROS水平及SOD活性均未发生明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.6　各组AC16细胞上清液中LDH活性

各组AC16细胞上清液中LDH活性检测结果显示：H/R组AC16细胞上清液中LDH活性（185.56 U·L^-1± 19.09 U·L^-1）明显高于对照组（32.57 U·L^-1±3.54 U·L^-1）（P<0.05）；与H/R组比较，miR-378 mimics+H/R组AC16细胞上清液中LDH活性（97.14 U·L^-1±9.88 U·L^-1） 明显降低 （P<0.05），miR-NC+H/R组AC16细胞上清液中LDH活性（187.08 U·L^-1±19.21 U·L^-1） 未发生明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨 论

尽管心肌I/R可有效减小冠状动脉闭塞所引起的心肌梗死范围，改善患者的临床结局，但恢复血流可能对心肌造成二次损害，加剧心肌组织的功能障碍和结构损伤，导致患者生存率下降^［8］。心肌I/R损伤的发生机制复杂，涉及多种基因的调控。因此，识别I/R后心肌损伤的关键调节因子，对于开发预防或逆转I/R后心肌损伤的治疗策略至关重要。近年来，越来越多的研究^［9-10］证实miR-378在心血管疾病中起重要作用。在血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）诱导的H9c2细胞和小鼠模型中，miR-378表达水平的降低与心肌细胞肥大的发生存在关联，且提高其表达水平能够抑制Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大，减缓心力衰竭的进展^［11］；在压力超负荷心力衰竭大鼠模型中，丹红注射液干预能提高心肌组织中miR-378表达水平，从而改善心功能并减轻心肌纤维化^［12］。上述研究发现为miR-378在心肌I/R损伤中作用的探讨提供了理论支持。

在心肌I/R损伤后，心脏重塑的关键阶段之一是炎症级联反应的启动。巨噬细胞是心脏中最大的免疫细胞亚群，在各种病理条件下表现出显著的可塑性和异质性。根据功能和分泌细胞因子的不同，巨噬细胞主要分为M1型和M2型。在心肌I/R损伤早期，M1型巨噬细胞会迅速募集到心肌梗死区，并释放iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子，进而发挥促炎效应^［13］。在损伤修复阶段，巨噬细胞从M1型极化为M2型，分泌Arg-1、TGF-β1、IL-4和IL-10等细胞因子，促进组织修复和炎症消退^［14］。因此，促进巨噬细胞向M2型极化对于心肌I/R损伤后防止过度炎症反应、促进组织修复、避免不良重塑和收缩功能障碍至关重要。miRNA在巨噬细胞极化过程中的调控作用已得到多项研究^［15-16］的验证。研究^［17］表明：miR-378a可促进巨噬细胞向M2型极化，并抑制巨噬细胞向M1型极化，上述研究为明确miR-378在抗炎及促进组织修复等方面的治疗作用奠定了基础。结合miR-378在心肌损伤中的作用，推测miR-378可能通过调节巨噬细胞极化来影响心肌I/R损伤。本研究将miR-378 mimics转染至THP-1细胞，结果显示：M1型巨噬细胞分泌物iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平以及M1型表面标志蛋白CD86表达水平明显下调，M2型巨噬细胞分泌物Arg-1、TGF-β1、IL-4和IL-10 mRNA表达水平以及M2型表面标志蛋白CD206表达水平明显上调，表明miR-378能够促进巨噬细胞向M2型极化并抑制其向M1型极化。当转染miR-378 mimics的THP-1细胞与H/R处理后的AC16细胞共培养时，相较于未转染的THP-1细胞，AC16细胞活性明显升高。上述研究结果表明：miR-378可通过促进巨噬细胞向M2型极化进而减少I/R诱导的心肌细胞损伤。

心肌I/R损伤的病理机制较为复杂，主要涉及氧化应激、钙超载、炎症反应、线粒体功能障碍和细胞凋亡等^［18-19］。氧化应激在I/R后心肌损伤中发挥关键作用，通过多种途径引起心肌细胞凋亡、自噬和炎症等，从而引起不可逆的心肌细胞损伤和心功能不全。当缺血后进行再灌注时，氧气水平的骤增会诱导ROS大量产生，导致心肌细胞的脂质过氧化以及蛋白质和DNA损伤等，从而引发心肌细胞的不可逆损伤和功能障碍^［20］。因此，减少氧化应激对心肌细胞的损伤是I/R损伤治疗的一个重要措施。LDH是一种广泛存在于各种生物体中稳定胞浆酶，正常情况下不能穿透细胞膜，当细胞受损伤或死亡时其可释放到细胞外，其活性可反映细胞损伤的程度^［21］。本研究结果显示：经H/R诱导后，与未转染的THP-1细胞共培养的AC16细胞比较，转染miR-378 mimics的THP-1细胞共培养后，AC16细胞中MDA和ROS水平明显降低，SOD活性明显升高，细胞上清液中LDH活性明显降低。上述研究结果表明：miR-378通过促进巨噬细胞向M2型极化抑制了氧化应激，减少了LDH的释放，从而对I/R诱导的心肌细胞损伤发挥保护作用。

综上所述，miR-378可通过促进巨噬细胞向M2型极化，进而提高H/R诱导下的心肌细胞活性，抑制氧化应激，减少LDH的释放。本研究为临床治疗I/R诱导的心肌损伤及相关心血管疾病提供了重要靶点。然而，miR-378在心肌I/R损伤中的具体分子机制仍需进一步探讨，本研究是在体外细胞模型中进行的验证，后续还需在动物体内进一步验证。

参考文献

[1] RIOS-NAVARRO C， DAGHBOUCHE-RUBIO N， GAVARA J， et al. Ischemia-reperfusion injury to coronary arteries： Comprehensive microscopic study after reperfused myocardial infarction［J］. Ann Anat Anat Anz， 2021， 238：151785.

[2] XIANG Q， YI X， ZHU X H， et al. Regulated cell death in myocardial ischemia-reperfusion injury［J］. Trends Endocrinol Metab， 2024， 35（3）：219-234.

[3] HEUSCH G. Myocardial ischemia/reperfusion： Translational pathophysiology of ischemic heart disease［J］. Med， 2024， 5（1）：10-31.

[4] GE T， NING B， WU Y Q， et al. microRNA-specific therapeutic targets and biomarkers of apoptosis following myocardial ischemia-reperfusion injury［J］. Mol Cell Biochem， 2024， 479（10）：2499-2521.

[5] XU C R， JIA Z W， CAO X F， et al. Hsa_circ_0007059 promotes apoptosis and inflammation in cardiomyocytes during ischemia by targeting microRNA-378 and microRNA-383［J］. Cell Cycle， 2022， 21（10）：1003-1019.

[6] ZHOU R， JIA Y P， WANG Y， et al. Elevating miR-378 strengthens the isoflurane-mediated effects on myocardial ischemia-reperfusion injury in mice via suppression of MAPK1［J］. Am J Transl Res， 2021， 13（4）：2350-2364.

[7] 徐佩尔， 颜雪芸， 周 乐， 等. 血塞通（三七皂苷）对缺氧/复氧诱导的H9c2心肌细胞氧化损伤的抑制作用［J］. 中国临床药理学杂志， 2022， 38（2）： 113-117.

[8] ALGOET M， JANSSENS S， HIMMELREICH U， et al. Myocardial ischemia-reperfusion injury and the influence of inflammation［J］. Trends Cardiovasc Med， 2023， 33（6）：357-366.

[9] SUN F， ZHUANG Y T， ZHU H X， et al. LncRNA PCFL promotes cardiac fibrosis via miR-378/GRB2 pathway following myocardial infarction［J］. J Mol Cell Cardiol， 2019， 133：188-198.

[10] WANG H， SHI J J， WANG J C， et al. microRNA‑378： an important player in cardiovascular diseases （Review） ［J］. Mol Med Rep， 2023， 28（3）：172.

[11] WANG G L， FENG L L， LIU C X， et al. miR-378 inhibits angiotensin II-induced cardiomyocyte hypertrophy by targeting AKT2［J］. Int Heart J， 2024， 65（3）：528-536.

[12] 熊霞军， 胡思远， 钟森杰， 等. 基于miR-378探讨丹红注射液干预压力超负荷心力衰竭大鼠心肌纤维化机制［J］.湖南中医药大学学报， 2023， 43（3）： 383-390.

[13] CHEN H， HOU Y X， ZHAI Y L， et al. Peli1 deletion in macrophages attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury by suppressing M1 polarization［J］. J Leukoc Biol， 2023， 113（2）：95-108.

[14] ZUO W J， SUN R H， JI Z J， et al. Macrophage-driven cardiac inflammation and healing： insights from homeostasis and myocardial infarction［J］. Cell Mol Biol Lett， 2023， 28（1）：81.

[15] YU W， WANG S， WANG Y Y， et al. microRNA： role in macrophage polarization and the pathogenesis of the liver fibrosis［J］. Front Immunol， 2023， 14：1147710.

[16] KISHORE A， PETREK M. Roles of macrophage polarization and macrophage-derived miRNAs in pulmonary fibrosis［J］. Front Immunol， 2021， 12：678457.

[17] 杨 泉， 何惠宇， 王思凡， 等. 过表达miR-378a促进巨噬细胞向M2极化且抑制巨噬细胞向M1极化［J］. 中国组织工程研究， 2024， 28（13）： 2036-2041.

[18] ZHANG S， YAN F， LUAN F， et al. The pathological mechanisms and potential therapeutic drugs for myocardial ischemia reperfusion injury［J］. Phytomedicine， 2024， 129：155649.

[19] ZHOU M L， YU Y F， LUO X X， et al. Myocardial ischemia-reperfusion injury： therapeutics from a mitochondria-centric perspective［J］. Cardiology， 2021， 146（6）：781-792.

[20] GONG G， WAN W H， ZHANG X H， et al. Management of ROS and regulatory cell death in myocardial ischemia-reperfusion injury［J］. Mol Biotechnol， 2025， 67（5）：1765-1783.

[21] KHAN A A， ALLEMAILEM K S， ALHUMAYDHI F A， et al. The biochemical and clinical perspectives of lactate dehydrogenase： an enzyme of active metabolism［J］. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets， 2020， 20（6）： 855-868.

基金资助

新疆生产建设兵团科技局科技计划项目(2023AB018-07)