溶血磷脂酸联合6-羟基多巴胺对SH-SY5Y细胞凋亡的诱导作用及其机制

Inductive effect of lysophosphatidic acid combined with 6-hydroxydopamine on apoptosis of SH-SY5Y cells and its mechanism

摘要

目的 探讨溶血磷脂酸（LPA）联合6-羟基多巴胺（6-OHDA）对SH-SY5Y细胞凋亡的诱导作用，并阐明其相关作用机制。 方法 采用100 μmol·L^-1 6-OHDA建立帕金森病（PD）细胞模型，选用SH-SY5Y细胞、PC12细胞和N2a细胞，分为对照组（仅用不完全培养基）、4 μmol·L^-1 LPA组、100 μmol·L^-1 6-OHDA组、4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组、10 μmol·L^-1 LPA组和10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组，处理24 h。采用噻唑蓝（MTT）法检测各组SH-SY5Y细胞活性，异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ-FITC）/碘化丙啶（PI）染色结合流式细胞术检测各组SH-SY5Y细胞凋亡率，Western blotting法检测3种细胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）相关蛋白表达水平以及SH-SY5Y细胞中B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）和磷酸化的p38 MAPK（p-p38 MAPK）蛋白以及LPA1受体蛋白表达水平。 结果 与100 μmol·L^-1 6-OHDA组比较，4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组和10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组SH-SY5Y细胞数和细胞活性均明显降低（P<0.05或P<0.01），细胞凋亡率升高（P<0.05或P<0.01）。与100 μmol·L^-1 6-OHDA组比较，4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组和10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组3种细胞中Caspase-3蛋白表达水平无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）；4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组SH-SY5Y细胞中裂解的Caspase-3（Cleaved Caspase-3）蛋白表达水平明显升高（P<0.01）；4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组和10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组PC12细胞中Cleaved Caspase-3蛋白表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）；4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组N2a细胞中Cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高（P<0.05）。与100 μmol·L^-1 6-OHDA 组 比 较， 4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA 和 10 μmol·L^-1 LPA + 100 μmol·L^-1 6-OHDA组SH-SY5Y细胞中Bax和Bcl-2蛋白表达水平无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05），Bax/Bcl-2比值升高（P<0.05）；10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组SH-SY5Y细胞中p38 MAPK蛋白表达水平升高（P<0.05），4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组SH-SY5Y细胞中p-p38 MAPK蛋白表达水平明显升高（P<0.01），p-p38 MAPK/p38 MAPK比值升高（P<0.05）；10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组SH-SY5Y细胞中LPA1受体蛋白表达水平降低（P<0.05）。 结论 LPA与6-OHDA联合应用能明显诱导SH-SY5Y细胞凋亡，其作用机制可能与上调细胞中p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白表达水平有关。

Abstract

Objective To discuss the inductive effect of lysophosphatidic acid （LPA） combined with 6-hydroxydopamine （6-OHDA） on the apoptosis of SH-SY5Y cells， and to clarify its related mechanism. Methods The Parkinson’s disease （PD） cell model was established by using 100 μmol·L^-1 6-OHDA； the SH-SY5Y cells， PC12 cells and N2a cells were selected and divided into control group （incomplete medium only）， 4 μmol·L^-1 LPA group， 100 μmol·L^-1 6-OHDA group， 4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA group， 10 μmol·L^-1 LPA group， and 10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA group， and treated for 24 h. Methylthiazolydiphenyl-tetrazolium bromide（MTT） method was used to detect the activities of the SH-SY5Y cells in various groups； annexin Ⅴ fluorescein isothiocyanate（Annexin Ⅴ-FITC）/propidium iodide（PI） staining and flow cytometry were used to detect the apoptotic rates of the SH-SY5Y cells in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of Caspase-3 related proteins in three kinds of cells and the expression levels of B-cell lymphoma-2 （Bcl-2）， Bcl-2-associated X protein （Bax）， p38 mitogen-activated protein kinase （p38 MAPK）， phosphorylated p38 MAPK （p-p38 MAPK） proteins and LPA1 receptor protein in the SH-SY5Y cells in various groups. Results The MTT assay results showed that compared with 100 μmol·L⁻¹ 6-OHDA group， the numbers and activities of the SH-SY5Y cells in 4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA group and 10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA group were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）. The flow cytometry results showed that compared with 100 μmol·L^-1 6-OHDA group， the apoptotic rates of the SH-SY5Y cells in 4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA group and 10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA group were increased （P<0.05 or P<0.01）. The Western blotting results showed that compared with 100 μmol·L^-1 6-OHDA group， the expression levels of Caspase-3 protein in three kinds of cells in 4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA group and 10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA group had no significant changes， and the differences were not statistically significant （P>0.05）； the expression levels of Cleaved Caspase-3 protein in the SH-SY5Y cells in 4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA group were significantly increased （P<0.01）； the expression levels of Cleaved Caspase-3 protein in the PC12 cells in 4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA group and 10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA group were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）； the expression level of Cleaved Caspase-3 protein in the N2a cells in 4 μmol·L⁻¹ LPA+100 μmol·L⁻¹ 6-OHDA group was increased （P<0.05）. The Western blotting results showed that compared with 100 μmol·L^-1 6-OHDA group， the expression levels of Bax and Bcl-2 proteins in the SH-SY5Y cells in 4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L⁻¹ 6-OHDA group and 10 μmol·L⁻¹ LPA+100 μmol·L⁻¹ 6-OHDA group had no significant changes， and the differences were not statistically significant （P>0.05）， but the Bax/Bcl-2 ratio was increased （P<0.05）； the expression level of p38 MAPK protein in the SH-SY5Y cells in 10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA group was increased （P<0.05）； the expression level of p-p38 MAPK protein in the SH-SY5Y cells in 4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA group was significantly increased （P<0.01）， and the p-p38 MAPK/p38 MAPK ratio was increased （P<0.05）； the expression level of LPA1 receptor protein in the SH-SY5Y cells in 10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA group was decreased （P<0.05）. Conclusion The combined application of LPA and 6-OHDA can significantly induce the apoptosis of SH-SY5Y cells， and its mechanism may be related to the up-regulated expression levels of p38 MAPK and p-p38 MAPK proteins in the cells.

Graphical abstract

关键词

溶血磷脂酸 / 6-羟基多巴胺 / SH-SY5Y细胞 / 细胞凋亡 / p38丝裂原活化蛋白激酶

Key words

Lysophosphatidic acid / 6-hydroxydopamine / SH-SY5Y cell / Apoptosis / p38 mitogen-activated protein kinase

帕金森病（Parkinson disease，PD）是神经系统退行性疾病，病理特征是大脑黑质致密区多巴胺能神经元丢失和路易小体形成^［1-2］，神经炎症通过导致多巴胺能神经元丢失加重PD进展^［3］。PD的病因还包括细胞凋亡、氧化应激和线粒体功能障碍等^［4］。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）下游信号通路包括c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）和细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK），其中p38 MAPK在中枢神经系统炎症反应中发挥重要作用，参与PD的发生发展过程^［5-7］。p38 MAPK是神经炎症的关键介质，参与调节免疫系统的多种功能^［8-9］。6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）的结构与多巴胺能神经元神经递质相似，通过触发氧化应激等相关细胞毒性诱导多巴胺能神经元和去甲肾上腺素能神经元变性，可用于 建 立 晚 期 PD 模 型^［10-13］。溶 血 磷 脂 酸（lysophosphatidic acid，LPA）是一种活跃磷脂信号分子^［14-15］，参与神经系统多个发育过程，如皮质发育、大脑皮层的生长和折叠以及神经元生长锥的出现和回缩等^［16］。LPA通过LPA1~LPA6受体在中枢神经系统疾病中发挥作用^［17-18］。研究^［19］表明：LPA受体在脑组织中呈高丰度表达，且表达于神经祖细胞、神经元和星形胶质细胞等细胞中。LPA可直接促进巨噬细胞中促炎介质的释放，如白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）和活性氧（reactive oxygen species，ROS），加速因巨噬细胞功能障碍和炎症引起的疾病发展^［20］。LPA还可促进核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）的核易位，从而促进炎症因子的产生^［21］。LPA1受体在神经系统高表达，通过ERK和p38 MAPK激活核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族含吡林结构域3炎性小体^［22］。本课题组前期研究^［23］显示：LPA1在6-OHDA诱导的PD大鼠模型中表达下调，提示LPA在PD中的作用仍需深入研究。LPA1受体参与海马区谷氨酸能突触成熟，还在皮质发育、创伤性脑损伤、脊髓损伤和中风中发挥神经保护作用，并且在LPA1基因缺失的小鼠中观察到学习和记忆缺陷现象^［24］，表明LPA1受体在中枢神经系统正常生理活动中发挥重要作用，但LPA1在PD中的作用尚不明确。LPA及其受体在PD中的作用及其分子机制仍未完全阐明，本研究以LPA为切入点，探讨LPA介导p38 MAPK信号通路在6-OHDA诱导的PD细胞模型中的作用，阐明LPA对多巴胺能神经元细胞凋亡的影响以及神经炎症在PD中的作用，旨在为开发靶向LPA的药物及新的PD治疗靶点提供参考。

1 材料与方法

1.1　细胞、主要试剂和仪器

人神经母细胞瘤细胞株（SH-SY5Y细胞）、大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株（PC12细胞）和小鼠脑神经瘤细胞系（N2a细胞）均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。DMEM高糖培养基购自浙江森瑞生物科技有限公司，RPMI Medium 1640培养基购自美国Gibco公司，MEM培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，胎牛血清购自美国OmnimAbs公司，1%青-链霉素混合液购自北京索莱宝生物科技有限公司，细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司，LPA和6-OHDA均购自美国Sigma公司，一抗兔抗β-actin和兔抗B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）购自武汉三鹰生物技术有限公司，一抗兔抗GAPDH购自美国MCE公司，一抗兔抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）、兔抗裂解的Caspase-3（Cleaved Caspase-3）和兔抗LPA1购自美国Abcam公司，一抗Bcl-2、p38 MAPK和磷酸化的p38 MAPK（phosphorylated p38 MAPK，p-p38 MAPK）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司，二抗山羊抗兔IgG购自上海雅酶生物医药科技有限公司，异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白Ⅴ（annexin Ⅴ fluorescein isothiocyanate，Annexin Ⅴ-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）细胞凋亡双染试剂盒购自美国BD公司。Tanon 4600系列全自动化学发光图像分析仪购自上海天能科技有限公司，BD Accuri C6 Plus流式细胞仪购自美国BD公司，Elx800^TM型酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司。

1.2　细胞培养和分组

用无菌生理盐水溶解6-OHDA，配制成一定浓度的母液，分装后保存于-20 ℃环境中，使用时用培养基将6-OHDA稀释至终浓度为100 μmol·L^-1。SH-SY5Y细胞在含10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM高糖培养基中，于37 ℃、5% CO₂条件下培养；PC12细胞在含10%胎牛血清和1%青-链霉素的RPMI Medium 1640培养基中，于37 ℃、5% CO₂条件下培养；N2a细胞在含10%胎牛血清和1%青-链霉素的MEM培养基中，于37 ℃、5% CO₂条件下培养。待细胞生长至合适密度后，分为对照组（仅用不完全培养基）、4 μmol·L^-1 LPA组、100 μmol·L^-1 6-OHDA 组、 4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组、10 μmol·L^-1 LPA 组 和 10 μmol·L^-1 LPA + 100 μmol·L^-1 6-OHDA组，共6组，分别作用细胞24 h，然后进行后续实验操作。

1.3　各组SH-SY5Y细胞数

将待传代的6 cm细胞培养皿中SH-SY5Y细胞制备成1 mL细胞悬液，6孔细胞培养板每孔取150 μL SH-SY5Y细胞悬液接种，各组SH-SY5Y细胞培养24 h后，弃掉旧的培养基，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗1次，光学显微镜100倍视野下观察各组SH-SY5Y细胞状态，各组随机挑选10个不同的视野拍照，拍照后进行细胞计数，将6孔细胞培养板中6个处理组的细胞制备成1 mL的细胞悬液，用血细胞计数板进行计数，记录各组每毫升的细胞数。

1.4　噻唑蓝（methylthiazolydiphenyl-tetrazolium bromide，MTT） 法检测各组SH-SY5Y细胞活性

按照“1.2”中方法，将SH-SY5Y细胞接种于96孔细胞培养板中，分为6组，每组设置3个复孔，各组作用24 h，然后避光加入10 μL MTT溶液，置于培养箱中静置4 h，使MTT与存活的SH-SY5Y细胞充分反应，然后每孔中加入100 μL二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）， 摇床放置15 min， 酶标仪于波长490 nm处测定其吸光度（A）值，计算细胞活性。细胞活性=（实验孔A值-空白孔A值）/（对照孔A值-空白孔A值）×100%，其中对照孔为对照组，空白孔为培养基对照组（用于调零）。

1.5　Annexin Ⅴ-FITC/PI染色结合流式细胞术检测各组SH-SY5Y细胞凋亡率

分别收集各组SH-SY5Y细胞，进行细胞计数，各组细胞数约为每毫升1×10⁶ 个。用提前预冷的PBS缓冲液洗涤各组细胞，4 ℃离心后弃掉上清液，重复2次。然后用100 μL 1×缓冲液重悬各组细胞，各加入5 μL Annexin Ⅴ FITC和5 μL PI吹打混匀，避光15 min后再加入400 μL 1×缓冲液吹打混匀，过400目筛网后，立刻上机进行检测。细胞凋亡率=（早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数）/细胞总数×100%。

1.6　Western blotting法检测3种细胞中相关蛋白表达水平

各组SH-SY5Y细胞、PC12细胞和N2a细胞培养24 h后，收集细胞，提取细胞的总蛋白，Western blotting法具体步骤见参考文献［25］。其中，一抗的稀释比例：β-actin（1∶8 000）、GAPDH（1∶15 000）、 Caspase-3（1∶6 000）、Cleaved Caspase-3（1∶2 000）、LPA1受体（1∶3 000）、Bcl-2（1∶1 000）、BAX（1∶4 000）、p38 MAPK （1∶1 000）和p-p38 MAPK（1∶5 000），二抗山羊抗兔稀释比例为1∶2 000。一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，用化学发光成像系统进行化学发光，保存图像，采用Image J软件进行蛋白条带灰度值分析，以GAPDH和β-actin为内参蛋白，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.7　统计学分析

采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析。各组细胞中Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白表达水平以及LPA1受体蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　各组SH-SY5Y细胞数和细胞活性

SH-SY5Y细胞计数结果显示：与100 μmol·L^-1 6-OHDA组比较，4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组和10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组SH-SY5Y细胞数降低（P<0.01）。见图1。MTT法检测结果显示：与100 μmol·L^-1 6-OHDA组比较，4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA 组 和10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组细胞活性降低（P<0.05或P<0.01）。见表1。

2.2　各组SH-SY5Y细胞凋亡率

Annexin Ⅴ-FITC/PI染色结合流式细胞术检测结果显示：与100 μmol·L^-1 6-OHDA组（20.63%±2.31%）比较，4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA 组 SH-SY5Y 细 胞凋 亡 率（14.37% ± 3.34%） 升 高（P<0.01），10 μmol·L^-1 LPA + 100 μmol·L^-1 6-OHDA 组SH-SY5Y细胞凋亡率（11.80%±2.27%）升高（P<0.05）。见图2。

2.3　各组3种细胞中Caspase-3和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平

Western blotting法检测3种细胞Caspase-3相关蛋白表达情况，结果显示：与100 μmol·L^-1 6-OHDA组比较，4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组和10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组3种细胞中Caspase-3蛋白表达水平无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。与100 μmol·L^-1 6-OHDA组比较，4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组SH-SY5Y细胞中Cleaved Caspase-3蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。见图3A和3B。与100 μmol·L^-1 6-OHDA组比较，4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组和10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组PC12细胞中Cleaved Caspase-3蛋白表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）。见图3C和3D。与100 μmol·L^-1 6-OHDA组比较，4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组N2a细胞中Cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高（P<0.05）。见图3E和3F。

2.4　各组SH-SY5Y细胞中Bax和Bcl-2蛋白表达水平及Bax/Bcl-2比值

Western blotting法检测结 果 显 示：与 100 μmol·L^-1 6-OHDA 组 比 较，4 μmol·L^-1 LPA + 100 μmol·L^-1 6-OHDA 组 和10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组SH-SY5Y细胞中Bax及Bcl-2蛋白表达水平无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）；与100 μmol·L^-1 6-OHDA组比较，4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组SH-SY5Y细胞中Bax/Bcl-2比值升高（P<0.05）。见图4。

2.5　各组SH-SY5Y细胞中p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白表达水平

Western blotting法检测结 果 显 示：与100 μmol·L^-1 6-OHDA 组 比 较，10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA 组SH-SY5Y细胞中p38 MAPK蛋白表达水平明显升高（P<0.05），4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组SH-SY5Y细胞中p-p38 MAPK蛋白表达水平明显升高（P<0.01），4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组p-p38/p38比值升高（P<0.05）。见图5。

2.6　各组SH-SY5Y细胞中LPA1受体蛋白表达水平

Western blotting 法 检 测 结 果 显 示：与100 μmol·L^-1 6-OHDA组比较，10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组SH-SY5Y细胞中LPA1受体蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。见图6。

3 讨 论

LPA受体在中枢神经系统发育过程中参与调节神经元的增殖、迁移和分化。LPA2受体的缺失完全恢复了海马网络兴奋性的变化、谷氨酸能传递的增加和癫痫发作活动，同时抑制LPA1/3受体会诱导炎症和氧化应激从而使脊髓脱髓鞘恶化^［26］；LPA5受体-蛋白激酶D（protein kinase D，PKD）信号可能在BV-2和原代小鼠小胶质细胞中诱导炎症及迁移反应^［27］。提示LPA信号在神经系统疾病的病理过程中发挥重要作用。然而LPA在PD中作用的分子机制仍不清楚，本研究以6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞构建PD细胞模型，探讨LPA信号在PD细胞模型中的分子机制。

本研究中流式细胞术检测结果表明：100 μmol·L^-1 6-OHDA未明显诱导SH-SY5Y细胞凋亡，而联合LPA后能明显提高SH-SY5Y细胞凋亡率。Western blotting法检测结果显示：与100 μmol·L^-1 6-OHDA组比较，LPA的联合应用使SH-SY5Y细胞中Bax/Bcl-2比值和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平明显升高，与流式细胞术检测结果一致，表明LPA联合6-OHDA通过提高凋亡相关蛋白表达水平显著诱导SH-SY5Y细胞凋亡。SH-SY5Y细胞、PC12细胞和N2a细胞均能用来制备PD细胞模型，因此，本研究对PC12细胞和N2a细胞中的凋亡相关蛋白进行平行检测，Western blotting法检测结果显示：与100 μmol·L^-1 6-OHDA组比较，4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA 组 和 10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组在PC12细胞和N2a细胞中Caspase-3蛋白表达水平无明显变化，而Cleaved Caspase-3蛋白表达水平明显升高，与SH-SY5Y细胞检测结果一致，表明LPA与6-OHDA联合应用均可上调SH-SY5Y细胞、PC12细胞和N2a细胞中Cleaved Caspase-3蛋白表达水平，从而诱导上述3种细胞凋亡。

本 研 究 结 果 显 示：10 μmol·L^-1 LPA 和100 μmol·L^-1 6-OHDA联合应用显著抑制了SH-SY5Y细胞中LPA1受体蛋白的表达，与本课题组前期研究LPA1受体蛋白在6-OHDA诱导的PD大鼠模型中表达下调的结果相一致^［23］，提示在PD细胞模型凋亡中，LPA1受体蛋白表达水平降低可能导致细胞氧化应激、细胞凋亡和线粒体功能障碍。本研究结果显示：在SH-SY5Y细胞和N2a细胞中4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组Cleaved Caspase-3 蛋 白 表 达 水 平 明 显 升 高，4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA 组 与100 μmol·L^-1 6-OHDA组相比Cleaved Caspase-3 蛋白表达水平差异有统计学意义，10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组与100 μmol·L^-1 6-OHDA组Cleaved Caspase-3 蛋白表达水平比较差异无统计学意义，其原因可能是由于10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组LPA1受体蛋白表达水平明显降低，从而导致10 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组Cleaved Caspase-3蛋白表达水平低于4 μmol·L^-1 LPA+100 μmol·L^-1 6-OHDA组。6-OHDA诱导PD模型通过触发氧化应激细胞毒性诱导多巴胺能神经元变性，提示LPA可能协同6-OHDA增强细胞氧化应激反应促进细胞凋亡，LPA联合6-OHDA的诱导作用机制复杂，值得进一步实验研究探讨。

MAPK信号通路促进环氧合酶-2的表达，导致小胶质细胞诱导的神经元死亡^［28］，p38 MAPK参与小胶质细胞和星形胶质细胞等介导的神经炎症反应，p38 MAPK还参与细胞氧化应激反应、细胞增殖和细胞凋亡过程，与阿尔茨海默病等神经退行性病变有关^［29］。小胶质细胞是中枢神经系统中的主要免疫细胞，占神经胶质细胞的5%~12%^［30-31］，活化的小胶质细胞是导致PD患者黑质、纹状体和脑脊液中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、转 化 生 长 因 子 β（transforming growth factor-β，TGF-β）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、ROS、一氧化氮和促凋亡蛋白水平升高的原因之一^［32-33］。LPA激活MAPK信号通路促进小胶质细胞神经炎症相关转录因子信号转导及转录激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、信号转导及转录激活蛋白1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）、p65和c-Jun的磷酸化以及IL-6和TNF-α的分泌^［34］，表明MAPK信号通路在神经系统疾病中发挥重要作用。本研究结果显示：LPA联合6-OHDA显著上调SH-SY5Y细胞中p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白表达水平，提示LPA联合6-OHDA可能通过激活p38 MAPK信号通路促进SH-SY5Y细胞凋亡。

综上所述，LPA与6-OHDA联合应用能够显著诱导SH-SY5Y细胞凋亡，其机制可能与上调细胞中p38 MAPK和p-p38 MAPK信号通路蛋白表达水平有关。

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基金资助

山东省卫健委医药卫生科技发展计划项目(2018WS063)

山东省教育厅基金项目(J14LK15)

山东省教育厅国家级大学生创新创业训练计划项目(202010438026)

山东第二医科大学博士科研启动基金科研创新计划项目(2024BKQ048)