特异性蛋白1调控脂肪细胞中弗林蛋白酶表达对白脂素分泌的影响及其机制

Effect of Furin expression regulated by specific protein 1 on asprosin secretion in adipocytes and its mechanism

摘要

目的 探讨肥胖状态下脂肪组织弗林蛋白酶（Furin）基因的转录调控机制及其对脂肪因子白脂素分泌的影响。 方法 将24只C57BL/6J雄性小鼠随机分为正常对照饲料（NCD）组和高脂饲料（HFD）组，每组12只。连续喂养12周以构建饮食性肥胖模型。采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测2组小鼠皮下白色脂肪组织（WAT）（sWAT）和附睾WAT（eWAT）中Furin、原纤维蛋白1（FBN1）及候选转录因子特异性蛋白1（SP1）mRNA表达水平。基于真核基因启动子收集与分析联合项目（JASPAR）数据库筛选Furin基因启动子区候选转录因子。在293T细胞中转染特异性蛋白1（SP1）过表达质粒（pcDNA-SP1组）和包含绿色荧光蛋白（GFP）的对照质粒（pcDNA-GFP组），同时将含Furin启动子区的双荧光素酶报告载体与上述质粒共转染，验证SP1与Furin启动子区之间的调控作用。分离sWAT的基质血管组分（SVF）细胞并诱导分化为成熟脂肪细胞，通过腺病毒转导过表达SP1（Ad-SP1组）或GFP对照（Ad-GFP组）。采用Western blotting法和酶联免疫吸附试验（ELISA）法分别检测Ad-GFP组和Ad-SP1组细胞中SP1和Furin 蛋白表达水平及细胞上清液中白脂素水平。 结果 与NCD组比较，HFD组小鼠体质量、sWAT和eWAT质量均明显升高（P<0.001）。与NCD组比较，HFD组小鼠sWAT和eWAT中Furin和SP1 mRNA表达水平明显升高（P<0.001）。JASPAR数据库预测提示SP1是调控Furin转录的核心候选因子。双荧光素酶实验，与pcDNA-GFP组比较，pcDNA-SP1组293T细胞中荧光素酶活性明显升高（P<0.001）。与Ad-GFP组比较，Ad-SP1组SVF来源的成熟脂肪细胞中SP1和Furin蛋白表达水平明显升高（P<0.001），细胞上清液中白脂素水平明显升高（P<0.001）。 结论 肥胖小鼠WAT及脂肪细胞中SP1 mRNA表达上调，SP1可通过直接结合Furin启动子区增强其转录活性；SP1过表达可上调脂肪细胞中Furin蛋白表达水平，进而促进白脂素分泌。

Abstract

Objective To investigate the transcriptional regulation mechanism of the Furin gene in adipose tissue under obesity conditions and its effect on the secretion of the adipokine asprosin. Methods Twenty-four C57BL/6J mice were randomly divided into normal control diet （NCD） group and high-fat diet （HFD） group， with 12 mice in each group. The mice were fed for 12 consecutive weeks to establish the diet-induced obesity models. Real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR） method was used to detect the expression levels of Furin， fibrillin 1 （FBN1）， and the candidate transcription factor specificity protein 1 （SP1） mRNA in subcutaneous white adipose tissue（WAT） （sWAT） and epididymal WAT（eWAT） of the mice in two groups. Candidate transcription factors for the Furin gene promoter region were screened based on the JASPAR database. In the 293T cells， the SP1 over-expression plasmid （pcDNA-SP1 group） and its control plasmid containing green fluorescence protein （GFP） （pcDNA-GFP group） were transfected. Simultaneously， a dual-luciferase reporter vector containing the Furin promoter region was co-transfected with the aforementioned plasmids to verify the regulatory interaction between SP1 and the Furin promoter. The stromal vascular fraction （SVF） cells from sWAT were isolated and induced to differentiate into mature adipocytes. SP1 （Ad-SP1 group） or GFP control （Ad-GFP group） was overexpressed via adenoviral transduction. Western blotting method and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） were used to detect the expression levels of SP1 and Furin proteins in cells in various groups and the levels of asprosin in the cell supernatant in Ad-GFP and Ad-SP1 groups， respectively. Results Compared with NCD group， the body weight， sWAT weight， and eWAT weight of the mice in HFD group were significantly increased （P<0.001）. Compared with NCD group， the expression levels of Furin and SP1 mRNA in sWAT and eWAT of the mice in HFD group were significantly increased （P<0.001）. JASPAR database prediction suggested that SP1 was a core candidate factor regulating Furin transcription. In the dual-luciferase experiment， compared with pcDNA-GFP group， the luciferase activity in 293T cells in pcDNA-SP1 group was significantly increased （P<0.001）. Compared with Ad-GFP group，the expression levels of SP1 and Furin proteins in SVF-derived mature adipocytes in Ad-SP1 group were significantly increased （P<0.001）， and the level of asprosin in the cell supernatant was significantly increased （P<0.001）. Conclusion The expression of SP1 mRNA in WAT and adipocytes of obese mice was up-regulated. SP1 can enhance the transcriptional activity of Furin by directly binding to its promoter region. SP1 overexpression may upregulate the expression level of Furin protein in adipocytes， promoting the secretion of asprosin.

Graphical abstract

关键词

肥胖 / 弗林蛋白酶 / 特异性蛋白1 / 白脂素 / 转录调控

Key words

Obesity / Furin / Specificity protein 1 / Asprosin / Transcriptional regulation

肥胖及其引发的代谢综合征已成为全球性的公共卫生挑战，其病理过程与脂肪组织内分泌功能紊乱密切相关^［1］。近年来，脂肪因子白脂素作为一种新型代谢调控因子备受关注，其在肥胖患者血清中的水平明显升高^［2］。白脂素由细胞外基质原纤蛋白1（fibrillin 1，FBN1）经弗林蛋白酶（Furin）特异性剪切后释放入血^［3］。尽管已有研究^［4］证实Furin在肝脏和胰岛β细胞中参与胰岛素信号调控，但其在脂肪组织中的表达调控机制及其与白脂素分泌的关联尚不明确。

基质血管组分（stromal vascular fraction，SVF）是从脂肪组织中通过酶解或者机械分离获得的、具有干细胞特性的异质细胞群，包含脂肪源性干细胞、前脂肪细胞和成纤维细胞等多种细胞。其中，脂肪源性干细胞可在体外诱导分化为成熟脂肪细胞，是研究脂肪生成、代谢调控或肥胖机制的常用模型^［5］。特异性蛋白1（specificity protein 1，SP1）作为脂代谢的关键调控因子^［6-7］，与氧化应激和炎症反应密切相关^［8］，但其是否参与肥胖状态下Furin的转录调控尚未可知。本研究探讨Furin在脂肪组织中的转录调控机制，揭示SP1介导的分子调控网络与白脂素分泌的级联反应，以期为肥胖相关代谢紊乱的机制研究提供新视角。

1 材料与方法

1.1　实验动物、细胞、主要试剂和仪器

无特定病原体动物级C57BL/6J雄性小鼠（6周龄，体质量18~20 g）购自北京斯贝福生物技术有限公司。动物生产许可证编号：SCXK（京）2024-0001，动物使用许可证编号：SYXK（新）2024-0010。小鼠饲养于恒温（22±1） ℃、12 h光暗循环环境，自由饮水摄食。本实验方案经石河子大学实验动物伦理委员会批准（伦理批件号：A2024-044）。人胚肾细胞293T购自武汉普诺赛生命科技有限公司，胎牛血清购自苏州伊科赛生物科技有限公司，DMEM培养基购自美国Gibco公司，高脂饲料（high fat diet，HFD）（批号：D12492）和正常对照饲料 （normal control diet， NCD） （批号： D12450J）均购自美国Research Diets公司，RNA提取试剂盒购自上海翌圣生物科技股份有限公司，RNA逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）试剂盒均购自南京诺唯赞生物技术有限公司，白脂素酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自艾比玛特医药科技（上海）有限公司，油红O染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司，Ⅰ型胶原酶、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（isobutylmethylxanthine，IBMX）和地塞米松均购自美国Sigma公司。Furin、SP1和β肌动蛋白（beta-actin，β-actin）抗体均购自武汉三鹰生物技术有限公司，实验用引物、pcDNA-SP1和pGL3-Furin promoter等质粒由北京睿博生物科技公司提供，过表达SP1腺病毒由山东维真生物科技有限公司包装。电泳仪和转膜仪均购自美国Bio-Rad公司，RT-qPCR仪购自杭州博日科技股份有限公司；化学发光检测仪购自美国Promega公司，倒置荧光显微镜购自日本尼康公司，Odyssey荧光成像系统购自美国LI-COR公司。

1.2　小鼠肥胖模型制备和白色脂肪组织（white adipose tissue，WAT）分离及处理

24只小鼠适应性饲养1周后，随机分为2组，每组12只。NCD组小鼠饲喂D12450J标准饲料，HFD组小鼠饲喂D12492高脂饲料，连续喂养12周。每周记录2组小鼠体质量和进食量。喂养结束后，小鼠经腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg·kg^-1）麻醉，分离皮下WAT（subcutaneous WAT，sWAT）及附睾WAT（epididymal WAT，eWAT）。组织样品用预冷的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗3次，用滤纸吸干表面水分。采用刻度尺分别测量2组小鼠sWAT和eWAT长度和宽度，对比其外观，采用分析天平称量WAT质量。取部分组织置于RNA保存液，于-80 ℃保存，用于后续mRNA表达分析。

1.3　RT-qPCR法检测2组小鼠不同组织中Furin、FBN1和SP1 mRNA表达水平

收集2组小鼠不同组织样本，包括sWAT、eWAT、下丘脑、棕色脂肪组织（brown adipose tissue，BAT）、胃、空肠、肝脏和胰腺，采用分析天平称量各组织40 mg，按照总RNA提取试剂盒说明书操作，完成总RNA提取^［9］。采用分光光度计测定RNA浓度及纯度，依据逆转录试剂盒说明将RNA逆转录为cDNA后进行RT-qPCR反应。反应体系总体积为10.0 μL，包含5.0 μL 2×SYBR qPCR Master Mix，正、反向引物（10 μmol·L^-1）各0.4 μL，2.0 μL cDNA模板及2.2 μL无核糖核酸酶水。反应程序：95 ℃预变性20 s；随后进行扩增反应，共40个循环，每个循环包括95 ℃变性10 s和60 ℃退火延伸30 s；扩增结束后，按95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s的程序采集熔解曲线。以β-actin为内参基因，采用2^-ΔΔCt法计算目的基因mRNA表达水平。引物序列见表1。

1.4　数据库筛选Furin启动子区的候选转录因子

通 过 SwitchGear Genomics 数 据 库（https：//switchgeargenomics.com/products/promoter-reporter- collection）检索基因Furin的启动子序列（ID：s703372），获取启动子序列信息。利用真核基因启动子收集与分析联合项目（Joint annotation and specificity prediction for array-ready，JASPAR）数据库（http：//jaspar.genereg.net/analysis）对该启动子序列进行转录因子结合位点预测，设定筛选条件为相对亲和力评分≥0.95，筛选出潜在的转录因子结合位点，并针对相应的Furin启动子序列进行后续克隆和转染等验证实验。

1.5　双荧光素酶报告基因实验检测Furin启动子转录活性

为验证Furin基因启动子的转录活性及其受SP1调控的作用，将Furin目标启动子片段克隆至pGL3-Basic荧光素酶报告载体中，构建pGL3-Furin-promoter重组报告质粒。以表达绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）的质粒为对照质粒。在293T细胞中进行以下分组和转染：pcDNA-SP1组，共转染pcDNA-SP1过表达质粒和pGL3-Furin-promoter报告质粒；pcDNA-GFP组，共转染pcDNA-GFP对照质粒和pGL3-Furin-promoter报告质粒。所有转染均使用脂质体法进行。转染24 h后裂解细胞，采用双荧光素酶报告系统检测2组细胞中荧光素酶活性^［10］。以转染的效率内参质粒pRL-TK（表达海肾荧光素酶）提供的内参活性对报告基因（表达萤火虫荧光素酶）进行标准化，计算荧光素酶活性，代表Furin启动子的转录活性。荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值。

1.6　小鼠sWAT中SVF细胞的分离

取小鼠sWAT，剔除淋巴结等组织，PBS缓冲液洗涤2次后加入0.1% Ⅰ型胶原酶消化，并使用0.6 mm过滤筛过滤，收集滤液。滤液经1 000 g离心5 min，弃上清，收集细胞沉淀^［11］。将细胞沉淀重悬于含10%胎牛血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基/汉姆F-12营养混合物混合培养基（Dulbecco’s modified eagle medium/Ham’s F-12 nutrient mixture， DMEM/F12），置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。细胞融合后，更换成脂培养基诱导48 h（含0.5 mmol·L^-1 IBMX、1 μmol·L^-1地塞米松和10 mg·L^-1胰岛素）。随后更换为仅含10 mg·L^-1胰岛素的成脂维持培养基继续培养，每2 d更换1次培养基，诱导分化持续至第8天。分化完成后，采用油红O染色验证脂肪细胞分化效果。

1.7　油红O染色检查SVF来源细胞的成脂诱导分化

取成脂分化第8天的脂肪细胞，经PBS缓冲液清洗后，加入4%多聚甲醛室温固定30 min。PBS缓冲液漂洗3次后，加入0.5%油红O染色液，37 ℃避光孵育15 min。弃去染液，加入60%异丙醇分色15 s，PBS缓冲液冲洗去除残留染料。加入苏木素复染细胞核1 min，PBS缓冲液返蓝。于倒置显微镜下观察脂滴形态，红色脂滴为分化成功的脂肪细胞^［12］。

1.8　成熟脂肪细胞的SP1转导、细胞分组和细胞上清液中白脂素水平测定

将成熟脂肪细胞分为2组，即转导过表达SP1重组腺病毒的Ad-SP1组和转导表达GFP对照腺病毒的Ad-GFP组。转导72 h后，收集2组细胞。同时，收集2组细胞培养上清液，严格按照ELISA试剂盒说明书操作，检测2组细胞上清液中白脂素水平。

1.9　Western blotting法检测293T细胞中SP1蛋白表达水平及成熟脂肪细胞中SP1和Furin蛋白表达水平

收集转染质粒后的293T细胞和转导腺病毒的成熟脂肪细胞，分别加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂混合物的RIPA裂解液。经蛋白浓度测定后，取40 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。转膜后加入5%脱脂牛奶常温封闭1 h。加入特异性一抗（1∶1 000稀释），4 ℃过夜孵育。封闭后经3次PBS缓冲液漂洗，加入IRDye标记二抗（1∶5 000稀释），室温孵育1 h。洗膜后加入发光液，通过荧光成像系统获取荧光信号^［12］。采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/β-actin蛋白条带灰度值。

1.10　统计学分析

使用GraphPad Prism 9.0软件进行作图和统计学分析。2组小鼠体质量和WAT质量，各组织中Furin、FBN1和SP1 mRNA表达水平，pcDNA-SP1组和pcDNA-GFP组细胞荧光素酶活性，Ad-SP1组和Ad-GFP组细胞上清液中白脂素水平以及各组细胞中SP1和Furin蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　2组小鼠体质量和WAT质量

喂养小鼠12周后，与NCD组比较，HFD组小鼠体型增大，体质量明显升高（P<0.001）；HFD组小鼠eWAT和sWAT外观膨大，质量明显升高（P<0.001）。见图1。

2.2　2组小鼠WAT中Furin和FBN1 mRNA表达水平

与NCD 组比较，HFD组小鼠sWAT和eWAT中Furin mRNA表达水平明显升高（P<0.001）。2组小鼠下丘脑、BAT、胃、空肠、肝脏和胰腺中Furin mRNA表达水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。NCD组和HFD组小鼠上述组织中FBN1 mRNA表达水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图2。

2.3　数据库筛选结合Furin基因启动子区域的转录因子

为解析Furin基因在肥胖脂肪组织中高表达的调控机制，本研究通过JASPAR数据库对Furin基因启动子区进行转录因子结合位点预测，并成功筛选出9个候选转录因子，包括锌指蛋白384（zinc finger protein 384，ZNF384）、无调性同系物1（atonal homolog 1，Atoh1）、克鲁佩尔样转录因子5（Kruppel-like factor 5，KLF5）、转录因子12（transcription factor 12，Tcf12）和SP1等。见图3。其中，SP1结合位点在JASPAR评分系统中具有较高结合置信度（相对亲和力为0.968），因此将其作为核心候选因子进行后续研究。

2.4　2组小鼠WAT中SP1 mRNA表达水平

与NCD 组比较，HFD 组小鼠sWAT和eWAT中SP1 mRNA表达水平明显升高（P<0.001）；2组小鼠其他组织中SP1 mRNA表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图4。

2.5　2组293T细胞中SP1蛋白表达水平和荧光素酶活性

为验证SP1对Furin基因的调控作用，在293T细胞中转染SP1过表达质粒pcDNA-SP1组及其对照质粒pcDNA-GFP组。Western blotting法结果显示：与pcDNA-GFP组比较，pcDNA-SP1组293T细胞中SP1蛋白表达水平明显升高（P<0.001）。见图5。与pcDNA-GFP组（1.00±0.11）比较，pcDNA-SP1组293T细胞中荧光素酶活性（4.86±0.52）明显升高（P<0.001）。

2.6　SVF来源细胞的成脂诱导分化

成熟脂肪细胞呈现典型形态学特征，胞内可见透亮且体积较大的脂滴结构。油红O染色后，脂滴可被特异性染为红色，镜下可见明显脂滴形成。见图6。

2.7　成熟脂肪细胞中SP1和Furin蛋白表达水平及细胞上清液中白脂素水平

与Ad-GFP组比较，Ad-SP1组成熟脂肪细胞中SP1和Furin蛋白表达水平均明显升高（P<0.001）。见图7。与Ad-GFP组（216.6 ng·L^-1±63.5 ng·L^-1）比较，Ad-SP1组细胞 上 清 液 中 白 脂 素 水 平（515.0 ng·L^-1 ± 216.8 ng·L^-1）明显升高（P<0.001）。

3 讨 论

近年研究^［13］证实蛋白酶Furin在能量代谢调控网络中具有关键作用。机制研究^［14］表明：Furin可通过剪切前体蛋白激活脂肪细胞分化相关信号通路，且其在小鼠肝脏中的异常表达可加剧胰岛素抵抗。本研究结果发现：高脂饮食诱导的HDF组肥胖小鼠sWAT和eWAT中Furin mRNA表达水平均明显上调。然而，细胞外基质关键成分FBN1在HDF组小鼠2种脂肪组织中均未发生明显表达改变，提示肥胖状态对细胞外基质相关基因的调控具有高度选择性。虽然已有研究^［3］阐明FBN1蛋白经Furin特异性剪切后可释放具有代谢活性的白脂素，但关于该剪切酶本身的表达调控机制尚未明确。临床研究^［15］显示肥胖人群血清中白脂素水平明显升高，但本研究结果表明，这种代谢异常并非源于前体蛋白FBN1的表达上调，而主要归因于Furin介导的前体蛋白剪切作用增强。

转录因子SP1已被证实在脂代谢调控网络中占据关键地位^［16］。研究^［17］显示：SP1可通过与过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha，PGC-1α）协同作用，参与高脂饮食诱导的氧化应激调控，其表达水平与脂肪组织炎症程度呈正相关关系，且SP1可通过调控脂代谢相关基因参与肥胖进程。本研究通过JASPAR数据库生物信息学分析发现：Furin启动子区存在高亲和力的SP1结合位点。双荧光素酶报告基因实验结果证实：过表达SP1可明显增强Furin启动子的转录活性，表明SP1能够直接靶向结合Furin启动子区并激活其转录。这种靶向调控关系从分子机制上解释了肥胖状态下SP1与Furin蛋白表达水平同步升高的现象，提示SP1-Furin轴可能构成肥胖进程中的正向调控通路。基于生物信息学分析还筛选到ZNF384和KLF5等潜在调控因子，其与Furin启动子的相互作用及其机制值得后续深入研究。

白脂素作为新发现的脂肪因子，其异常分泌与肥胖相关代谢紊乱有密切关联^［18-19］。研究^［3］显示：Furin是白脂素前体蛋白FBN1的关键裂解酶，但其上游调控机制尚未阐明。本研究双荧光素酶实验结果显示：SP1可明显增强Furin启动子活性，在SVF细胞分化为成熟脂肪细胞后，表明SP1可直接结合Furin启动子并激活其转录。在诱导SVF细胞分化为成熟脂肪细胞后，SP1过表达可上调Furin蛋白表达并促进白脂素分泌，证实SP1通过促进Furin表达驱动白脂素分泌。上述证据共同表明SP1对Furin转录具有直接调控作用。本研究建立了SP1-Furin-白脂素级联调控通路，从分子机制层面解释了肥胖患者血清白脂素升高的潜在原因。相较于肝脏中Furin主要参与胰岛素受体加工^{［4，20-21］}，本研究结果提示：脂肪组织中该酶可能通过特异性调控白脂素成熟，在系统性能量平衡调节中发挥独特作用。

综上所述，高脂饮食可通过诱导SP1表达特异性激活Furin转录，进而促进白脂素分泌。本研究发现了SP1-Furin-白脂素调控轴，为深入理解脂肪组织内分泌功能和肥胖相关代谢紊乱的机制提供了理论依据。

* 石河子大学临床医学院2022级临床医学专业

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基金资助

国家自然科学基金项目(82260126)

国家自然科学基金项目(32460221)

新疆生产建设兵团科技局指导性科技计划项目(2024ZD020)

新疆维吾尔自治区克拉玛依市中心医院院内项目(20240101)

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