双酚AF对人子宫内膜基质细胞衰老的影响及雷帕霉素的抑制作用

Effect of bisphenol AF on senescence of human endometrial stromal cells and inhibitory role of rapamycin

摘要

目的 探讨双酚AF（BPAF）对子宫内膜基质细胞（hESCs）衰老的影响，并阐明雷帕霉素（Rapa）对BPAF诱导的hESCs衰老的抑制作用。 方法 体外培养hESCs，采用0、7.5、15.0、30.0、60.0和120.0 μmol·L^-1 BPAF处理hESCs。采用MTT法检测不同浓度BPAF作用后hESCs存活率。将hESCs分为对照组（正常培养基）、BPAF组（加入含30.0 μmol·L^-1 BPAF培养基）和Rapa组（加入含30.0 μmol·L^-1 BPAF及100.0 nmol·L^-1 Rapa培养基）。采用衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色法检测各组细胞中SA-β-gal阳性细胞百分率，流式细胞术检测各组细胞周期百分率，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组细胞中p16、p21和p53 mRNA表达水平，Western blotting法检测各组细胞中衰老相关蛋白p16、p21和p53及自噬相关蛋白p62、微管相关蛋白1轻链3型蛋白Ⅱ（LC3-Ⅱ）和微管相关蛋白1轻链3型蛋白Ⅰ（LC3-Ⅰ）表达水平。 结果 MTT法，当BPAF浓度为30.0 μmol·L^-1时，细胞存活率达75%，后续实验选用30.0 μmol·L^-1 BPAF诱导细胞衰老。与对照组比较，BPAF组SA-β-gal阳性细胞百分率明显升高（P<0.01），G₁期细胞百分率明显升高（P<0.01），细胞中p16、p21和p53 mRNA及蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）。与BPAF组比较，Rapa组SA-β-gal阳性细胞百分率明显降低（P<0.01），G₁期细胞百分率明显降低（P<0.01），细胞中p16、p21和p53 mRNA及蛋白表达水平均明显降低（P<0.01），自噬相关p62蛋白表达水平明显降低（P<0.01），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显升高（P<0.01）。 结论 高浓度BPAF可抑制hESCs增殖并诱导细胞衰老，Rapa可抑制BPAF诱导的细胞衰老，其作用机制可能与细胞自噬激活有关。

Abstract

Objective To investigate the effect of bisphenol AF （BPAF） on the senescence in the human endometrial stromal cells （hESCs）， and to elucidate the inhibitory effect of rapamycin （Rapa） on the BPAF-induced senescent hESCs. Methods The hESCs were cultured in vitro and treated with 0， 7.5， 15.0， 30.0， 60.0， and 120.0 μmol·L^-1 BPAF. MTT assay was used to detect the cell survival rates of the hESCs after treated with different concentrations of BPAF. The cells were divided into control group （normal medium）， BPAF group （medium containing 30.0 μmol·L^-1 BPAF）， and Rapa group （medium containing both 30.0 μmol·L^-1 BPAF and 100.0 nmol·L^-1 Rapa）. Senescence-associated β-galactosidase （SA-β-gal） staining was used to assess the percentages of SA-β-gal positive cells in various groups； flow cytometry was used to analyze the percentages of cells at different cell cycles in various groups； real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） method was used to assess the expression levels of p16， p21 and p53 mRNA in the cells in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of senescence-related proteins （p16， p21 and p53）， autophagy-related proteins p62， microtubule-associated protein 1-light chain 3 （LC3）-Ⅱ and LC3-Ⅰ in the cells in various groups. Results The MTT assay results showed that the cell survival rate was 75% when the BPAF concentration was 30.0 μmol·L^-1； therefore， this concentration was selected for subsequent senescence induction experiments. Compared with control group， the percentage of SA-β-gal positive cells in BPAF group was significantly increased（P<0.01）， the percentage of the cells at G₁ phase was significantly increased（P<0.01）， and the expression levels of p16， p21， and p53 mRNA and proteins were significantly increased （P<0.01）. Compared with BPAF group， the percentage of SA-β-gal positive cells in Rapa group was significantly decreased （P<0.01）， the percentage of the cells at G₁ phase was significantly decreased （P<0.01）， the expression levels of p16， p21， and p53 mRNA and proteins in the cells were significantly decreased （P<0.01）， and the expression level of the autophagy-related protein p62 in the cells was significantly decreased （P<0.01） while the LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ ratio was significantly increased （P<0.01）. Conclusion High concentrations of BPAF can inhibit the proliferation of the hESCs and induce cellular senescence. Rapa can suppress BPAF-induced cellular senescence， and its mechanism may be related with the activation of autophagy.

Graphical abstract

关键词

子宫内膜基质细胞 / 双酚AF / 细胞衰老 / 雷帕霉素 / 自噬 / 衰老相关β-半乳糖苷酶

Key words

Endometrial stromal cell / Bisphenol AF / Cellular senescence / Rapamycin / Autophagy / Senescence-associated β-galactosidase

子宫内膜主要由子宫内膜上皮细胞和人子宫内膜基质细胞（human endometrial stromal cells，hESCs）组成^［1］。hESCs在子宫内膜功能层的周期性转化中起关键作用，并可在激素诱导下转化为蜕膜化状态^［2］。然而，hESCs衰老会导致子宫内膜容受性降低，继而影响胚胎着床过程，降低女性生育能力^［3］。双酚AF（bisphenol AF，BPAF）是一种内分泌干扰化学物质（endocrine disrupting chemicals，EDCs），长期暴露可影响子宫的正常形态和功能，导致女性生殖功能障碍^［4］。研究^［5-6］表明：长期暴露于BPAF可引起子宫内膜中雌激素受体β（estrogen receptor β，ERβ）过表达，导致子宫内膜异位症；还可抑制hESCs蜕膜化，导致胚胎着床失败。研究^［7］显示：BPAF可引起hESCs线粒体膜电位降低，增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）积累，导致细胞衰老和凋亡。衰老细胞可通过旁分泌方式向附近正常细胞传递衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP），加速细胞衰老进程^［8］。雷帕霉素（rapamycin，Rapa）是目前公认的有效抗衰老药物之一，具有一定的抗氧化应激作用，并可减少衰老细胞SASP分泌，延缓细胞衰老^［9］。研究^［10］发现：Rapa可通过调节细胞代谢和能量平衡来促进子宫内膜蜕膜化，改善子宫内膜着床环境。但目前Rapa对EDCs诱导细胞衰老的作用及其机制尚不明确。本研究采用BPAF处理hESCs，并观察Rapa对BPAF诱导的细胞衰老的影响，探讨其作用机制，为子宫内膜相关疾病的治疗提供新方法。

1 材料与方法

1.1　实验细胞、主要试剂和仪器

hESCs来自吉林省人民医院中心实验室，经冻存复苏后稳定培养用于后续实验。BPAF购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，溶解于二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），配制为100 mmol·L^-1储备液。MEMα培养基、青霉素-链霉素溶液和胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）溶液均购自南京生航生物技术有限公司，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和cDNA第一链合成试剂盒EasyScript和TransStart Top Green qPCR SuperMix（+Dye Ⅱ）均购自北京全式金生物技术有限公司，MTT（98%，试剂级）、细胞衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase， SA-β-gal）染色试剂盒和细胞周期与凋亡检测试剂盒Annexin Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，FITC/PI）均购自上海碧云天生物技术有限公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白质定量试剂盒购自美国ABP Biosciences公司，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体、p21抗体、自噬适配体蛋白p62抗体、微管相关蛋白1轻链3型蛋白Ⅰ（microtubuleassociated protein 1-light chain 3-Ⅰ，LC3-Ⅰ）抗体和微管相关蛋白1轻链3型蛋白Ⅱ（microtubule-associated protein 1-light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）抗体均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，p16抗体和p53抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）所用的引物序列由金唯智生物科技公司合成，RT-qPCR试剂购自日本宝生物工程有限公司。NanoDrop 2000分光光度计、CO₂培养箱和PCR仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司，流式细胞仪购自美国BD公司，电泳系统购自美国Wealtec有限公司，荧光倒置显微镜购自日本Olympus Corporation公司，RT-qPCR系统购自美国Applied Biosystems公司。

1.2　细胞培养

hESCs采用完全培养基MEMα（含10%FBS和1%青霉素-链霉素）于37 ℃、5% CO₂条件下培养。当细胞融合度达到80%时，经胰酶消化传代。选取第6~12代处于对数生长期的细胞用于后续实验。

1.3　MTT法检测不同浓度BPAF作用后hESCs存活率

收集处于对数生长期的hESCs，以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔细胞培养板。每孔加入100 μL完全培养基，于37 ℃、5% CO₂条件下培养至细胞融合度约达70%。弃去原培养基，更换为含不同浓度（0、7.5、15.0、30.0、60.0和120.0 μmol·L^-1）BPAF的100 μL完全培养基，继续培养7 d。每组设置5个复孔。培养结束后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 g·L^-1），37 ℃孵育4 h。吸弃孔内液体，加入100 μL DMSO，室温振荡5 min充分溶解结晶。采用酶标仪于492 nm波长处测定各孔吸光度（A）值，并计算细胞存活率。细胞存活率=（实验组A值-空白孔A值）/（对照组A值-空白孔A值）×100%。实验重复3次。

1.4　细胞分组和处理

取处于对数生长期的hESCs，分为对照组、BPAF组和Rapa组。对照组细胞采用完全培养基置于37 ℃、5% CO₂条件下培养7 d；BPAF组细胞使用含30 μmol·L^-1 BPAF的培养基在相同条件下培养7 d；Rapa组细胞先使用含30 μmol·L^-1 BPAF的培养基在相同条件下培养5 d，5 d后在培养基中加入100 nmol·L^-1 Rapa 继续培养2 d。

1.5　流式细胞术检测各组不同细胞周期细胞百分率

收集各组hESCs，以每孔5×10⁴个细胞的密度接种至6孔细胞培养板。每孔加入2 mL完全培养基，置于37 ℃、5% CO₂条件下培养，待细胞完全贴壁，更换为对应分组的含药物培养基，相同条件下继续培养7 d。配制PI染色液（配比组成：染色缓冲液0.5 mL+20×PI染色液25 μL+50×RNA酶10 μL）。收集各组细胞培养液，胰酶消化，加入提前收集的细胞培养液中和，离心收集各组细胞，用预冷的PBS缓冲液洗涤1次，再次离心，每管加入1 mL预冷的70%乙醇，轻轻吹打混匀，4 ℃固定12 h后离心收集细胞。加入PBS缓冲液洗涤2次后，各孔加入0.5 mL提前配好的PI染色液，充分混匀，37 ℃避光孵育30 min。采用流式细胞术检测各组细胞的细胞周期分布，使用Modfit LT 5软件分析处于不同细胞周期的细胞百分率。实验重复3次。

1.6　SA-β-gal染色法检测各组SA-β-gal阳性细胞百分率

将收集的hESCs接种于6孔细胞培养板，按上述细胞分组处理7 d后，进行SA-β-gal染色。弃去培养基，PBS缓冲液洗涤细胞2次，每孔加入1 mL染色固定液，室温固定15 min。移除固定液，PBS缓冲液洗涤3次，每次3 min。每孔加入1 mL SA-β-gal染色工作液（配比组成：β-gal染色液A 10 μL+β-gal染色液B 10 μL+β-gal染色液C 930 μL+X-gal溶液50 μL）。密封后置于37 ℃湿盒（或水浴锅）中避光孵育18 h。于倒置显微镜下观察各组细胞染色情况，蓝染细胞计为SA-β-gal阳性细胞。随机选取视野（每个视野细胞总数>200个）计数阳性细胞数。采用Image J软件统计各组阳性细胞数，计算SA-β-gal阳性细胞百分率。SA-β-gal阳性细胞百分率=（SA-β-gal阳性细胞数/细胞总数）×100%。实验独立重复3次。

1.7　RT-qPCR法检测各组hESCs中p16、p21和p53 mRNA表达水平

各组细胞在6孔细胞培养板中培养7 d后，PBS缓冲液洗涤2次，加入TRIzol试剂提取各组细胞总RNA，采用Thermo Scientific NanoDrop 2000型分光光度计对RNA样品的纯度和含量进行检测。采用逆转录试剂盒进行逆转录合成cDNA，以cDNA作为模板进行RT-qPCR扩增。以GAPDH为内参基因，采用2^-△△Ct法计算各组细胞中衰老标志物p16、p21和p53 mRNA表达水平。实验重复3次， 每次至少4个复孔。引物序列见表1。

1.8　Western blotting法检测各组hESCs中p16、p21、p53、p62、LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ蛋白表达水平

将hESCs接种于6孔细胞培养板，按照1.4中细胞分组处理7 d后，收集各组细胞进行裂解获取蛋白。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分 离 后，转 印 至 聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，用快速封闭液封闭15 min。随后分别加入以下一抗（1∶1 000稀释）：GAPDH、p16、p21、p53、p62、LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ，于4 ℃孵育过夜。加入含0.1% Tween-20的Tris缓冲盐水（Tris-buffered saline with Tween-20，TBST）洗膜3次，按抗体来源加入鼠二抗或兔二抗（1∶2 000稀释），室温孵育1~2 h。TBST洗膜3次后使用增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）法检测。使用Image J软件分析各目的蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。实验重复3次。

1.9　统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，GraphPad Prism 9.0软件用于图表绘制。各组hESCs存活率、SA-β-gal阳性细胞百分率和不同细胞周期hESCs百分率，各组细胞中p16、p21和p53 mRNA和蛋白表达水平以及各组细胞中p62蛋白表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　不同浓度BPAF作用后各组hESCs存活率

与0 μmol·L^-1 BPAF比较，7.5和15.0 μmol·L^-1 BPAF组hESCs存活率明显升高（P<0.05或P<0.01），30.0、60.0和120.0 μmol·L^-1 BPAF组hESCs存活率明显降低（P<0.01）。BPAF以浓度依赖性的方式影响hESCs的存活率，当BPAF浓度≤30 μmol·L^-1时，细胞存活率可达75%；随着浓度升高，hESCs存活率逐渐降低。见图1。本研究选用浓度为30 μmol·L^-1 BPAF进行后续诱导细胞衰老实验。

2.2　各组不同细胞周期hESCs百分率

流式细胞术结果显示：与对照组比较，BPAF组G₁期hESCs百分率明显升高（P<0.01）； 与BPAF组比较，Rapa组G₁期hESCs百分率明显降低（P<0.01）。见图2。

2.3　各组SA-β-gal阳性细胞百分率

SA-β-gal染色结果显示：与对照组比较，BPAF组SA-β-gal阳性细胞百分率明显升高（P<0.01）；与BPAF组比较，Rapa组hESCs中SA-β-gal阳性细胞百分率明显降低（P<0.01）。见图3。

2.4　各组细胞中p16、 p21和p53 mRNA和蛋白表达水平

RT-qPCR法检测结果显示：与对照组比较，BPAF组细胞中p16、p21和p53 mRNA表达水平明显升高（P<0.01）；与BPAF组比较，Rapa组细胞中p16、p21和p53 mRNA表达水平明显降低（P<0.01）。Western blotting法检测结果显示：与对照组比较，BPAF组细胞中p16、p21和p53蛋白表达水平明显升高（P<0.01）；与BPAF组比较，Rapa组细胞中p16、p21和p53蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。见图4和5。

2.5　各组细胞中p62蛋白表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值

Western blotting法检测结果显示：与对照组比较，BPAF组细胞中p62蛋白表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值无明显改变，差异无统计学意义（P>0.05）；与BPAF组比较，Rapa组细胞中p62表达水平明显降低（P<0.01），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显升高（P<0.01）。见图6。

3 讨 论

子宫内膜衰老与多种生殖功能障碍密切相关，包括不孕症、自然流产及辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）治疗失败等。衰老基质细胞可分泌和释放SASP，破坏局部微环境稳态，增加子宫内膜疾病的发病风险^［11］。近年来，与hESCs衰老相关的子宫内膜疾病发病率显著上升，子宫内膜异位症20年间发病率增长35%，不孕风险增高2~4倍^［12］；薄型子宫内膜在40岁以上女性中患病率高达25%^［13］。这些疾病不仅危害女性生殖健康，也带来沉重的社会经济负担，亟待针对hESCs衰老机制开发干预策略。

细胞衰老是一种不可逆的细胞周期停滞状态，通常在G₁期或G₂期停滞，伴随增殖能力明显下降^［14］。SA-β-gal作为检测细胞衰老的经典标志物，是溶酶体中的一种水解酶，其活性在衰老细胞中升高。p16/视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，pRb）和p53/p21/pRb是经典的衰老信号通路^［14］。衰老细胞中，p16和p53表达水平均明显升高，p53表达水平升高可激活p21，而p16和p21作为周期蛋白依赖性激酶抑制剂，通过维持pRb的低磷酸化状态^［15］，促使pRb持续抑制转录因子E2F的活性，最终阻断细胞周期进程，抑制细胞增殖^［16］。

BPAF是双酚A（bisphenol A，BPA）的含氟衍生物，作为工业与塑料中BPA的替代物使用^［17］。近年来，BPAF在土壤、食品、灰尘和河流等多种环境介质及人类生物样本（母乳、尿液、血液和汗液中）广泛检出^［18-19］。研究^［20-22］显示：BPAF可通过干扰下丘脑-垂体-性腺轴的功能，影响生殖发育、激素平衡和生育能力，而这可能与影响卵泡生成和发育、子宫内膜容受性的建立及干扰胚胎着床过程有关。为探讨BPAF的生殖毒性和Rapa的干预作用，本研究采用BPAF处理hESCs，成功诱导基质细胞衰老模型。本研究结果显示：BPAF处理后，hESCs的细胞周期停滞于G₁期，SA-β-gal阳性细胞百分率明显升高，衰老相关的p16、p21和p53蛋白表达水平及mRNA表达水平均明显升高，证明BPAF可明显抑制hESCs增殖，并诱导其早衰。上述结果证实，BPAF通过激活p53/p21/pRb和p16/pRb信号通路损害hESCs细胞功能，为EDCs诱导的子宫内膜疾病（如不孕症和内膜异位症）提供了新的治疗方向^［23］。

Rapa是一种应用广泛的抗衰老药物，通过激活自噬途径发挥生物学效应。研究^［24］表明：Rapa不仅可增强老年骨髓间充质干细胞的成骨分化和增殖能力，还可抑制其成脂分化，从而恢复细胞生物学特性。研究^［25-26］显示：卫星细胞的衰老进程与自噬有密切关联，氧化应激增加和线粒体功能障碍均会加速细胞衰老，抑制细胞增殖和代谢，而重建自噬通路可有效逆转衰老并恢复老年卫星细胞的再生功能。本研究结果显示：Rapa可在一定程度上缓解BPAF引起的细胞周期阻滞，促进细胞周期进程，降低SA-β-gal阳性细胞百分率，下调p16、p21和p53蛋白及mRNA表达，表明Rapa可减轻BPAF诱导的hESCs衰老，为其临床应用于改善子宫内膜细胞衰老提供了实验依据。

自噬是细胞通过溶酶体降解并回收受损组分的关键机制，其功能随细胞衰老逐渐衰退，而自噬缺陷又进一步加速细胞衰老进程，形成复杂的反馈循环^［27］。自噬过程中，p62与LC3在自噬体的形成和降解中起关键作用，自噬水平越高，p62降解程度越高^［28］。LC3存在LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ这2种形式，其中LC3-Ⅰ存在于细胞质中，而LC3-Ⅱ存在于自噬体膜中^［29］。当自噬激活时，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化，因此LC3-Ⅱ通常被视为哺乳动物自噬体标志物^［29］。本研究结果显示：Rapa组细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显升高，p62蛋白表达水平明显降低，说明Rapa处理后细胞自噬通路受到激活。上述结果提示：Rapa可能通过增强自噬活性和促进衰老相关有害物质的清除，从而发挥其抗衰老作用，改善子宫内膜环境。

综上所述，BPAF可抑制hESCs增殖，诱导其衰老，而Rapa可通过激活自噬发挥抗衰老作用，有效改善子宫内膜环境，上述结果为未来开发抗子宫内膜衰老药物提供了理论依据。

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基金资助

吉林省科技厅科技发展计划项目(20250601012RC)

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