miR-153-3p/PGC-1α轴通过调控线粒体凋亡途径对口腔鳞状细胞癌细胞凋亡的影响

Effect of miR-153-3p/PGC-1α axis on apoptosis of oral squamous cell carcinoma cells by modulation of mitochondrial apoptosis pathway

摘要

目的 探讨微小RNA-153-3p （miR-153-3p） 对口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞凋亡的影响，并阐明其作用机制。 方法 收集确诊为OSCC的84例患者的癌组织和癌旁组织，并培养5种OSCC细胞和正常人口腔黏膜HOK-16A细胞。采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测OSCC患者癌组织和癌旁组织及5种OSCC细胞中miR-153-3p表达水平。将Tca8113细胞随机分为空白对照组、mimics NC组、mimics组、mimics+vector组和mimics+过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）组，分别转染mimics NC质粒、miR-153-3p mimic质粒、PGC-1α过表达质粒或共转染2种质粒。采用RT-qPCR法检测转染后各组细胞中miR-153-3p表达水平，MTT法检测各组细胞增殖活性，流式细胞术检测各组细胞凋亡率，2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酯（DCFH-DA）荧光染色法检测各组细胞中活性氧（ROS）水平，JC-1探针染色法检测各组细胞线粒体膜电位，Western blotting法检测各组细胞胞浆和线粒体中细胞色素C（Cyt C）蛋白表达水平及细胞中Cleaved-Caspase-3、PGC-1α、核呼吸因子1（NRF-1）及线粒体转录因子A（TFAM）蛋白表达水平，双荧光素酶报告基因检测实验验证miR-153-3p与PGC-1α的靶向关系。 结果 与癌旁组织和HOK-16A细胞比较，OSCC癌组织及各种OSCC细胞中miR-153-3p表达水平均明显降低（P<0.05），其中Tca8113细胞中表达水平最低。转染后，与空白对照组和mimics NC组比较，mimics组Tca8113细胞中miR-153-3p表达水平明显升高（P<0.001）；各时间点细胞增殖活性均明显降低（P<0.001）；细胞凋亡率和ROS水平明显升高（P<0.001），细胞线粒体膜电位明显降低（P<0.001）；细胞中Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平和细胞浆中Cyt C蛋白表达水平均明显升高（P<0.001），线粒体中Cyt C蛋白和细胞中PGC-1α/TFAM通路相关蛋白PGC-1、NRF-1及TFAM表达水平均明显降低（P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验证明miR-153-3p能够特异性靶向调控PGC-1α基因表达。共转染后，与空白对照组比较，mimics组细胞凋亡率和细胞中ROS水平明显升高（P<0.001），线粒体膜电位明显降低（P<0.001）；与mimics组比较，mimics+vector组细胞凋亡率、细胞中ROS水平和线粒体膜电位差异无统计学意义（P>0.05）；与mimics+vector组比较，mimics+PGC-1α组细胞凋亡率和细胞中ROS水平均明显降低（P<0.01），细胞线粒体膜电位明显升高（P<0.001）。与空白对照组比较，mimics组细胞中PGC-1、NRF-1和TFAM蛋白表达水平均明显降低（P<0.001）；与mimics+vector组比较，mimics+PGC-1α组细胞中PGC-1、NRF-1和TFAM蛋白表达水平均明显升高（P<0.001）。 结论 MiR-153-3p过表达可通过靶向下调PGC-1α表达，阻断PGC-1α/TFAM信号通路，诱导线粒体功能障碍并激活细胞线粒体凋亡途径，诱导Tca8113细胞凋亡。

Abstract

Objective To discuss the effect of microRNA-153-3p （miR-153-3p） on the apoptosis of oral squamous cell carcinoma （OSCC） cells， and to clarify its mechanism. Methods The Cancer tissue and adjacent normal tissue were collected from 84 patients diagnosed with OSCC， and five kinds of OSCC cells and normal human oral mucosa HOK-16A cells were cultured. Real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） method was used to detect the expression levels of miR-153-3p in the OSCC cancer tissue and adjacent normal tissue， as well as in the five kinds of cells. The Tca8113 cells were randomly divided into blank control group， mimics NC group，mimics group， mimics+vector group， and mimics+peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α （PGC-1α） group， and were transfected with mimics NC plasmid，miR-153-3p mimic plasmid， PGC-1α overexpression plasmid， or co-transfected with both plasmids. RT-qPCR method was used to detect the expression levels of miR-153-3p in the cells in various groups after transfection； MTT method was used to detect the proliferation activities of the cells in various groups； flow cytometry was used to detect the apoptotic rates of the cells in various groups； 2'，7'- dichlorodihydrofluorescein diacetate （DCFH-DA） fluorescence staining was used to detect the levels of reactive oxygen species （ROS） in the cells in various groups； JC-1 probe staining was used to detect the mitochondrial membrane potential of the cells in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of cytochrome C （Cyt C） protein in the cytoplasm and mitochondria， as well as the expression levels of Cleaved-Caspase-3， PGC-1α， nuclear respiratory factor 1 （NRF-1）， and mitochondrial transcription factor A （TFAM） proteins in the cells in various groups； dual-luciferase reporter assay was used to verify the targeting relationship between miR-153-3p and PGC-1α. Results Compared with adjacent normal tissue and HOK-16A cells， the expression levels of miR-153-3p in OSCC cancer tissue and OSCC cells were significantly decreased （P<0.05）， while the lowest expression level was observed in the Tca8113 cells. After transfection， compared with blank control group and mimics NC group， the expression level of miR-153-3p in the Tca8113 cells in mimics group was significantly increased （P<0.001）； the proliferation activity of the cells at each time point was significantly decreased （P<0.001）； the apoptotic rate and ROS level of the cells were significantly increased （P<0.001）， while the mitochondrial membrane potential of the cells was significantly decreased （P<0.001）； the expression level of Cleaved-Caspase-3 protein in the cells and the expression level of Cyt C protein in the cytoplasm were significantly increased （P<0.001）， while the expression level of Cyt C protein in the mitochondria and the expression levels of PGC-1α/TFAM pathway-related proteins PGC-1α， NRF-1， and TFAM in the cells were significantly decreased （P<0.05）. The dual-luciferase reporter assay results confirmed that miR-153-3p could specifically target and regulate the expression of the PGC-1α gene. After co-transfection， compared with blank control group， the apoptotic rate and ROS level in the cells in mimics group were significantly increased （P<0.001）， while the mitochondrial membrane potential was significantly decreased （P<0.001）； compared with mimics group， there were no significant differences in apoptotic rate， ROS level， and mitochondrial membrane potential in the cells in mimics+vector group （P>0.05）； compared with mimics+vector group， the apoptotic rate and ROS level in the cells in mimics+PGC-1α group were significantly decreased （P<0.01）， while the mitochondrial membrane potential was significantly increased （P<0.001）. Compared with blank control group， the expression levels of PGC-1α， NRF-1， and TFAM proteins in the cells in mimics group were significantly decreased （P<0.001）； compared with mimics+vector group， the expression levels of PGC-1α， NRF-1， and TFAM proteins in the cells in mimics+PGC-1α group were significantly increased （P<0.001）. Conclusion ​Overexpression of miR-153-3p can induce apoptosis in the Tca8113 cells by targeting and down-regulating the expression of PGC-1α， thereby blocking the PGC-1α/TFAM signaling pathway， inducing mitochondrial dysfunction， and activating the mitochondrial apoptotic pathway.

Graphical abstract

关键词

口腔鳞状细胞癌 / 微小RNA-153-3p / 过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α / 线粒体 / 细胞凋亡

Key words

Oral squamous cell carcinoma / MicroRNA-153-3p / Peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α / Mitochondria / Apoptosis

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是多发生于头颈部的恶性肿瘤，全球发病率位列第六名，其术后复发率高、转移性强和治疗抵抗等问题严重降低了患者生存率^［1-4］。目前，针对OSCC分子机制的研究多聚焦于肿瘤微环境调控和信号通路异常激活，而能量代谢重编程这一肿瘤标志性特征在OSCC进展中的作用尚未明确。近年来，非编码RNA调控网络与代谢异常的交叉研究为肿瘤治疗提供了新视角，其中微小RNA（microRNA，miRNA）因其广泛参与转录后调控而备受关注^［5-7］。研究^［8］显示miR-153家族在多种实体瘤中呈现异常表达模式。现有研究^［8-9］证实：OSCC患者血清中miR-153水平明显降低，且miR-153-3p可参与调控Wnt诱导信号分泌蛋白1（Wnt induced secreted protein-1，WISP-1）介导的细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）进程，但其在癌组织中的表达特征及其对线粒体能量代谢的调控作用尚未明确。过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（peroxidase proliferatior-activated receptor gamma coactivator 1 alpha，PPARGC1A或PGC-1α）是一种转录共激活因子，可与参与能量代谢和线粒体生物发生的多种转录因子相互作用^［10］。研究^［11］表明：PGC-1α可通过激活线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）促进线粒体DNA复制，进而维持肿瘤细胞的能量代谢优势。但该分子在OSCC中的调控机制尚未明确，特别是其与miRNA的相互作用网络仍有待研究。

本研究通过系统解析miR-153-3p在OSCC组织中的表达特征，聚焦能量代谢调控新维度，从线粒体功能角度揭示miR-153-3p/PGC-1α轴对OSCC细胞凋亡的影响机制，并通过实验验证miR-153-3p与PGC-1α的靶向调控关系，以期为开发基于代谢干预的OSCC靶向治疗策略提供理论依据。

1 资料与方法

1.1　临床样本

选取2017年6月-2020年6月就诊于本院经病理诊断确诊的84例OSCC患者作为研究对象，其中男性49例，女性35例，平均年龄（54.59±0.61）岁。所有患者均于术中切取癌组织及其癌旁组织。根据第8版TNM分期标准^［7］对患者进行临床分期：Ⅰ-Ⅱ期50例，Ⅲ-Ⅳ期34例。纳入标准：①初次诊断者；②病历资料信息完善；③入院时未接受任何抗肿瘤治疗者；④生存期大于6个月。排除标准：①患有其他恶性肿瘤；②患有自身免疫性疾病；③患有精神障碍类疾病。本研究已通过本院伦理委员会批准（伦理审批号：ZYFY20220732），所有患者知晓并签署知情同意书。

1.2　细胞、主要试剂和仪器

人口腔黏膜HOK-16A细胞和5种OSCC细胞SCC-9、SCC-15、SCC-25、SAS及Tca8113均来自中科院细胞库。DMEM培养基、RPMI-1640培养基、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和胎牛血清购自美国Thermo Fisher Scientific公司，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液和MTT试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司，AnnexinⅤ-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）细胞凋亡检测试剂盒、活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测2'，7'-二 氯 二 氢 荧 光 素 二 乙 酯 （2'，7'- dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）试剂盒、线粒体膜电位检测JC-1试剂盒和细胞线粒体分离试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司，TRIzol试剂购自北京雷根生物技术有限公司，SYBR Green Master Mix购自上海翌圣生物科技股份有限公司， 增强型化学发光法（enhanced chemiluminescence，ECL）显影液、兔抗人PGC-1α抗体、核呼吸因子1（nuclear respiratory factor 1，NRF-1）抗体、TFAM抗体、细胞色素C氧化酶（cytochrome C oxidase，COX）Ⅳ抗体、细胞色素C（cytochrome C，Cyt C）抗体、Cleaved-Caspase-3 抗 体、甘 油 醛 - 3 -磷 酸 脱 氢 酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体和辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔二抗均购自武汉贝茵莱生物科技有限公司。miR-153-3p mimics及其阴性对照mimics NC均由广州锐博生物科技有限公司合成，双荧光素酶报告基因检测质粒和PGC-1α过表达质粒均由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。DMIL LED型倒置显微镜购自德国Leica公司，Accuri C6型流式细胞仪购自美国BD公 司， CFX-Connect 96 型 实 时 荧 光 定 量 PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）仪购自美国Bio-Rad公司，AMR-100型酶标仪购自杭州奥盛仪器有限公司，Tanon-5200型全自动化学发光分析仪购自上海天能科技有限公司。

1.3　细胞培养和分组

取冻存的人正常口腔黏膜细胞HOK-16A和5种OSCC细胞SCC-9、SCC-15、SCC-25、 SAS 及 Tca8113， 将 细 胞 复 苏 后，HOK-16A细胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中进行培养，OSCC细胞则在含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中重新悬浮。随后置于37 ℃、5% CO₂培养箱中进行培养，每2~3 d进行一次传代。

取处于对数生长期的Tca8113细胞，按每孔1×10⁴个细胞的密度接种于24孔细胞培养板中。待细胞融合度达到80%时，将细胞分为4组并使用Lipofectamine^TM 2000转染试剂进行转染：mimics NC组， 将mimics NC质粒转入细胞；mimics组，将miR-153-3p mimics质粒转入细胞； mimics+vector组，将miR-153-3p mimics质粒和空载vector质粒一同转入细胞；mimics+PGC-1α组，使用转染试剂将miR-153-3p mimics质粒和PGC-1α过表达质粒一同转入细胞。另设置空白对照组，不进行转染。48 h后，收集细胞沉淀，采用RT-qPCR法检测各组Tca8113细胞中miR-153-3p表达水平，评估转染效果。

1.4　RT-qPCR法检测患者癌组织、癌旁组织及各组细胞中miR - 153 - 3p表达水平

使用TRIzol试剂从患者癌组织和癌旁组织及5种OSCC细胞和HOK-16A细胞中提取总RNA。将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板，利用荧光定量PCR仪进行基因扩增反应，反应体系（20 μL）：10 μL SYBR Green Master Mix，上、下游引物各1 μL，1 μL cDNA和8 μL无酶水。PCR反应程序设置为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性5 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，共40个循环。引物序列：miR-153-3p F，5'-ACACTCCAGCTGGGTTGCATA-GTCACAAA-3'；miR-153-3p R，5'-CAGTGCGT-GTCGTGGAGT-3'；U6 F，5'-CCCTTCGGGG-ACATCCGATA-3'；U6 R，5'-TTTGTGCGTGT-CATCCTTGC-3'。采用2^－ΔΔCt法计算各组织和细胞中miR-153-3p表达水平。

1.5　MTT法检测转染后各组细胞增殖活性

将转染后各组Tca8113细胞以1×10³ mL^-1的密度接种于96孔细胞培养板中，分别于培养12、24、48和72 h后，移除培养基，每孔加入20 μL MTT溶液并充分混匀，于室温下孵育4 h。每孔加入100 μL DMSO混匀并孵育15 min，采用酶标仪于490 nm波长处测定各组细胞吸光度（A）值，计算细胞增殖活性。细胞增殖活性=（实验组A值-空白对照组A值）/（对照组A值-空白对照组A值）×100%，按照时间绘制细胞生长曲线。

1.6　流式细胞术检测转染后各组细胞凋亡率

将转染后各组Tca8113细胞以1.5×10⁴ mL^-1的密度接种于6孔细胞培养板中，培养24 h后收集细胞，500 g离心5 min，弃去上清液。加入1 mL预冷的PBS缓冲液重悬细胞，500 g离心5 min，弃上清。加入500 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，避光条件下加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI），混匀后于室温避光孵育15 min，采用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=（凋亡细胞数/总细胞数）×100%。

1.7　DCFH-DA荧光染色法检测各组细胞中ROS水平

将转染后各组Tca8113细胞以1.5×10⁴ mL^-1的密度接种于6孔细胞培养板中，培养24 h后收集细胞，PBS缓冲液冲洗1次。加入1 mL无血清培养液稀释的DCFH-DA溶液（10 μmol·L^-1），37 ℃避 光 孵 育 20 min，PBS 缓 冲 液 冲 洗 1 次。加 入0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞，加入500 μL预冷PBS缓冲液重悬细胞。采用流式细胞仪检测各组细胞荧光强度值，以平均荧光强度表示细胞中ROS水平。

1.8　JC-1探针法检测各组细胞线粒体膜电位

将转染后各组Tca8113细胞以1.5×10⁴ mL^-1的密度接种于6孔细胞培养板中，培养24 h后收集细胞，PBS缓冲液冲洗1次。加入1 mL JC-1染色工作液混匀，37 ℃条件下避光孵育20 min，PBS缓冲液洗涤2次，500 g离心5 min，弃上清，再重悬于500 μL PBS缓冲液中。采用流式细胞术检测各组细胞平均荧光强度，以平均荧光强度表示线粒体膜电位水平。

1.9　Western blotting法检测各组细胞胞浆和线粒体中Cyt C蛋白表达水平及细胞中Cleaved-Caspase-3、PGC-1α、NRF-1和TFAM蛋白表达水平

收集转染后各组Tca8113细胞。根据细胞线粒体分离试剂盒说明书进行细胞线粒体分离，提取细胞线粒体和胞浆蛋白。加入RIPA裂解液裂解细胞，释放细胞总蛋白和线粒体蛋白。采用二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白浓度后，加入上样缓冲液并煮沸使蛋白变性。随后，每孔上样25 μg蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离蛋白。电泳结束后，采用湿转转膜法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。将膜于室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h，洗涤后分别加入一抗Cyt C（1∶5 000稀释）、COX Ⅳ（1∶2 000）、PGC-1α（1∶5 000）、NRF-1（1∶2 000）、TFAM（1∶1 000） 和 GAPDH（1∶5 000）抗 体，于4 ℃ 孵 育12 h。洗涤后，室温下用HRP标记的羊抗兔二抗孵育1 h。再次洗涤后，将ECL试剂中的A液和B液等比例混合，在凝胶成像系统中显色并拍照。使用Image Plus软件分析各目的蛋白灰度值，以GAPDH为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.10　双荧光素酶报告基因实验

使用生物信息学网站TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert_72/）预测miR-153-3p与PGC-1α基因3'-UTR区域的结合位点。然后以pmirGLO质粒为载体，分别构建了野生型（wild type，WT）PGC-1α（PGC-1α-WT）3'-UTR和突变型（mutant type，MUT）PGC-1α （PGC-1α-MUT） 3'-UTR 质 粒。使 用Lipofectamine^TM 2000转染试剂将PGC-1α-WT和PGC-1α-MUT质粒分别与miR-153-3p mimics及其阴性对照mimics NC共转染至Tca8113细胞中。转染48 h后，采用酶标仪检测各组细胞中萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的荧光强度，计算荧光素酶活性。荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶强度/海肾荧光素酶强度。

1.11　统计学分析

采用GraphPad Prism 6.01软件进行统计学分析。OSCC患者癌组织、癌旁组织及各种细胞中miR-153-3p表达水平，转染后各组细胞增殖活性、细胞凋亡率、线粒体膜电位、ROS水平及各蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示。2组间样本均数比较采用两独立样本t检验，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　OSCC患者癌组织、癌旁组织、OSCC细胞和HOK-16A细胞中miR-153-3p表达水平

与癌旁组织（4.13±0.39）比较，OSCC患者癌组织中miR-153-3p表达水平（1.09±0.13）明显降低（P<0.001）。与人正常口腔黏膜HOK-16A细胞（1.00±0.33）比 较，5 种 OSCC 细 胞（SCC-9：0.60±0.27，SCC-15：0.39±0.13，SCC-25：0.21±0.09，SAS：0.40±0.19，Tca8113：0.10± 0.03）中miR-153-3p表达水平均明显降低（P<0.05），其中Tca8113细胞中miR-153-3p表达水平最低。

2.2　转染后各组Tca8113细胞增殖活性和凋亡率

与空白对照组（1.00±0.08）和mimics NC组（0.94 ± 0.06）比 较， mimics 组（6.48 ± 0.11）Tca8113细胞中miR-153-3p表达水平明显升高（P<0.001）。MTT法结果显示：在各时间点，与空白对照组和mimics NC组比较，mimics组细胞增殖活性均明显降低（P<0.001）。见图1。

流式细胞术检测结果显示：与空白对照组和mimics NC组比较，mimics组Tca8113细胞凋亡率明显升高（P<0.001）。见图2。

2.3　转染后各组Tca8113细胞中线粒体膜电位和ROS水平

流式细胞术结果显示：与空白对照组和mimics NC组比较，mimics组细胞线粒体膜电位明显降低（P<0.001），ROS水平明显升高（P<0.001）。见图3和4。

2.4　各组Tca8113细胞中Cleaved-Caspase-3蛋白、Cyt C蛋白和PGC-1/TFAM通路相关蛋白表达水平

Western blotting法结果显示：与空白对照组和mimics-NC组比较，mimics组Tca8113细胞中Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平明显升高（P<0.001）。见图5。

与空白对照组和mimics NC组比较，mimics组Tca8113细胞胞浆中Cyt C蛋白表达水平明显升高（P<0.001），细胞线粒体中Cyt C蛋白表达水平明显降低（P<0.001）。见图6。

与空白对照组和mimics NC组比较，mimics组Tca8113细胞中PGC-1ɑ、NRF-1和TFAM蛋白表达水平均明显降低（P<0.001）。见图7。

2.5　 PGC-1α与miR-153-3p的靶向关系

根据生物信息学网站TargetScan的预测结果，miR-153-3p与PGC-1α基因的3'-UTR区域具有潜在的靶向结合位点。见图8A。双荧光素酶报告基因实验结果显示：与mimics NC组比较，miR-153-3p mimics组细胞中PGC-1α 3'-UTR-WT的荧光素酶活性明显降低（P<0.01）；细胞中PGC-1α 3'-UTR-MUT的荧光素酶活性未受到明显影响，差异无统计学意义（P>0.05）。见图8B。上述结果提示miR-153-3p可特异性靶向调控PGC-1α基因表达。

2.6　共转染后各组细胞凋亡率、细胞中ROS水平和线粒体膜电位

与空白对照组比较，mimics组Tca8113细胞凋亡率明显升高（P<0.001）；与mimics组比较，mimics+vector组Tca8113细胞凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）；与mimics+vector组比较，mimics+PGC-1α组Tca8113细胞凋亡率明显降低（P<0.001）。见图9。

与空白对照组比较，mimics组Tca8113细胞中ROS水平明显升高（P<0.001）；与mimics组比较，mimics+vector组Tca8113细胞中ROS水平差异无统计学意义（P>0.05）；与mimics+vector组比较，mimics+PGC-1α组Tca8113细胞中ROS水平明显降低（P<0.001）。见图10。

与空白对照组比较，mimics组Tca8113细胞线粒体膜电位明显降低（P<0.001）；与mimics组比较，mimics+vector组Tca8113细胞线粒体膜电位差异无统计学意义（P>0.05）；与mimics+vector组比较，mimics+PGC-1α组Tca8113细胞线粒体膜电位明显升高（P<0.001）。见图11。

2.7　共转染后各组Tca8113细胞中PGC-1α/TFAM信号通路相关蛋白表达水平

与空白对照组比较，mimics组Tca8113细胞中PGC-1α、NRF-1和TFAM蛋白表达水平均明显降低（P<0.001）；与mimics组比较，mimics+vector组Tca8113细胞中PGC-1α、NRF-1和TFAM蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）；与mimics+vector组比较，mimics+PGC-1α组Tca8113细胞中PGC-1α、NRF-1和TFAM蛋白表达水平明显升高（P<0.001）。见图12。

3 讨 论

PGC-1α是线粒体能量代谢的关键调控因子，可介导线粒体的生物合成、裂变/融合和糖代谢过程，影响肿瘤细胞存活^［12-14］。由于肿瘤细胞异常增殖活动需要大量能量支撑，其线粒体生物合成及裂变/融合通常较为活跃，因此PGC-1α在多种类型肿瘤组织中异常高表达，如子宫内膜癌^［15］、卵巢癌^［16］和胃癌^［17］等。研究^［18-19］表明：PGC-1α可促进线粒体受体基因的表达，同时通过NRF1和TFAM调控线粒体呼吸作用。因此，PGC-1α/TFAM轴在调控线粒体生物合成及癌细胞凋亡过程中发挥重要作用。本研究结果显示：miR-153-3p过表达可通过靶向抑制PGC-1α表达，阻断PGC-1α/TFAM信号通路，导致线粒体功能障碍和ROS水平升高，进而损伤线粒体，Cyt C释放增加，激活Caspase级联反应，最终诱导Tca8113细胞凋亡。

线粒体在数量和功能上的变化可影响其生物合成，进而调控细胞凋亡和自噬等多种细胞生物学过程，这是细胞应对外部环境刺激的正常反应。然而持续异常的应激反应可导致心血管和内分泌相关等多系统疾病的发生^［20］。线粒体生物合成受到复杂的网络化体系调控，外界刺激信号与线粒体内部功能通过位于该网状系统上游的PGC-1α进行衔接，使其成为调节线粒体生成与功能的核心枢纽。此外，PGC-1α还可通过激活下游通道中NRF1和NRF2以促进TFAM表达上调^［21-22］。因此，调控PGC-1α以维持线粒体功能对于疾病预防和治疗具有重要意义。本研究结果显示：miR-153-3p在OSCC患者癌组织和OSCC细胞中异常低表达；过表达miR-153-3p可抑制PGC-1α表达，并促使Tca8113细胞中ROS水平升高和线粒体膜电位下降，进而引起细胞凋亡。为进一步研究miR-153-3p对PGC-1α的调控作用，本研究利用PGC-1α过表达质粒和miR-153-3p mimic共转染入Tca8113细胞中，结果发现：PGC-1α过表达可逆转miR-153-3p诱导的细胞凋亡和线粒体损伤，表明miR-153-3p的作用依赖于对PGC-1α的靶向调控。

Cyt C作为线粒体膜间腔内的一种水溶性蛋白质，是 线 粒 体 呼 吸 链（mitochondrial respiratory chain，MRC）的重要组成部分，在生物氧化过程中作为呼吸链复合物Ⅲ和复合物Ⅳ之间的电子传递体，参 与 三 磷 酸 腺 苷（adenosine triphosphate，ATP）的合成^［23］。Cyt C缺乏会阻断电子传递链，导致ATP合成减少，能量供应不足，同时由于不完全氧化而产生大量的超氧阴离子^［24］可引发细胞凋亡^［25］。本研究结果显示：过表达miR-153-3p可促使Tca8113细胞线粒体中Cyt C释放至胞浆中，引起线粒体Cyt C缺乏和产能障碍，诱导癌细胞凋亡。

综上所述，本研究初步从细胞水平阐明了miR-153-3p可通过靶向PGC-1α/ TFAM轴调控线粒体凋亡途径诱导OSCC细胞凋亡。该发现为OSCC的治疗提供了新的有效靶点，也为其他癌症的治疗提供了理论依据。

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