二甲双胍对自发性高血压大鼠心肌肥厚的改善作用及其机制

Improvement effect of metformin on myocardial hypertrophy in spontaneously hypertensive rats and its mechanism

摘要

目的 探讨二甲双胍（Met）对自发性高血压大鼠（SHR）心肌肥厚的改善作用，并阐明其可能的作用机制。 方法 以SHR建立心肌肥厚模型，并随机分为SHR组和SHR+Met组；另选取同年龄WKY雄性大鼠作为WKY组。SHR+Met组大鼠给予Met悬浊液（300 mg·kg^-1·d^-1）灌胃6周，SHR组和WKY组大鼠予等体积蒸馏水灌胃。干预结束后，称量各组大鼠体质量和左心室质量，计算左心室质量指数（LVMI）。采用Western blotting法检测各组大鼠心肌组织中心房利钠肽（ANP）和B型脑钠肽（BNP）蛋白表达水平，电镜观察各组大鼠心肌细胞线粒体超微结构，Western blotting法和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组大鼠心肌组织中线粒体融合指标神经萎缩蛋白1（OPA1）及线粒体融合蛋白2（MFN2）蛋白和mRNA表达水平。 结果 与WKY组比较，SHR组大鼠LVMI明显升高（P<0.05），心肌组织中ANP和BNP蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。与SHR组比较，SHR+Met组大鼠LVMI明显降低（P<0.05），心肌组织中ANP和BNP蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。电镜观察，SHR组大鼠心肌组织中线粒体排列紊乱，出现线粒体嵴间隙增宽、断裂或消失；SHR+Met组大鼠线粒体形态有所恢复，嵴重构明显。与WKY组比较，SHR组大鼠心肌组织中OPA1和MFN2蛋白与mRNA表达水平明显降低（P<0.05）；与SHR组比较，SHR+Met组大鼠心肌组织中OPA1和MFN2蛋白与mRNA水平明显升高（P<0.05）。 结论 Met可减轻SHR大鼠的心肌肥厚，其作用机制可能与改善线粒体形态、上调心肌组织中线粒体融合蛋白OPA1和MFN2表达有关。

Abstract

Objective To discuss the ameliorative effect of metformin （Met） on myocardial hypertrophy in the spontaneously hypertensive rats （SHR）， and to clarify its possible mechanism of action. Methods The myocardial hypertrophy models were established with SHR， and the rats were randomly divided into SHR group and SHR+Met group； the age-matched male WKY rats were selected as WKY group. The rats in SHR+Met group were given Met suspension （300 mg·kg^-1·d^-1） by gavage for 6 weeks， and the rats in SHR group and WKY group were given equal volume of distilled water by gavage. After intervention， the body mass and left ventricular mass of the rats in various groups were measured， and the left ventricular mass index （LVMI） was calculated. Western blotting method was used to detect the expression levels of atrial natriuretic peptide （ANP） and brain natriuretic peptide （BNP） proteins in myocardium tissue of the rats in various groups； electron microscope was used to observe the mitochondrial ultrastructure of the cardiomyocytes of the rats in various groups； Western blotting method and real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） method were used to detect the expression levels of mitochondrial fusion indicators optic atrophy 1 （OPA1） and mitofusin 2 （MFN2） proteins and mRNA in myocardium tissue of the rats in various groups. Results Compared with WKY group， the LVMI of the rats in SHR group was significantly increased （P<0.05）， and the expression levels of ANP and BNP proteins in myocardium tissue of the rats were significantly increased （P<0.05）. Compared with SHR group， the LVMI of the rats in SHR+Met group was significantly decreased （P<0.05）， and the expression levels of ANP and BNP proteins in myocardium tissue of the rats were significantly decreased （P<0.05）. The electron microscope results showed that in SHR group， the mitochondria in myocardium tissue of the rats were arranged disorderly， with widened， broken， or disappeared mitochondrial cristae spaces； in SHR+Met group， the mitochondrial morphology of the rats was partially restored， and the cristae remodeling was obvious. Compared with WKY group， the expression levels of OPA1 and MFN2 proteins and mRNA in myocardium tissue of the rats in SHR group were significantly decreased （P<0.05）； compared with SHR group， the levels of OPA1 and MFN2 proteins and mRNA in myocardium tissue of the rats in SHR+Met group were significantly increased （P<0.05）. Conclusion Met can alleviate myocardial hypertrophy in the SHR rats， and its mechanism may be related to improving mitochondrial morphology and up-regulating the expression of mitochondrial fusion proteins OPA1 and MFN2 in the myocardium tissue.

Graphical abstract

关键词

心肌肥厚 / 二甲双胍 / 线粒体融合 / 神经萎缩蛋白1 / 线粒体融合蛋白2

Key words

Myocardial hypertrophy / Metformin / Mitochondrial fusion / Optic atrophy 1 / Mitofusin 2

病理性心肌肥厚是心脏应对多种病理损伤刺激时发生的适应性改变^［1］。病理性心肌肥厚易进展为心力衰竭，增加不良心血管事件发生的风险，是多种心脏疾病的独立危险因素^［2-4］。改善病理性心肌肥厚可延缓心衰进展，降低心血管风险及病死率，但目前临床上尚缺乏有效的治疗药物。二甲双胍（metformin，Met）作为临床上治疗2型糖尿病的一线用药，已被认为对心血管系统具有保护作用^［5-7］，但其具体机制尚不清楚。

本课题组前期研究^［8］表明：异丙肾上腺素诱导的H9C2心肌细胞肥大模型中，线粒体融合指标神经萎缩蛋白1（optic atrophy 1，OPA1）和线粒体融合蛋白2（mitofusin 2，MFN2）表达下调，Met可能通过调控OPA1和MFN2介导的线粒体融合过程改善H9C2心肌细胞肥大。基于上述结果，本研究旨在从动物水平探讨Met对病理性心肌肥厚的改善作用，分析其对OPA1和MFN2介导的线粒体融合的影响，以期为病理性心肌肥厚的临床治疗提供实验支持和潜在药物靶点。

1 材料与方法

1.1　实验动物、主要试剂和仪器

自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rat，SHR）和Wistar-Kyoto（WKY）大鼠各8只，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。Met（格华止）购自中美上海施贵宝制药有限公司，OPA1抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，MFN2、心房利钠肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、B型脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）和甘油醛- 3-磷 酸 脱 氢 酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）等抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。反转录试剂盒和SYBR Green PCR试剂盒均购自日本TaKaRa生物试剂有限公司。电泳和转膜仪器及实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）仪均购自美国Bio-Rad公司，凝胶成像设备购自以色列DNR公司，光学显微镜购自日本Olympus公司，Leica RM 2135组织切片机购自徕卡（上海）贸易有限公司。

1.2　实验动物分组和给药

SHR和WKY大鼠分笼饲养于温、湿度适宜的环境中，自由摄食饮水。将SHR随机分为SHR组（模型组）和SHR+Met组（Met 干 预 组）， 并 以 WKY 大 鼠 为 WKY 组。SHR+Met组大鼠给予300 mg·kg^-1·d^-1 Met灌胃治疗6周，另外2组大鼠给予等体积蒸馏水灌胃。灌胃后注意安抚并观察大鼠状况，操作过程中尽可能减轻动物痛苦。

1.3　大鼠体质量和心脏质量测定及电镜观察心肌线粒体超微结构

干预结束后，称取各组大鼠体质量，常规麻醉后，暴露大鼠心脏。取血后快速取出心脏，冰上剥离左室并称取左心室质量（left ventricular mass，LVM），计算左心室质量指数（left ventricular mass index，LVMI）。LVMI=LVM/体质量。部分心肌组织立即投入液氮速冻，后转移至-80 ℃保存；部分置入TRIzol液内用于RT-qPCR实验。另取心肌组织投入2%戊二醛内待用，并进行电镜标本制备：4 ℃冰箱内放置4 h后，将标本放入磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗3次后，使用1%锇酸后固定。经梯度乙醇和丙酮脱水，用树脂包埋，制备切片。最后经醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色法染色后，于透射电子显微镜下观察并拍照采集图像。

1.4　Western blotting法检测各组大鼠心肌组织中ANP、BNP、OPA1和MFN2蛋白表达水平

取2组大鼠心肌组织，解冻后称质量并加入蛋白裂解液。剪碎，超声波粉碎机粉碎组织。4 ℃低温12 000 r·min^-1离心，15 min后提取上清，即为总蛋白，并依据二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白浓度。配制分离胶和浓缩胶，上样30 μg蛋白，110V/90V电泳，随后300 mA转膜1 h，常温摇床封闭2 h。加入一抗ANP（1∶1 000稀释）、BNP（1∶1 000）、OPA1（1∶500）、MFN2（1∶500）和GAPDH（1∶2 000），压膜封口并冰箱内过夜。次日加入二抗（1∶5 000），室温孵育2 h。显色后采用Image J软件分析目的蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。

1.5　RT-qPCR法检测各组大鼠心肌组织中OPA1和MFN2 mRNA表达水平

提取前严格按照RNase消除方法处理玻璃、金属器皿等。将-80 ℃冷冻组织样品解冻、研磨，4 ℃静置10~30 min，12 000 r·min^-1离心15 min。取上清，加入等体积异丙醇混匀静置10 min，再次低温离心并弃上清，加入75%乙醇洗涤。取EP管管底RNA液1~3 μL，测定吸光度（A）值。A（260）/A（280）比值处于1.8~2.0视为RNA纯度较纯，无DNA或蛋白质残余。PCR反应体系：于PCR管内依次加入目的基因上、下游引物各0.25 µL，PCR反应Mix试剂12.5 µL，加入双蒸水补足至25.0 µL。引物均由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司利用Primer 5.0设计并合成。引物序列见表1。混匀后放入PCR仪，设置目的基因热循环参数后进行反应：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃延伸10 min；共35个循环，反应结束后保存备用。以GAPDH为内参，采用2^-△△Ct法计算各组大鼠心肌组织中OPA1和MFN2 mRNA表达水平。

1.6　统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。各组大鼠LVMI，心肌组织中ANP、BNP、OPA1和MFN2蛋白表达水平及OPA1和MFN2 mRNA表达水平均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　各组大鼠体质量、LVM和LVMI

3组大鼠体质量比较差异无统计意义（P>0.05）；SHR+Met组大鼠体质量略低，但与其他2组比较差异无统计学意义（P>0.05）。与WKY组比较，SHR组大鼠LVMI 明 显 升 高（P<0.05）；与 SHR 组 比 较，SHR+Met组大鼠LVMI明显降低（P<0.05）。见表2。

2.2　各组大鼠心肌组织中ANP和BNP蛋白表达水平

与WKY组比较，SHR组大鼠心肌组织中ANP和BNP蛋白表达水平明显升高（P<0.05），提示SHR大鼠心肌肥厚。与SHR组比较，SHR+Met组大鼠心肌组织中ANP和BNP蛋白表达水平明显降低（P<0.05），提示Met可改善SHR大鼠心肌肥厚。见图1。

2.3　各组大鼠心肌细胞线粒体超微结构

WKY组大鼠心肌细胞线粒体排列规整，形态为圆形或椭圆形，嵴清晰完整。SHR组大鼠心肌细胞中可见部分线粒体肿胀，外膜致密，嵴间隙增宽，可见嵴断裂、溶解，出现空白区。SHR+Met组大鼠线粒体形态较SHR组有所改善，嵴结构相对明显清晰。见图2。

2.4　各组大鼠心肌组织中线粒体融合蛋白MFN2和OPA1蛋白及基因表达水平

与WKY组比较，SHR组大鼠心肌组织中OPA1和MFN2蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）；与SHR组比较，SHR + Met组大鼠心肌组织中OPA1和MFN2蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。RT-qPCR法检测结果显示：与WKY组比较，SHR组大鼠心肌组织中OPA1和MFN2 mRNA水平均明显降低（P<0.05）；与SHR组比较，SHR+Met组大鼠心肌组织中OPA1和MFN2 mRNA水平明显升高（P<0.05）。见图3。

3 讨 论

目前Met在临床应用已逾60年。研究^［8-10］表明：Met不仅可以降血糖，还可调节血管重构，改善心肌肥厚，延缓心衰进展，降低心血管疾病死亡率。2023年一项关于Met对糖尿病患者全因死亡率、心血管死亡率及心血管事件发生率影响的荟萃分析^［11］显示：接受Met治疗的糖尿病患者心肌梗死风险、心血管疾病死亡率和发病率均明显低于使用磺酰脲类药物或安慰剂或未经药物治疗的受试者。2021年《美国糖尿病学会糖尿病医学诊疗标准》^［12-13］指出：对肾小球滤过率>30 mL·min^-1·1.73 m^-2且并发稳定性心力衰竭的2型糖尿病患者，可考虑使用Met，并提示Met可能对心血管有保护作用。然而，二甲双胍的心血管保护作用尚待验证。一项纳入2 079例2型糖尿病患者的临床Meta分析^［14］认为Met能否降低心血管疾病风险尚不确定。针对糖尿病患者急性心肌梗死入院的回顾性研究^［15］发现：Met对患者再入院风险和死亡率均无明显改善。截至目前，尚缺乏直接数据确切证明Met对心血管具有保护作用，其相关机制尚需进一步的基础与临床试验研究。

SHR是被广泛用于模拟人类原发性高血压及其并发症的理想动物模型。研究^［16-18］发现：SHR在第10周龄时已形成左心室肥厚，第13周龄时左心室肥厚程度加重。本研究以SHR为研究对象，探讨单纯应用Met对高血压所致病理性心肌肥厚的干预作用。结果显示：经Met治疗6周后，SHR组大鼠LVMI明显降低，同时心肌组织中ANP和BNP蛋白表达下调。ANP和BNP被认为是最常见的病理性心肌肥厚相关基因^［19］。心脏压力持续超负荷时，心肌细胞中ANP和BNP等肥厚相关基因被激活，心肌细胞表型改变，重新表达或分泌ANP和BNP，进而使心脏结构发生肥大改变。这些结果说明Met可有效改善病理性心肌肥厚。上述结果直接证实了Met对心脏的保护作用，为Met的心血管保护作用提供了客观的数据支持。

目前，围绕Met的心血管保护机制已开展了大量基础研究。近年来，随着对线粒体研究的深入，有许多研究^［20-22］认为Met可能通过改善线粒体功能来发挥其保护心血管的作用。研究^［23］显示：Met可通过维持线粒体动力学平衡及钙稳态平衡，改善因阿霉素引起的心脏损伤。在心肌细胞中，线粒体约占细胞体积的三分之一，是细胞生物合成和能量产生的关键细胞器。线粒体彼此之间相互联通，通过不断分裂、融合，动态维持其数量与形态^［24］。本课题组前期研究^［8］证实：异丙肾上腺素诱导的H9C2心肌细胞肥大与线粒体融合蛋白OPA1和MFN2表达下降有关联；Met干预后，细胞横截面积缩小，ANP表达降低，表明Met可能通过调控线粒体融合改善心肌细胞肥大。本研究结果显示：SHR组大鼠线粒体形态异常，体积缩小且嵴间隙增宽，部分出现嵴断裂、消失或空泡状等；同时，心肌组织中OPA1和MFN2蛋白及mRNA表达水平降低；Met治疗后，SHR+Met组大鼠心肌线粒体形态改善，嵴结构重建明显，且OPA1和MFN2蛋白及mRNA表达上调。上述结果表明：Met能改善SHR心肌肥厚，且上述改善作用可能与其修复线粒体形态和上调OPA1及MFN2表达水平有关联。

综上所述，本研究进一步明确了线粒体动力学异常与心肌肥厚的相关性，揭示了线粒体动力学失衡可能是高血压所致心肌肥厚的重要分子机制；同时也提示Met可能通过调控OPA1和MFN2介导的线粒体融合改善病理性心肌肥厚。本研究结果为Met对心血管疾病保护作用的多样机制提供了新的靶点和研究方向。

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基金资助

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