急性缺血性卒中患者血清中细胞因子水平和免疫状态变化及危险因素分析

Changes in serum cytokine levels, immune status and risk factor analysis in patients with acute ischemic stroke

摘要

目的 探讨急性缺血性卒中（AIS）患者血清中细胞因子水平和免疫状态，阐明同型半胱氨酸（Hcy）水平、卒中后感染和吸烟等因素对AIS患者免疫反应的影响。 方法 选取AIS患者共53例，收集患者基础信息，并于发病72 h内收集患者血清样本，测定患者血清中各细胞因子水平，包括Hcy、白细胞介素 （IL）-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、γ干扰素 （IFN-γ） 和肿瘤坏死因子α （TNF-α）。根据Hcy水平三分位数、卒中发生后并发感染和吸烟情况分别进行患者分组。比较各组患者基线资料和上述细胞因子水平的差异；采用多元线性回归模型分析AIS患者中各细胞因子水平与Hcy水平、吸烟情况及其他基线指标的相关性。 结果 与低水平Hcy组比较，高水平Hcy组患者血清中IL-6和IFN-γ水平明显升高（P<0.05）。多元线性回归分析，Hcy水平与IFN-γ水平间有关联（β=0.363，P<0.05）。与非感染组比较，感染组患者血清中IL-4水平明显升高（P<0.01），血清中IFN-γ/IL-4比值呈降低趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。与非吸烟组比较，吸烟组患者血清中IL-2、IL-6、IL-10和IFN-γ水平明显升高（P<0.05）。 结论 AIS患者中，高水平Hcy和吸烟与患者血清中多种促炎因子水平升高有关联，卒中后感染的发生与患者血清中抑炎性细胞因子的水平升高有关联。

Abstract

Objective To discuss the levels of cytokines and the immune status in the serum of patients with acute ischemic stroke （AIS）， and to clarify the effects of factors such as homocysteine （Hcy） level， post-stroke infection， and smoking on the immune response in AIS patients. Methods A total of 53 AIS patients were selected. Basic information of the patients was collected， and serum samples were collected within 72 h of onset. The levels of various cytokines in the serum of the patients were measured， including Hcy， interleukin （IL）-2， IL-4， IL-6， IL-10， IL-17A， interferon-γ （IFN-γ）， and tumor necrosis factor-α （TNF-α）. The patients were grouped according to the tertiles of Hcy level， the occurrence of post-stroke infection， and smoking status， respectively. The differences in baseline data and the levels of the above cytokines were compared among the patients in various groups； multiple linear regression models were used to analyze the correlations between the levels of various cytokines and Hcy level， smoking status， and other baseline indicators in AIS patients. Results Compared with low Hcy level group， the serum levels of IL-6 and IFN-γ in the patients in high Hcy level group were significantly increased （P<0.05）. Multiple linear regression analysis showed an association between Hcy level and IFN-γ level （β=0.363， P<0.05）. Compared with non-infection group， the serum level of IL-4 in the patients in infection group was significantly increased （P<0.01）， while the IFN-γ/IL-4 ratio in serum of the patients showed a decreasing trend， but the difference was not statistically significant （P>0.05）. Compared with non-smoking group， the serum levels of IL-2， IL-6， IL-10， and IFN-γ in the patients in smoking group were significantly increased （P<0.05）. Conclusion In AIS patients， high Hcy level and smoking are associated with increased levels of multiple pro-inflammatory cytokines in the serum of the patients， and the occurrence of post-stroke infection is associated with increased levels of anti-inflammatory cytokines in the serum of the patients.

关键词

急性缺血性卒中 / 细胞因子 / 免疫平衡 / 同型半胱氨酸 / 吸烟 / 卒中后感染

Key words

Acute ischemic stroke / Cytokine / Immune balance / Homocysteine / Smoking / Post-stroke infection

我国脑卒中疾病负担沉重，2020年40岁以上人群新发卒中340万例，患病达1 780万例，死亡230万例^［1］。免疫反应进程贯穿缺血性卒中的发生发展过程，且二者之间交互影响：一方面，免疫反应通过促进动脉粥样硬化^［2-3］、引发神经免疫损伤^［4］和神经细胞凋亡等过程，影响缺血性卒中发生发展；另一方面，缺血性卒中事件可改变机体的免疫状态^［5］，进一步影响患者长期功能结局。

细胞因子水平是反映机体免疫状态的重要指标。健康状态下，各类细胞因子可维持机体免疫平衡^［6］；当机体免疫状态受危险因素影响时，某种细胞因子含量过高、过低或比例失衡可引起免疫紊乱^［6］，促进脑动脉粥样硬化的发生^［2-3］，加剧脑组织的缺血性损伤^［4］，或影响卒中后感染等合并症的发 生^［7］。因 此，探 讨 急 性 缺 血 性 卒 中（acute ischemic stroke，AIS）患者免疫状态的影响因素有助于发现新的临床干预靶点。

AIS患者人群常合并长期吸烟和同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平过高等突出特点，这些因素可能参与免疫调节。目前，针对AIS患者开展吸烟对免疫或细胞因子水平影响的研究较少，但在肺部疾病^［8-9］、慢性疼痛^［10］和肝病^［11］患者人群中及动物^［12］或细胞^［13］等实验室研究中已发现吸烟对免疫的促炎影响。同样，Hcy与AIS患者适应性免疫关系的临床研究较少。

本研究基于AIS患者的血清数据，分析AIS患者血清中多种细胞因子水平和免疫状态指标γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）/白细胞介素（interleukin，IL）-4比值，探讨AIS患者中Hcy水平、卒中后感染和吸烟等多种危险因素对其免疫的影响，以期为AIS患者的临床干预提供科学依据。

1 资料与方法

1.1　研究对象

选取2017年10月—2019年10月于吉林大学第一医院神经内科住院的AIS患者。纳入标准：发病时间在72 h之内，美国国立卫生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）评分为4~13分，患者年龄18~80岁，并签署本研究知情同意书。

排除标准：①并发其他颅内动脉疾病（如动脉夹层、颅内动脉瘤和颅内血管畸形等）、自身免疫性疾病、血管炎性疾病或恶性肿瘤者；②发病后已进行静脉溶栓治疗或血管内机械取栓治疗者或曾接受免疫治疗者；③发病原因考虑为颅内动脉栓塞者；④明显肝功能异常者，丙氨酶基转移酶或天门冬氨酸氨基转移酶高于正常值上限的3倍；⑤明显肾功能异常者，肌酐清除率<0.6 mL·s^-1或血清肌酐>265 μmol·L^-1；⑥近1个月有严重外伤史或重大手术史者。患者入院时询问既往病史并记录患者年龄、高血压史和糖尿病史。于患者入院第1天使用黄色分离胶促凝管采集血液3 mL， 4 ℃、 3 000 r·min^-1离心5 min，取上清，于-80 ℃冻存。

1.2　患者生化指标测定

将患者入院后采集的血清标本送至吉林大学第一医院检验科，测定血清中低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、尿酸（uric acid，UA）和Hcy水平。使用细胞珠阵列（cytometric bead array，CBA）人辅助性Ｔ细胞（helper T cell，Th）1/Th2/Th17试剂盒（美国BD公司），根据说明书测定患者血清中细胞因子水平，包括IL-2、IL-6、IL-4、IL-10、IL-17A、IFN-γ和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）。参考试剂盒说明书制备细胞因子标准品，将捕获珠添加到各试管中，包括样品、标准品和阴性对照品，于无光室温条件下孵育30 min。使用流式细胞仪检测患者血清中细胞因子水平，检测前使用细胞仪设置珠进行校准。

1.3　患者分组

本研究共纳入53例患者，分别根据Hcy水平、卒中发生后并发感染情况和吸烟情况进行分组。

1.3.1　Hcy水平分组

所有患者均于入院后抽血并测定血清中Hcy水平。根据Hcy水平的三分位数，将患者分为低水平Hcy组、中水平Hcy组和高水平Hcy组。低水平Hcy组患者血清中Hcy水平≤11.3 mmol·L^-1，共17例；中水平Hcy组患者血清中Hcy水平为11.3~17.0 mmol·L^-1，共18例；高水平Hcy组患者血清中Hcy水平≥17.0 mmol·L^-1，共18例。

1.3.2　卒中发生后并发感染情况分组

感染组由以下2项标准共同定义：①存在感染的临床症状，包括尿频和尿急等尿道感染临床表现及咳嗽、咳痰和气喘等肺部感染临床表现以及发热等；②存在感染相关的实验室证据或影像学证据，包括白细胞计数>10×10⁹ L^-1，尿液细菌或白细胞升高，以及胸部CT提示肺部感染等。非感染组则纳入未见感染临床症状且未出现相关实验室证据和影像学证据患者。剔除3例实验室化验或影像学检查数据缺失患者，4例有轻微感染症状但实验室化验和影像学检查难以判断有无新近感染者。最终，感染组纳入患者15例，非感染组纳入患者31例。

1.3.3　吸烟情况分组

记录患者吸烟情况。吸烟组纳入烟龄超过1年、至今未戒或戒烟不满6个月且每日吸烟数量超过10支的患者26例。非吸烟组仅包含从未吸烟的患者20例。剔除6例已戒烟超过5年者，1例仅偶尔吸烟者。

1.4　统计学分析

采用SPSS 25.0统计软件进行统计学分析，采用GraphPad Prism 7软件绘制统计图。AIS患者性别、高血压史和糖尿病史为计数资料，以 n（%） 表示，组间差异比较采用χ² 检验。患者年龄、LDL-C和UA水平、NIHSS评分以及细胞因子IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ、IL-4、IL-17A和TNF-α水平及IFN-γ/IL-4比值均不符合正态分布，以M（P25，P75）表示，组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，2组间比较采用Mann-Whitney U检验。采用多元线性回归模型分析Hcy水平、吸烟和其他基线指标水平与上述细胞因子水平的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　3组患者基线资料和血清中细胞因子水平

根据患者Hcy水平分组后，3组患者的年龄、性别、高血压史、糖尿病史、吸烟史、NIHSS评分、LDL-C水平和UA水平等比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

3组患者血清中IL-6和IFN-γ水平比较差异有统计学意义（P<0.05），IL-2、IL-10、IL-4、IL-17A和TNF-α水平及IFN-γ/IL-4比值比较差异无统计学意义（P>0.05）。组间两两比较，与低水平Hcy组患者比较，中水平Hcy组患者血清中IL-6水平明显升高（P<0.05），高水平Hcy组患者血清中IL-6和IFN-γ水平均明显升高（P<0.05）。随着Hcy水平升高，患者血清中IL-2水平和IFN-γ/IL-4比值也呈升高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.2　卒中后有无感染组患者基线资料和血清中细胞因子水平

卒中后感染组和非感染组患者基线资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。与非感染组患者比较，感染组患者血清中IL-4水平明显升高（P<0.01），IL-2、IL-6、IL-10、IL-17A和TNF-α水平及IFN-γ/IL-4比值比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

2.3　吸烟组和非吸烟组患者基线资料及血清中细胞因子水平

与非吸烟组患者比较，吸烟组患者中男性比例升高（P<0.05），其余基线资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表5。与非吸烟组患者比较，吸烟组患者血清中IL-2、IL-6、IL-10和IFN-γ水平明显升高（P<0.05），IL-4、IL-17A和TNF-α水平无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）；吸烟组患者IFN-γ/IL-4比值有升高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表6。

2.4　AIS患者血清中细胞因子水平的影响因素

以患者年龄、性别、高血压史、糖尿病史、NIHSS评分和LDL-C水平及UA水平等基线资料为自变量，以IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ、IL-4、IL-17A和TNF-α水平及IFN-γ/IL-4比值为因变量，进行多元线性回归分析，结果显示：各种细胞因子水平均未受到任何基线指标的显著影响（P>0.05）。以患者吸烟情况和Hcy水平为自变量，以各细胞因子水平为因变量，多元线性回归分析结果显示：AIS患者血清中IFN-γ水平与Hcy水平有关联（β=0.363，P<0.05）；IFN-γ水平与患者吸烟情况有关联（P<0.05）。

3 讨 论

Th细胞广泛参与脑梗死发生发展和修复过程，其不同亚群可分泌特征性的细胞因子，参与不同的病理生理过程。一类亚群为促炎性Th细胞，包括Th1和Th17细胞，可通过分泌促炎细胞因子来促进炎症损伤^［3］、诱导神经细胞凋亡^［14］甚至加剧组织破坏；另一类亚群细胞为抑炎性Th细胞，包括Th2和调节性T细胞，参与血管生成^［15］、微环境调节^［16］和神经元再生^［17］等促进修复的过程。各亚群细胞间互相拮抗，共同维持免疫平衡。

Th1细胞应答的关键特征是IFN-γ的产生。IFN-γ参与缺血性卒中后的延迟免疫反应，是M1表型胶质细胞激活的精确启动子；活化的M1小胶质细胞在缺血脑组织中增殖并分泌趋化因子和炎性细胞因子，二者交互作用，加剧脑组织炎症^［3］。IL-2亦由Th1细胞分泌，发挥促炎作用^［3］。此外，Th1和Th17细胞分泌的IL-17A、IL-6及TNF-α等细胞因子均在炎症和自身免疫进程中发挥促炎作用^［18］。Th2细胞特征则是释放IL-4和IL-10等抑炎细胞因子发挥保护作用。IL-4可抑制TNF-α、IL-6和趋化因子等表达，拮抗Th1细胞反应，减轻缺血脑组织炎症损伤，促进神经生成^［19］，并诱导小胶质细胞向M2表型极化，从而改善脑梗死患者的长期预后^［20］。IL-10可通过活化B细胞中NF-κB通路抑制炎症反应，并已被证实可减小脑梗死体积^［21］。在AIS患者中，上述细胞因子之间的平衡被打破。IFN-γ/IL-4比值可反映Th1和Th2细胞亚群的相对比重，IFN-γ/IL-4比值升高表明Th1细胞占据优势，免疫偏向促炎状态；IFN-γ/IL-4比值降低表明Th2细胞占比高，免疫偏向抑炎状态。上述细胞因子及其平衡受多方面因素调节，包括患者Hcy水平和吸烟史等，同时也影响卒中后感染的发生。

高Hcy血症常见于心脑血管疾病患者，Hcy水平升高可促进T细胞增殖并刺激其分泌多种促炎细胞因子，进而加速动脉粥样硬化进程^［22］。研究^［23］表明：体外实验中，Hcy可影响T细胞中线粒体的代谢，通过促进线粒体活性氧产生和提高线粒体膜电位，诱导IFN-γ分泌；动物模型实验中，高Hcy可抑制调节性T细胞功能，加速动脉粥样硬化发展。综上，Hcy对不同Th细胞亚型具有不同调节作用，可引起Th细胞亚群及相关细胞因子失衡，从而导致不良结局发生。本研究结果显示：Hcy高水平组患者血清中促炎细胞因子IL-6和IFN-γ水平明显升高，IFN-γ/IL-4比值亦有升高趋势，提示该组患者免疫平衡被打破，免疫状态偏向促炎方向，Th1特征性免疫反应可能占主导地位，该结果为了解Hcy对脑梗死患者发病及预后的影响提供了参考。

感染是AIS的常见并发症，以肺部感染和泌尿道感染为主，其发病机制与卒中后免疫抑制有密切关联。导致卒中后感染的重要机制为Th细胞从Th1表型转变为Th2表型^［24］，其特征表现为Th1型细胞因子与Th2型细胞因子比值降低^［25］。本研究比较了感染组和非感染组AIS患者的免疫状态，包括血清中多种细胞因子水平和Th1型细胞因子与Th2型细胞因子比值，即IFN-γ/IL-4比值。结果显示：感染组患者血清中Th2型细胞因子IL-4水平明显升高，且IFN-γ/IL-4比值有降低趋势，提示卒中后感染患者的免疫平衡被打破，Th2型免疫占优势，免疫抑制程度较重，提示免疫抑制状态可能是卒中后感染发生的重要原因。

吸烟是脑动脉粥样硬化发生进而诱发AIS的重要危险因素，其致病机制包括对血管内皮的损伤、氧化应激及其介导的免疫紊乱和血管炎症。研究^［10-11］表明：香烟烟雾可以通过CD40-CD40L通路影响小鼠Th细胞分化，引起多种促炎细胞增殖，促进小鼠和人上皮细胞促炎细胞因子的表达^［11］，包括TNF-α、IL-17A、IL-27、IL-1和IL-6等。本研究结果显示：吸烟组患者血清中IL-2、IL-6、IL-10和IFN-γ水平明显升高，其中IL-2和IFN-γ均为Th1细胞分泌的特征性细胞因子；吸烟患者血清中IFN-γ/IL-4比值有升高趋势，提示Th1和Th2细胞亚群失衡，Th1型免疫占优势。然而，2组患者性别构成差异明显，吸烟组患者以男性居多，吸烟对AIS患者免疫状态的影响仍需扩大样本量进一步验证。

综上，炎症反应贯穿AIS的发生发展、修复和转归过程，AIS患者出现免疫状态紊乱，免疫平衡被打破。促炎性免疫细胞及相关细胞因子可促进神经系统炎症反应，导致神经损伤等不良结局；抑炎性免疫细胞及细胞因子则参与神经修复过程。抑制促炎性免疫进程的过度激活具有神经保护作用。本研究基于患者血清学化验结果，为AIS患者的免疫状态评估提供了依据。高水平Hcy和吸烟等危险因素可激活机体促炎性免疫进程，提示临床中需严格管控。但抑炎性免疫进程占比提高可能增加卒中后感染风险，因而免疫状态平衡应维持在合理范围内。由于本研究规模有限，且影响患者免疫状态的因素众多，上述因素与AIS免疫平衡的关系仍需进一步探讨。未来可进一步扩大样本量，纳入更多潜在影响因素，以进一步分析各因素对AIS患者免疫反应的影响，并开展患者预后的长期随访，从而为实际临床诊疗提供更具参考价值的数据。

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基金资助

吉林省科技厅自然科学基金项目(20210101269JC)

吉林省科技厅自然科学基金项目(YDZJ202201ZYTS037)

吉林省财政厅医疗卫生人才专项(JLSWSRCZX2023-89)

吉林大学第一医院第十四届院青年发展基金项目（2023年）

吉林大学第一医院横向课题研究项目(2024YX0063)

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