TAGLN2 shRNA慢病毒载体的构建及其稳定转染细胞系的建立

Construction of TAGLN2 shRNA lentiviral vector and establishment of its stably transfected cell line

摘要

目的 构建针对小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd.3细胞肌动蛋白结合蛋白2（TAGLN2）基因的慢病毒载体，并鉴定其沉默作用。 方法 依据TAGLN2基因编码区设计短发夹RNA（shRNA）干扰靶点，将其扩增产物连接至经EcoR Ⅰ和Age Ⅰ双酶切线性化的GV493慢病毒载体，构建GV493-TAGLN2-shRNA重组慢病毒载体，PCR法筛选阳性克隆并测序鉴定。将GV493对照慢病毒载体和GV493-TAGLN2-shRNA重组慢病毒载体分别转染至HEK293T细胞，收集纯化上清并测定病毒滴度。以感染复数（MOI）为100，分别感染bEnd.3细胞，感染48 h更换含10 mg·L^-1嘌呤霉素的完全培养基筛选培养14 d。采用倒置荧光显微镜观察2组细胞中绿色荧光蛋白（GFP）表达情况，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测2组细胞中TAGLN2 mRNA表达水平，Western blotting法检测2组细胞中TAGLN2蛋白表达水平。 结果 荧光显微镜观察，转染后的HEK293T细胞中有强烈的GFP荧光信号，表明慢病毒包装体系构建成功。GV493对照慢病毒的滴度为5×10¹¹ TU·L^-1，TAGLN2干扰慢病毒滴度为6×10¹¹ TU·L^-1。转染后，2组bEnd.3细胞均呈现明显GFP荧光信号，稳转细胞系构建成功。RT-qPCR法，与GV493对照组比较，GV493-TAGLN2-shRNA组细胞中TAGLN2 mRNA表达水平明显降低（P<0.01）。Western blotting法，与GV493对照组比较，GV493-TAGLN2-shRNA组细胞中TAGLN2蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。 结论 成功构建靶向bEnd.3细胞TAGLN2基因的慢病毒载体，其可高效沉默TAGLN2表达。

Abstract

Objective To construct a lentiviral vector targeting the transgelin-2 （TAGLN2） gene in the mouse brain microvascular endothelial cell line bEnd.3 cells， and to identify its silencing effect. Methods Short hairpin RNA （shRNA） interference target sites were designed based on the coding region of the TAGLN2 gene. The amplified products were ligated into the GV493 lentiviral vector linearized by double digestion with EcoR Ⅰ and Age Ⅰ to construct the GV493-TAGLN2-shRNA recombinant lentiviral vector. The positive clones were screened by PCR and identified by sequencing. The GV493 control lentiviral vector and the GV493-TAGLN2-shRNA recombinant lentiviral vector were respectively transfected into the HEK293T cells， and the supernatants were collected and purified， and the viral titers were determined. The bEnd.3 cells were infected with a multiplicity of infection （MOI） of 100. After 48 h of infection， the complete medium containing 10 mg·L^-1 puromycin was replaced for screening and culture for 14 d. An inverted fluorescence microscope was used to observe the expression of green fluorescence protein （GFP） in the cells in two groups； real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） method was used to detect the expression levels of TAGLN2 mRNA in cells in two groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of TAGLN2 protein in the cells in two groups. Results The fluorescence microscope observation results showed that there was a strong GFP fluorescence signal in the transfected HEK293T cells， indicating that the lentiviral packaging system was successfully constructed. The titer of the GV493 control lentivirus was 5×10¹¹ TU·L^-1， and the titer of the TAGLN2 interference lentivirus was 6×10¹¹ TU·L^-1. After transfection， the bEnd.3 cells in two groups showed obvious GFP fluorescence signals， indicating that the stable transfected cell lines were successfully constructed. The RT-qPCR results showed that compared with GV493 control group， the expression level of TAGLN2 mRNA in the cells in GV493-TAGLN2-shRNA group was significantly decreased （P<0.01）. The Western blotting results showed that compared with GV493 control group， the expression level of TAGLN2 protein in the cells in GV493-TAGLN2-shRNA group was significantly decreased （P<0.01）. Conclusion A lentiviral vector targeting the TAGLN2 gene in bEnd.3 cells is successfully constructed， which can efficiently silence TAGLN2 expression.

Graphical abstract

关键词

肌动蛋白结合蛋白2 / 稳定转染细胞系 / 慢病毒 / bEnd.3细胞 / 短发夹RNA

Key words

Transgelin-2 / Stably transfected cell line / Lentivirus / bEnd.3 cell / Short hairpin RNA

肌动蛋白结合蛋白 （transgelin，TAGLN） 2，也称平滑肌蛋白 （smooth muscle protein，SM） 22-α，是一种相对分子质量约为22 000的钙调蛋白家族成员^［1］。该家族包括TAGLN1（即SM22）、 TAGLN2^［2］和TAGLN3^［3］。TAGLN2蛋白定位于细胞质，其N端钙调蛋白样结构域与肌动蛋白微丝F-actin特异性结合，从而参与调控细胞骨架和平滑肌收缩^［4］。

除在平滑肌细胞中高表达外，TAGLN2也在多种非平滑肌细胞中表达。TAGLN1和TAGLN3的表达则主要局限于平滑肌及脑神经元中^［5-6］。研究^［7-8］表明：TAGLN2可作为潜在的癌症生物标志物，其通过抑制肌动蛋白聚合从而抑制肿瘤细胞的运动能力；TAGLN2下调可通过激活活性氧和核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信号传导途径促进乳腺癌细胞转移。研究^［9］显示：TAGLN2基因参与相分离过程，可与轴突导向因子G2（Netrin G2，NTNG2）和胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白2（insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 2，IGF2BP2）基因共同构成预测脑胶质瘤预后的新模型。研究^［10］显示：在胰 腺 导 管 腺 癌 中，细 胞 外 信 号 调 节 激 酶 2（extracellular signal-regulated kinase 2，ERK2）与TAGLN2相互作用，随后磷酸化TAGLN2的第145位丝氨酸残基，该过程在肿瘤细胞增殖和肿瘤发生中起重要作用。研究^［11-12］显示：人肺腺癌组织中TAGLN2 mRNA和蛋白表达水平分别上调14.3倍及7.0倍，在胰腺癌中其表达水平也明显上调。

目前TAGLN2在颅内动脉粥样硬化（intracranial atherosclerosis，ICAS）中的作用机制尚 不 明 确。本研究构建TAGLN2的短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒载体，并建立bEnd.3-TAGLN2-shRNA稳定转染细胞系，以期为探讨TAGLN2在ICAS中的作用机制提供研究基础。

1 材料与方法

1.1　细胞、质粒、主要试剂和仪器

小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd.3细胞、人胚肾HEK293T细胞和感受态大肠杆菌DH5α细胞均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。辅助质粒由上海吉凯基因医学科技股份有限公司提供。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）和0.25%胰蛋白酶消化液均购自武汉普诺赛生命科技有限公司，限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和Age Ⅰ购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司，Taq聚合酶购自上海雅酶生物医药科技有限公司，逆转录预混液购自湖南艾科瑞生物工程有限公司，TAGLN2抗体、β-actin抗体和山羊抗兔IgG购自武汉三鹰生物技术有限公司，质粒小提试剂盒和切胶回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司，PCR扩增试剂盒和一步法克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，嘌呤霉素、放射性免疫沉淀分析缓冲液（radioimmunoprecipitation assay buffer，RIPA）蛋白裂解液、增强化学发光法（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒和蛋白酶抑制剂均购自上海碧云天生物技术股份有限公司，Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒和TRIzol试剂均购自日本TaKaRa Bio公司。可调式微量移液器购自德国艾本德股份公司，倒置光学显微镜和倒置荧光显微镜均购自日本Olympus公司，实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR， RT-qPCR）仪购自瑞士Roche公司，电泳仪购自美国Bio-Rad公司，高速冷冻离心机和凝胶成像仪器均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2　细胞培养

bEnd.3内皮细胞和HEK293T细胞均采用DMEM培养基（含10%FBS及1%青霉素-链霉素）进行常规培养。细胞培养环境设定为37 ℃恒温、5% CO₂饱和湿度的细胞培养箱，每48 h进行1次传代操作。当细胞生长至融合度达85%~95%或培养基颜色由桃红色转为橙黄色时，采 用 0.25% 胰 蛋 白 酶-乙 二 胺 四 乙 酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）溶液进行消化处理约2 min，并通过显微镜观察细胞形态趋于圆形后终止消化。

1.3　引物设计和合成

通过美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库查询TAGLN2（Gene ID：12273）的基因信息。基于国际通用引物设计原则，设计针对TAGLN2基因的特异性shRNA干扰序列和RT-qPCR引物。引物和相应序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司制备。

1.4　 TAGLN2 shRNA慢病毒载体构建和鉴定

扩增TAGLN2基因的特异性片段。TAGLN2 shRNA干扰序列为F：5'-GCATTAACACCACG-GACATCT-3'，R：5'-AGATGTCCGTGGTGT-TAATGC-3'。PCR反应体系（50 μL）：各取2 μL正向和反向引物，1 μL cDNA模板，0.25 μL Taq DNA酶，5 μL 10×Taq PCR缓冲液，1 μL dNTP 混合液，用无酶水补足至50 μL。PCR反应程序：94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环。72 ℃下进行2 min的最终延伸步骤。扩增产物经过纯化后可于4 ℃下短期保存。

采用EcoR Ⅰ和Age Ⅰ限制性内切酶对携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）/嘌呤霉素的慢病毒GV493 载体进行酶切。酶切反应体系 （50 μL）：41 μL去离子水、5 μL 10×酶缓冲液、2 μL GV493 DNA（1 g·L^-1）和EcoR Ⅰ及Age Ⅰ内切酶（10⁶ U·L^-1）各1 μL。按上述顺序依次加入各组分，使用移液器轻柔吹打混匀后离心，37 ℃下孵育3 h后过夜。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，采用酶切回收试剂盒回收线性化GV493载体片段。

采用一步法克隆试剂盒，将PCR法扩增的TAGLN2 shRNA片段连接至上述线性化GV493载体。反应体系（10 μL）：1 μL外切酶Ⅱ，1 μL TAGLN2扩增片段，2.5 μL线性化GV493 DNA，2 μL 5×酶缓冲液，加入去离子水补足至10 μL。吹打混匀后，37 ℃下反应30 min，冰浴5 min，获得GV493-TAGLN2重组质粒。

将10 μL GV493-TAGLN2重组质粒和GV493空载质粒分别加入至100 μL DH5α感受态细胞中，将混合均匀的质粒置于冰上静置30 min。随后恒定42 ℃热激处理90 s，迅速转移到冰浴中冷却2 min。随后将反应混合物转移至无菌LB液体培养基中，于37 ℃恒温振荡培养1 h。培养结束后，取适量菌液均匀涂布于含有氨苄西林（终浓度100 mg·L^-1）的LB固体培养平板表面，37 ℃倒置培养12 h。次日，从培养箱中拿出培养平板并挑选单菌落，接种至3 mL含抗生素的LB液体培养基中，37 ℃下摇床培养12 h。

阳性克隆的PCR鉴定体系（20 μL）：10 μL 2×Taq Master Mix（2×Taq酶预混液）、0.4 μL Primer-F（上游引物）、0.4 μL Primer-R（下游引物）和1 μL甘油菌液模板，加入去离子水补足至20 μL。按顺序依次加入各组分至PCR管，轻弹管壁混匀并短暂离心，确保液体聚集于管底。反应程序：94 ℃预变性3 min；循环扩增，共22个循环：94 ℃，30 s、55 ℃，30 s、72 ℃，30 s；最后72 ℃延伸5 min。反应结束后，将PCR产物于4 ℃短期保存或长期保存至-20 ℃。经琼脂糖凝胶电泳检测，若在目标基因片段（约22 bp）位置处出现特异性条带，则为携带重组质粒的阳性菌。挑取阳性克隆菌，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序验证。

1.5　 TAGLN2慢病毒包装和滴度测定

常规培养HEK293T细胞至融合度达80%~90%时进行转染操作。配制转染体系A：辅助质粒Helper 1.0型（5 μg）+Helper 2.0型（5 μg）+目标质粒（10 μg）+ Opti-MEM无血清培养基（750 μL），室温静置5 min。配制转染体系B：Lipofectamine 2000+Opti-MEM无血清培养基（750 μL）。将2管体系混匀，避光孵育20 min后加入至培养皿中，更换无血清培养基，轻柔水平晃动培养皿3~5 次，使复合物均匀分布。于培养箱中孵育4 h后，更换为10 mL DMEM完全培养基，继续培养48 h。于荧光显微镜下观察有绿色荧光的细胞比例超过90%时，收集上清液。于4 ℃、4 000 g离心10 min后，经0.45 μm滤膜过滤后离心，加入磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）重悬病毒沉淀，于-80 ℃保存。

于病毒转染前24 h，将HEK293T细胞以每孔1×10³个细胞的密度接种至96孔细胞培养板。次日，去除旧培养基，设置3个梯度的病毒稀释倍数（10^-3、10^-2和10^-1），每孔分别加入100 μL对应倍数的病毒稀释液（含10^-1、10⁰和10¹ μL病毒原液），另设仅含培养基的对照孔，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中孵育6~8 h。各孔更换100 μL新鲜DMEM完全培养基，继续培养72 h。于荧光显微镜下观察各孔GFP荧光表达细胞数，计算病毒滴度。病毒滴度（TU·L^-1）=病毒稀释倍数×GFP荧光细胞数量/病毒液体积。

1.6　 TAGLN2 shRNA慢病毒稳定转染bEnd.3细胞系的建立

将bEnd.3细胞接种至12孔细胞培养板，待细胞融合度达到70%~80%时进行慢病毒感染实验。将bEnd.3细胞分为GV493对照组和GV493-TAGLN2-shRNA组。设定最佳感染复数（multiplicity of infection，MOI）为100，按照计算公式［病毒稀释液体积=（MOI×细胞数）/病毒滴度］，计算各孔所需病毒稀释液体积，并向对应孔中加入病毒稀释液。感染24 h后，各孔更换新鲜完全培养基，继续培养48 h。各孔加入含嘌呤霉素（10 mg·L^-1）完全培养基筛选稳定转染细胞，24 h后更换含嘌呤霉素（5 mg·L^-1）新鲜培养基，持续培养14 d。筛选结束后，于荧光显微镜下观察各组细胞GFP表达情况。若细胞生长状态良好且GFP阳性细胞比例超过90%，表明GV493-TAGLN2-shRNA慢病毒已成功整合至bEnd.3细胞基因组，稳定转染细胞系成功建立。

1.7　RT-qPCR法检测2组bEnd.3细胞中TAGLN2 mRNA表达水平

收集稳定转染慢病毒后的2组bEnd.3细胞，加入TRIzol试剂提取总RNA后逆转录合成cDNA后，进行RT-qPCR。反应体系：5 μL含SYBR Green荧光染料预混液、上下游引物（10 μmol·L^-1）各0.2 μL、1 μL cDNA模板，加入无酶水补足至10 μL。反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40个循环。引物序列：TAGLN2 F：5'-ATGG-ACCCCATAGATAACAGCA-3'，R：5'-GAGTAG-ATGATAAGGGCTGCAAC-3'； β-actin F：5'-AG-AAGATCTGGCACCACAC-C-3'，R：5'-TACG-ACCAGAGGCATACAGG-3'。采用2^-△△Ct法计算2组细胞中TAGLN2 mRNA表达水平。

1.8　Western blotting法检测2组bEnd.3细胞中TAGLN2蛋白表达水平

收集2组bEnd.3细胞，使用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解细胞，4 ℃、12 000 r·min^-1离心15 min，取上清液为总蛋白样本。按比例加入上样缓冲液后，100 ℃金属浴中煮沸5 min。随后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯 酰 胺 凝 胶 电 泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离蛋白（浓缩胶80 V，分离胶120 V），随后采用湿转法300 mA转膜90 min。将膜取出后，加入脱脂牛奶封闭60 min，用含吐温的Tris缓冲盐溶液（Tris-buffered saline with Tween，TBST）洗膜3次，每次5 min。加入β-actin一抗（1∶1 000稀释）和TAGLN2一抗（1∶1 000稀释），4 ℃摇床孵育过夜。次日回收一抗，用TBST洗膜3次，每次5 min。加入对应二抗，室温摇床孵育60 min，TBST洗膜3次，每次5 min。滴加ECL化学发光显影液，于凝胶成像系统中曝光显影。采用Image J软件分析目的蛋白条带灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/β-actin蛋白条带灰度值。

1.9　统计学分析

采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析。2组bEnd.3细胞中TAGLN2 mRNA及蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　 TAGLN2 shRNA慢病毒载体的构建

经测序鉴定，TAGLN2 shRNA干扰序列成功插入载体质粒，且与设计序列完全一致，无碱基缺失或错配。表明实验成功构建GV493-TAGLN2慢病毒载体。见图1。

2.2　 TAGLN2 shRNA慢病毒滴度测定

按 “1.5”步骤中方法操作，依次进行病毒梯度稀释和分组转染。转染后测定结果显示：GV493对照慢病毒的滴度为5×10¹¹ TU·L^-1，GV493-TAGLN2-shRNA慢病毒滴度为6×10¹¹ TU·L^-1。见图2。

2.3　2组慢病毒稳定转染bEnd.3细胞系建立

将GV493对照慢病毒和GV494-TAGLN2-shRNA慢病毒分别转染bEnd.3细胞，荧光显微镜结果显示：GV493对照组和GV493-TAGLN2-shRNA组细胞中均出现较强的GFP荧光表达。见图3。

2.4　2组bEnd.3细胞中TAGLN2 mRNA表达水平

GV493对照组细胞中TAGLN2 mRNA表达水平为1.02±0.24，GV493-TAGLN2-shRNA组细胞中TAGLN2 mRNA表达水平为0.18±0.13。与GV493对照组比较，GV493-TAGLN2-shRNA组细胞中TAGLN2 mRNA表达水平明显降低（P<0.01），TAGLN2基因沉默效率为82.4%。

2.5　2组bEnd.3细胞中TAGLN2蛋白表达水平

GV493对照组细胞中TAGLN2蛋白表达水平为1.00±0.19，GV493-TAGLN2-shRNA组细胞中TAGLN2蛋白表达水平为0.26±0.19。与GV493对照组比较，GV493-TAGLN2-shRNA组细胞中TAGLN2蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。见图4。

3 讨 论

ICAS是一种严重威胁脑血管健康的慢性疾病，是全球范围内缺血性卒中的核心致病因素。ICAS病理演变过程涉及多重病理生理机制，包括血管内皮功能失调、持续炎症反应、氧化应激失衡及细胞程序性死亡等环节，这些过程相互交织，共同驱动疾病的进展^［13］。ICAS与血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）之间存在紧密的病理关联。在ICAS进展中，血管内皮细胞功能受损，细胞间紧密连接结构遭到破坏，导致BBB通透性增加，屏障功能削弱。这使得血液循环中的大分子物质、炎性介质和免疫活性细胞得以透过BBB异常渗透至脑实质，引发级联神经炎症反应，并最终导致神经元结构与功能的不可逆损伤^［14］。

TAGLN2在心血管方面的作用也有相关报道。研究^［15］表明：TAGLN2可通过磷酸化肌球蛋白轻链相关机制参与洛伐他汀诱导的内皮细胞抗血管生成作用，为理解血管生成提供了新的途径。研究^［16］显 示： 微 小 RNA-133a （micro RNA-133a，miR-133a）直接与TAGLN2 mRNA的3'非翻译区（3'-untranslated region，3'-UTR）结合，并在转录和翻译水平抑制其表达；通过TAGLN2敲除揭示其通过Caspase-8凋亡途径调节缺氧诱导的细胞凋亡。临床研究^［17］表明：与健康受试者比较，急性冠状动脉综合征患者血小板中TAGLN2水平升高2倍以上。近期组学分析研究^［18］还确定了TAGLN2是早期脑卒中复发相关的蛋白质标志物之一。

bEnd.3细胞是构建体外BBB模型的常用细胞，可用于模拟BBB在不同病理状态下的变化，从而探讨相关因素对其通透性的影响及机制^［19-20］。目前，TAGLN2在bEnd.3细胞中未有缺血和缺氧疾病模型的构建及相关报道，故本实验选用bEnd.3细胞进行慢病毒感染及后续观测。

本研究测序结果证实了GV493-TAGLN2慢病毒表达载体的成功构建。感染bEnd.3细胞后，荧光显微镜下可见明显荧光信号。RT-qPCR法和Western blotting法结果显示：与GV493对照组比较，GV493-TAGLN2-shRNA组bEnd.3细胞中TAGLN2 mRNA和蛋白表达水平均明显降低，提示所构建的慢病毒干扰载体可对TAGLN2实现高效的靶向干扰作用。

综上所述，本研究成功构建了GV493-TAGLN2-shRNA慢病毒载体，建立了稳定低表达TAGLN2的bEnd.3细胞模型，为后续深入探讨TAGLN2在ICAS中的作用机制和潜在治疗靶点提供了实验基础。

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基金资助

国家自然科学基金项目(81571157)

广东省卫健委医学科研基金项目(A2022139)

广东省卫健委医学科研基金项目(A2023193)

广东省湛江市科技局科技攻关计划项目(2021B01370)

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