葛根来源外泌体样纳米囊泡对D-半乳糖诱导L929小鼠成纤维细胞衰老的改善作用及其机制

Ameliorative effect of Pueraria lobata-derived exosome-like nanovesicles on D-galactose-induced senescence in L929 mouse fibroblasts and its mechanism

摘要

目的 探讨葛根来源外泌体样纳米囊泡（PL-ELNs）对D-半乳糖（D-gal）诱导的L929小鼠成纤维细胞衰老的影响，阐明其可能的作用机制。 方法 采用差速离心结合蔗糖密度梯度离心从葛根中提取PL-ELNs，采用透射电镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和试剂盒分别对其进行形态观察、粒径鉴定和蛋白浓度定量。将L929细胞分为对照组、D-gal组和4、8及16 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal组，采用PKH26标记的PL-ELNs处理L929细胞，观察L929细胞对PL-ELNs的摄取情况。使用D-gal诱导构建L929细胞衰老模型，采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法筛选D-gal和PL-ELNs最佳作用浓度并检测各组细胞活性，β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色观察各组L929细胞染色情况并计算SA-β-gal染色阳性细胞百分率。采用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）染色检测各组L929细胞增殖活性，流式细胞术检测各组细胞内活性氧（ROS）水平和细胞凋亡率，Western blotting法检测各组L929细胞中Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ）、Ⅲ型胶原蛋白（ColⅢ）、P21和P16蛋白表达水平。 结果 从葛根中分离出茶托样形态、中位粒径为142.3 nm的PL-ELNs，并可被L929细胞有效摄取。20 g·L^-1 D-gal可以成功诱导L929细胞衰老。CCK-8法，与对照组比较，D-gal组L929细胞活性明显降低（P<0.01）；与D-gal组比较，4、8和16 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal组L929细胞活性明显升高（P<0.01）。SA-β-gal染色，与对照组比较，D-gal组L929细胞中SA-β-gal染色阳性细胞百分率明显升高（P<0.01）；与D-gal组比较，4、8和16 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal组L929细胞中SA-β-gal染色阳性细胞百分率均明显降低（P<0.05或P<0.01）。Western blotting法，与对照组比较，D-gal组L929细胞中P21和P16蛋白表达水平明显升高（P<0.01）；与D-gal组比较，8和16 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal组L929细胞中P21和P16蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01）。EdU染色，与对照组比较，D-gal组L929细胞增殖活性明显降低（P<0.01）；与D-gal组比较，4、8和16 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal组L929细胞增殖活性均明显升高（P<0.05或P<0.01）。流式细胞术，与对照组比较，D-gal组L929细胞中ROS水平明显升高（P<0.01）；与D-gal组比较，8和16 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal组L929细胞中ROS水平明显降低（P<0.05或P<0.01）。与对照组比较，D-gal组L929细胞凋亡率明显升高（P<0.01），4、8和16 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal组L929细胞凋亡率均明显降低（P<0.01）。Western blotting法，与对照组比较，D-gal组L929细胞中ColⅠ和ColⅢ蛋白表达水平明显降低（P<0.01）；与D-gal组比较，8和16 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal组L929细胞中ColⅠ和ColⅢ蛋白表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01）。 结论 PL-ELNs可改善D-gal诱导的L929细胞衰老，其机制可能与提高衰老细胞的增殖活性、减少细胞凋亡、降低细胞中ROS水平及P21和P16蛋白表达水平有关。

Abstract

Objective To discuss the effect of Pueraria lobata-derived exosome-like nanovesicles （PL-ELNs） on senescence of L929 mouse fibroblasts induced by D-galactose （D-gal）， and to clarify the possible mechanism of action. Methods The PL-ELNs were extracted from Pueraria lobata by differential centrifugation combined with sucrose density gradient centrifugation. Transmission electron microscope （TEM） was used to observe the morphology of PL-ELNs； nanoparticle tracking analysis （NTA） was used to identify the particle size of PL-ELNs； kit method was used to quantify the protein concentration of PL-ELNs. The L929 cells were divided into control group， D-gal group， and 4， 8 and 16 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal groups. The PKH26-labeled PL-ELNs were used to treat the L929 cells， and the uptake of PL-ELNs by L929 cells was observed. D-gal was used to establish the senescence model of L929 cells. CCK-8 method was used to screen the optimal concentrations of D-gal and PL-ELNs and to detect the activities of the cells in various groups； SA-β-gal staining was used to observe the staining of L929 cells in various groups and to calculate the percentage of SA-β-gal staining positive cells. EdU staining was used to detect the percentages of EdU positive cells in L929 cells in various groups； flow cytometry was used to detect the intracellular reactive oxygen species （ROS） levels and apoptotic rates of L929 cells in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of collagen type Ⅰ （ColⅠ）， collagen type Ⅲ （ColⅢ）， P21 and P16 proteins in L929 cells in various groups. Results The PL-ELNs with a saucer-like morphology and a median particle size of 142.3 nm were isolated from Pueraria lobata， and could be effectively taken up by L929 cells. D-gal at 20 g·L⁻¹ successfully induced senescence of L929 cells. The CCK-8 assay results showed that compared with control group， the activity of L929 cells in D-gal group was significantly decreased （P<0.01）； compared with D-gal group， the activities of L929 cells in 4， 8 and 16 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal groups were significantly increased （P<0.01）. The SA-β-gal staining results showed that compared with control group， the percentage of SA-β-gal staining positive L929 cells in D-gal group was significantly increased （P<0.01）； compared with D-gal group， the percentages of SA-β-gal staining positive L929 cells in 4， 8 and 16 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal groups were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）. The Western blotting results showed that compared with control group， the expression levels of P21 and P16 proteins in L929 cells in D-gal group were significantly increased （P<0.01）； compared with D-gal group， the expression levels of P21 and P16 proteins in L929 cells in 8 and 16 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal groups were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）. The EdU staining results showed that compared with control group， the percentage of EdU positive L929 cells in D-gal group was significantly decreased （P<0.01）； compared with D-gal group， the percentages of EdU positive L929 cells in 4， 8 and 16 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal groups were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. The flow cytometry results showed that compared with control group， the ROS levels in L929 cells in D-gal group was significantly increased （P<0.01）； compared with D-gal group， the ROS levels in L929 cells in 8 and 16 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal groups were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）. Compared with control group， the apoptotic rate of L929 cells in D-gal group was significantly increased （P<0.01）； compared with D-gal group， the apoptotic rates of L929 cells in 4， 8 and 16 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal groups were significantly decreased （P<0.01）. The Western blotting results showed that compared with control group， the expression levels of ColⅠ and ColⅢ proteins in L929 cells in D-gal group were significantly decreased （P<0.01）； compared with D-gal group， the expression levels of ColⅠ and ColⅢ proteins in L929 cells in 8 and 16 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal groups were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion PL-ELNs can ameliorate D-gal-induced senescence of L929 cells， and the mechanism may be related to increasing the proliferation activity of senescent cells， reducing apoptosis， and decreasing the ROS level and the expression levels of P21 and P16 proteins in the cells.

Graphical abstract

关键词

葛根 / 外泌体 / 纳米囊泡 / 细胞衰老 / D-半乳糖 / L929细胞

Key words

Pueraria lobata / Exosome / Nanovesicle / Cell senescence / D-galactose / L929 cells

盆底功能障碍性疾病（pelvic floor dysfunction，PFD）是一系列影响女性生活质量的常见疾病，主要包括压力性尿失禁、盆腔器官脱垂、大便失禁和盆会阴区疼痛综合征，严重损害患者的生活质量和心理健康，在全球范围内造成沉重的疾病负担^［1］。PFD发病与年龄增长存在明显关联，尤其在绝经后女性中其发病率急剧升高，提示盆底支持组织衰老是PFD发生发展的核心病理基础之一^［1-3］。成纤维细胞是盆底结缔组织中的主要细胞成分，可分泌胶原蛋白、弹性蛋白和糖蛋白，这些是细胞外基质（extracellular matrix，ECM）组成和重塑不可或缺的一部分，对维持盆底支撑结构的弹性和强度至关重要^［4-6］。随着年龄增长，盆底组织中的成纤维细胞功能减退，ECM合成减少、降解增加，导致支撑结构薄弱，最终引发PFD^［6］。因此，深入研究延缓盆底成纤维细胞衰老、促进功能恢复的作用机制，对于开发PFD的防治策略具有重要意义。

植物源性外泌体样纳米囊泡（plant-derived exosome-like nanovesicles，PELNs）源自真核植物细胞中的多囊体，具有典型的脂质双分子层膜，其天然携带的生物活性物质，如DNA、微小RNA（microRNA，miRNA）、蛋白质和脂质等，能够被哺乳动物细胞有效摄取，并调控受体细胞的生理状态^［7］。PELNs因其天然来源、低免疫原性、优良稳定性和高效的跨膜递送能力，在疾病治疗领域展现出广阔的应用前景^［8-10］。芦荟^［11］和人参^［12］衍生的PELNs可以减轻皮肤光老化和氧化应激损伤；桑树皮来源的PELNs能够预防小鼠结肠炎的发生^［13］；羽衣甘蓝来源的PELNs则可促进人真皮成纤维细胞胶原蛋白合成^［14］。PELNs在抗氧化、抗炎、抗衰老和组织修复方面具有显著功能，为其在PFD中的应用提供了潜在可能。葛根是一种药食同源的草本植物，富含葛根素和大豆苷元等异黄酮类活性成分，具有抗炎、抗氧化^［15］、促进组织修复^［16］和雌激素样作用^［17］等多种生物活性。研究^{［15，18-19］}显示：葛根素可以延缓人真皮成纤维细胞衰老和乳腺衰老，并在小鼠结肠炎模型中发挥抗炎及抗氧化效应。本课题组前期研究^［20］表明：葛根素可以通过延缓ECM降解而对PFD发挥保护作用。近年来，葛根来源的外泌体样纳米囊泡（Puerarialobata-derived exosome-like nanovesicles，PL-ELNs）已被成功提取，并证实其可通过调节巨噬细胞极化抑制炎症^［21］，并通过增强细胞自噬以缓解骨质疏松^［22］等。因此，葛根素的多种生物活性和PL-ELNs在多种疾病模型中所表现出调控功能，提示PL-ELNs在延缓细胞衰老方面可能具有独特价值。然而，其在盆底组织细胞衰老及PFD防治方面的潜能尚未被探索，亟待深入研究。

本研究利用D-半乳糖（D-galactose，D-gal）构建L929细胞衰老模型，模拟PFD中细胞衰老状态，进而通过体外干预实验探讨PL-ELNs对衰老L929细胞功能的改善作用，为PFD的防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1　细胞、主要试剂和仪器

L929细胞购自武汉普 诺 赛 生 命 科 技 有 限 公 司。磷 酸 盐 缓 冲 液（phosphate buffered saline，PBS）、0.25%胰蛋白酶和最低基本培养基（minimum essential medium，MEM）购自武汉普诺赛生命科技有限公司，D-gal购自国药集团化学试剂有限公司，外泌体荧光标记试剂盒（PKH26，红色）购自多莱泌生物科技（武汉）有限公司，细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8，CCK-8）试剂盒购自亚科因（武汉）生物技术有限公司，Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒购自武汉Elabscience公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒、活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒和BeyoClick^TM 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）-555细胞增殖检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公 司， 衰 老 相 关 β-半 乳 糖 苷 酶 （senescence-associated-β galactosidase，SA-β-gal） 染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，Ⅰ型胶原蛋白（type Ⅰ collagen，ColⅠ）、Ⅲ型胶原蛋白（type Ⅲ collagen，ColⅢ）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体购自美国Proteintech公司，P21和P16抗体购自武汉ABclonal公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美 国 Gibco 公 司，聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）凝胶快速制备试剂盒购自上海翊圣生物公司。酶标仪购自美国PerkinElmer公司，CytoFLEX型流式细胞仪、超速离心机和超速离心管购自美国Beckman Coulter公司，ChemiDoc^TM Touch购自美国Bio-Rad公司，激光共聚焦扫描显微镜和正置显微镜购自日本Olympus公司，透射电子显微镜（transmission electron microscope， TEM） 购自日本Hitachi公司。

1.2　PL-ELNs的提取

葛根采集自中国广西地区，将葛根洗净后，与预冷PBS缓冲液按1∶3（W/V）比例混合，放入匀浆机中匀浆，匀浆液4 ℃静置过夜后使用双层医用纱布过滤，滤液再依次经3 000 g、30 min和10 000 g、60 min进行离心，每次离心后保留上清液，上清液再经0.22 μm滤膜过滤，随后对滤液以150 000 g、120 min进行超速离心。弃去上清液，用PBS缓冲液重悬沉淀，继续用蔗糖密度梯度离心法分离纯化，依次向离心管中加入质量分数为60%、45%、30%和8%的蔗糖溶液，最后缓慢加入重悬液于8%蔗糖溶液上层，150 000 g离心120 min，收集30%与45%蔗糖层之间的条带，与PBS缓冲液混合后再次以150 000 g离心120 min去除蔗糖，最终将沉淀重悬于PBS缓冲液中，获得PL-ELNs。

1.3　PL-ELNs鉴定

对PL-ELNs样品进行稀释，采用TEM观察PL-ELNs的形态特征，通过纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）技术测定悬液中PL-ELNs的粒径分布和颗粒浓度，对PL-ELNs进行鉴定。为便于后续实验的定量标化，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测PL-ELNs的总蛋白浓度。

1.4　细胞培养、分组和处理

L929细胞培养于含10% FBS的MEM培养基中，置于37 ℃、5% CO₂培养箱内培养，当细胞密度达到80%以上时进行细胞传代。将处于对数生长期的L929细胞分为对照组、D-gal组和PL-ELNs+D-gal组。对照组给予含10% FBS的MEM完全培养基；D-gal组给予20 g·L^-1 D-gal处理48 h；PL-ELNs+D-gal组分别给予4、8和16 mg·L^-1 PL-ELNs处理细胞12 h后，再加入20 g·L^-1 D-gal处理48 h。

1.5　采用外泌体荧光标记试剂盒检测L929细胞对PL-ELNs的摄取

按照外泌体荧光标记试剂盒说明书配置PKH26染色工作液，再将PL-ELNs与PKH26染色工作液充分混匀后室温避光孵育10 min，120 000 g离心90 min除去游离的工作液，将沉淀重悬于PBS缓冲液中。取处于对数生长期的L929细胞与10 mg·L^-1 PKH26标记的PL-ELNs共培养12 h。使用488-鬼笔环肽（488-phalloidin）和Hoechst 33342分别对细胞骨架与细胞核进行染色，用激光共聚焦扫描显微镜采集图像。在荧光显微镜下，PL-ELNs为红色，细胞骨架为绿色，细胞核为蓝色，其中红色荧光位于细胞骨架绿色荧光内，即表明PL-ELNs被L929细胞成功摄取。

1.6　CCK-8法筛选D-gal和PL-ELNs最佳作用浓度并检测各组细胞活性

为确定D-gal最佳衰老造模浓度，将L929细胞接种于96孔细胞培养板，当细胞达到对数生长期时，分别加入0、10、20、30、40、50和60 g·L^-1 D-gal共同孵育48 h；为确定PL-ELNs对L929细胞活性的影响，向处于对数生长期的细胞分别加入0、1、2、4、8、16和32 mg·L^-1 PL-ELNs共同孵育48 h；为确定PL-ELNs抗衰老的最佳作用浓度，向处于对数生长期的细胞分别加入0、1、2、4、8、16和32 mg·L^-1 PL-ELNs处理12 h后再加入D-gal处理48 h。在各种处理结束后，每孔加入100 μL 含10% CCK-8的MEM溶液，孵育0.5~2.0 h后采用酶标仪于波长450 nm处检测吸光度（A）值，计算各组细胞活性。细胞活性＝（给药孔A值-空白孔A值）/（对照孔A值-空白孔A值）×100%。

1.7　Western blotting法检测各组L929细胞中P21、P16、ColⅠ和ColⅢ蛋白表达水平

按照“1.4”中的方法对细胞进行处理，之后加入RIPA裂解液提取总蛋白。使用BCA试剂盒测定各样本蛋白浓度，取等量蛋白通过10%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）-PAGE凝胶电泳进行分离，电转印法转膜至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉常温封闭1 h，再用TBST溶液洗膜3次，每次10 min，然后将PVDF膜与稀释的ColⅠ、ColⅢ、P21、P16和GAPDH一抗于4 ℃摇床上孵育过夜，TBST溶液洗膜后，与HRP标记的二抗常温孵育1 h，TBST溶液再次洗膜，最后利用增强化学发光显影液显影，化学发光系统成像拍照，采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，并计算ColⅠ、ColⅢ、P21和P16蛋白表达水平。目的蛋白表达水平＝目的蛋白条带灰度值／GAPDH蛋白条带灰度值。

1.8　SA-β-gal染色法观察各组L929细胞染色情况并计算SA-β-gal染色阳性细胞百分率

根据“1.4”中的方法处理细胞后，使用PBS缓冲液清洗1次，每孔加入1 mL固定液室温固定15 min，PBS缓冲液清洗3次，按照SA-β-gal试剂盒说明书配制染色工作液，每孔加入1 mL染色液，在37 ℃恒温箱中避光孵育过夜，在正置荧光显微镜下采集图像。在荧光显微镜下，SA-β-gal染色阳性细胞为蓝色。随机选取5个阳性视野计数，计算SA-β-gal染色阳性细胞百分率。SA-β-gal染色阳性细胞百分率=SA-β-gal染色阳性细胞/总细胞数×100%。

1.9　EdU染色检测各组L929细胞增殖活性

按照“1.4”中的方法处理细胞，加入2×EdU工作液（20 μmol·L^-1），培养2 h。去除培养液，加入1 mL 固定液室温固定15 min。去除固定液，洗涤细胞3次，每孔用1 mL含0.3% Triton X-100的PBS缓冲液通透15 min。 去除通透液，洗涤细胞2次，每孔加入0.5 mL的Click反应液，室温避光孵育30 min。去除Click反应液，洗涤3次，每孔加入1 mL Hoechst 33342溶液，室温避光孵育10 min，洗涤3次，采用正置荧光显微镜采集图像。在荧光显微镜下，EdU标记的阳性细胞为红色。随机选取5个阳性视野计数，计算EdU阳性细胞率。EdU阳性细胞率=EdU阳性细胞数/总细胞数×100%，以EdU阳性细胞率代表细胞增殖活性。

1.10　流式细胞术检测各组L929细胞中ROS水平和细胞凋亡率

收集处理后的L929细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后，于1 000 r·min^-1离心5 min，弃去上清。随后按1∶1 000比例稀释DCFH-DA工作液，每管加入1 mL稀释后的DCFH-DA染液重悬细胞沉淀，37 ℃避光孵育20 min。孵育结束后离心弃去上清，使用PBS缓冲液重悬细胞并再次离心清洗，最终以1 mL PBS缓冲液重悬细胞沉淀，采用流式细胞术检测细胞内ROS水平。细胞凋亡检测样品以相同方式处理并收集。每管细胞沉淀使用500 μL稀释的1×Annexin Ⅴ Binding Buffer重悬，分别加入5 μL Annexin Ⅴ-APC Reagent和5 μL 7-AAD Reagent（100 mg·L^-1），轻轻混匀后于室温避光孵育20 min，孵育结束后立即采用流式细胞术检测细胞凋亡水平。左下象限为未发生凋亡的细胞；右下象限为早期凋亡细胞；右上象限为晚期凋亡细胞；左上象限为坏死细胞。细胞凋亡率=（早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数）/细胞总数×100%。

1.11　统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0软件对数据进行统计学分析并绘制统计图。各组L929细胞活性，细胞中ColⅠ、ColⅢ、P21和P16蛋白表达水平，SA-β-gal染色阳性细胞百分率、细胞增殖活性，细胞中ROS水平和细胞凋亡率等计量资料经正态性检验均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　PL-ELNs的鉴定

TEM观察到从葛根中提取的囊泡呈现典型的双层膜囊泡状结构。见图1。NTA测定其囊泡浓度为8.3×10¹² mL^-1，中位粒径为142.3 nm。见图2。PL-ELNs悬液总蛋白浓度为（2.40±0.28） g·L^-1。

2.2　L929细胞对PL-ELNs的摄取

将L929细胞与10 mg·L^－1 PKH26标记的PL-ELNs共同孵育12 h后，荧光共聚焦显微镜观察发现L929细胞骨架中存在红色荧光标记（图3），提示L929细胞可摄入PL-ELNs。

2.3　D-gal诱导L929细胞衰老的最佳浓度

与0 g·L^-1 D-gal组比较，10、20、30、40、50和60 g·L^-1 D-gal组L929细胞活性均明显降低（P<0.01），其中，20 g·L^-1 D-gal组L929细胞活性最接近50%（P<0.01）。见图4。SA-β-gal染色结果显示：与0 g·L^-1 D-gal组（30.95%±2.68%）比较，20 g·L^-1 D-gal组细胞中SA-β-gal染色阳性细胞百分率（70.96%±3.79%）明显升高（P<0.01）。提示20 g·L^-1 D-gal可以成功诱导L929细胞衰老。见图5。

2.4　PL-ELNs作用于衰老L929细胞的最佳浓度

与0 mg·L^-1 PL-ELNs比较，0、1、2、4、8、16和32 mg·L^-1 PL-ELNs作用下L929细胞活性差异均无统计学意义（P>0.05）。见图6。

进一步通过D-gal诱导的衰老细胞模型筛选PL-ELNs的有效作用浓度。与对照组比较，D-gal组L929细胞活性明显降低（P<0.01）；与D-gal组比较，4、8和16 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal组L929细胞活性明显升高（P<0.01），1、2和32 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal组L929细胞活性差异无统计学意义（P>0.05）。见图7。基于以上结果，最终选取4、8和16 mg·L^-1 PL-ELNs为后续实验的作用浓度。

2.5　各组L929细胞中SA-β-gal染色阳性细胞百分率

与对照组比较，D-gal组L929细胞中SA-β-gal染色阳性细胞百分率明显升高（P<0.01）；与D-gal组比较， 4、8 和 16 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal组L929细胞中SA-β-gal染色阳性细胞百分率均明显降低（P<0.05或P<0.01）。见图8和9。

2.6　各组L929细胞中P21和P16蛋白表达水平

与对照组比较，D-gal组细胞中P21和P16蛋白表达水平明显升高（P<0.01）；与D-gal组比较，8和16 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal组L929细胞中P21和P16蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01），4 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal组L929细胞P21和P16蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。见图10。

2.7　各组L929细胞增殖活性

与对照组比较，D-gal组L929细胞增殖活性明显降低（P<0.01）；与 D-gal 组 比 较， 4、8 和 16 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal组L929细胞增殖活性均明显升高（P<0.05或P<0.01）。见图11和12。

2.8　各组L929细胞中ROS水平

与对照组比较，D-gal组L929细胞中ROS水平明显升高（P<0.01）；与 D-gal 组 比 较，4 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal 组L929细胞中ROS水平差异无统计学意义（P>0.05），8 和 16 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal 组 细 胞中 ROS 水 平 明 显 降 低 （P<0.05或P<0.01）。见图13。

2.9　各组L929细胞凋亡率

与对照组比较，D-gal组L929细胞凋亡率明显升高（P<0.01），4、8和16 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal组L929细胞凋亡率均明显降低（P<0.01）。见图14和15。

2.10　各组L929细胞中ColⅠ和ColⅢ蛋白表达水平

与对照组比较，D-gal组L929细胞中ColⅠ和ColⅢ蛋白表达水平明显降低（P<0.01）；与D-gal组比较，4 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal组L929细胞中ColⅠ和ColⅢ蛋白表达水平差异均无统计学意义（P>0.05），8 和16 mg·L^-1 PL-ELNs+D-gal组L929细胞中ColⅠ和ColⅢ蛋白表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01）。提示PL-ELNs预处理可以改善衰老L929细胞ECM合成能力。见图16。

3 讨 论

盆底组织细胞衰老是推动PFD发生发展的重要机制之一^［1-3］。该过程以成纤维细胞不可逆的生长停滞为核心特征，伴随ECM稳态失衡^［6］。同时，衰老成纤维细胞分泌多种衰老相关分泌表型因子，如基质金属蛋白酶和促炎细胞因子，进一步加剧ECM降解并引发局部慢性炎症，抑制组织再生修复能力，促进PFD发展^［23］。本研究旨在探讨PL-ELNs对PFD相关L929细胞衰老的潜在保护作用。本研究结果显示：PL-ELNs可改善D-gal诱导的L929细胞衰老，为PL-ELNs应用于PFD的防治提供重要的实验依据。

传统外泌体的研究主要集中于哺乳动物细胞来源的外泌体，随着纳米技术的进步，更多的注意力转向植物中外泌体的存在及其功能。PELNs已被证实具有与哺乳动物来源外泌体相似的结构和功能，具有更加卓越的生物相容性、低免疫原性和稳定性^［7］及抗炎^［24］、抗氧化^［25］、抗肿瘤^［26］和抗病毒^［27］等多种作用。葛根是一种传统药用植物，富含葛根素等活性成分，葛根素可以缓解真皮成纤维细胞中与衰老相关的功能缺陷^［18］，通过调节肠道菌群和抑制P38/丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路延缓乳腺衰老^［19］，提示PL-ELNs可能也具有抗衰老活性。本研究通过差速离心与蔗糖密度梯度离心相结合的方法，成功从葛根中分离出PL-ELNs。TEM和NTA分析结果显示：提取物具有典型的囊泡形态及适宜的粒径分布（110~150 nm），符合PELNs的基本特征，表明所提取的是葛根来源的外泌体样纳米囊泡。PELNs在跨界通讯中的重要性源于其携带的多样化生物活性成分（包括蛋白质、脂质、核酸和次级代谢物）及其能被哺乳动物细胞高效内化的特性^［7］。本研究通过将PKH26标记的PL-ELNs与L929细胞共孵育，观察到PL-ELNs可被L929细胞有效摄取，提示PL-ELNs所携带的生物活性成分得以进入细胞内部，从而能够直接调控细胞功能，为后续观察到的系列生物学效应提供必要的结构基础。在确认PL-ELNs可被有效摄取的基础上，良好的生物相容性是进一步开展功能学研究的另一重要前提。为此，本研究通过CCK-8实验对PL-ELNs的生物相容性进行了评估，结果显示：1~32 mg·L^-1 PL-ELNs对L929细胞无显著毒性，具有良好的生物相容性。为该浓度范围内PL-ELNs后续功能研究的可靠性提供了关键保障。

鉴于细胞衰老在PFD发生发展中作为重要病理环节，本研究评估了PL-ELNs对D-gal诱导的L929细胞衰老的影响。SA-β-gal染色结果显示：PL-ELNs处理显著降低了SA-β-gal染色阳性细胞百分率；PL-ELNs能显著下调P21和P16关键细胞周期抑制因子的蛋白表达。SA-β-gal染色阳性细胞百分率的降低和衰老标志物P21和P16的下调，共同提示PL-ELNs能够有效缓解细胞衰老。P21作为DNA损伤应答通路的核心效应因子，其下调提示PL-ELNs可能通过缓解基因组应激、干预P53/P21信号轴介导的衰老进程来改善细胞状态；而P16作为细胞衰老的核心调控蛋白，其表达下降则反映了PL-ELNs对P16/视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，Rb）通路所驱动的持续性细胞周期阻滞具有逆转作用^［28］。这2个关键衰老标志物的同步下调，从分子层面证实了PL-ELNs对细胞衰老核心调控网络的有效干预。

在明确PL-ELNs的抗衰老效应基础上，本研究进一步探讨了PL-ELNs可能的作用机制。本研究结果显示：PL-ELNs能够从多方面改善衰老L929细胞的功能状态，具体表现为促进细胞增殖活性，缓解氧化应激并抑制细胞凋亡，相关效应共同构成了其改善衰老L929细胞功能的重要途径。ROS的过度积累会破坏氧化还原稳态，并引起大分子损伤，尤其是在DNA和线粒体内，从而激活应激响应信号通路，促使细胞周期停滞和衰老发生^［29-30］。鉴于氧化应激是诱导细胞衰老的核心因素，PL-ELNs抑制ROS生成这一效应为其抗衰老作用提供了重要的机制解释。与此同时，PL-ELNs促进的增殖活性提升和凋亡率下降，进一步表明其在维持细胞稳态中的多重保护作用。在PFD的发生发展中，盆底支撑结构中ECM的降解和胶原流失是导致组织力学性能下降的关键原因^［6］。本研究结果显示：PL-ELNs除具有上述作用之外，还显著促进了ColⅠ和ColⅢ蛋白表达，提示PL-ELNs在缓解L929细胞衰老后，其胶原合成功能得到了极大的改善，PL-ELNs具备修复ECM结构和功能的潜力，有望从组织层面改善盆底支撑力。

综上所述，PL-ELNs能够有效延缓D-gal诱导的L929细胞衰老，其作用机制主要涉及对P21和P16等关键衰老调控因子的下调，并与氧化应激的缓解、细胞增殖的促进及凋亡的抑制有关。相关发现从分子及细胞层面揭示了PL-ELNs的多靶点抗衰老特性，为开发基于PL-ELNs的PFD防治策略提供了新的实验依据和思路。

参考文献

[1] PEINADO-MOLINA R A， HERNÁNDEZ-MARTÍNEZ A， MARTÍNEZ-VÁZQUEZ S， et al. Pelvic floor dysfunction： prevalence and associated factors［J］. BMC Public Health， 2023， 23（1）： 2005.

[2] MANNELLA P， PALLA G， BELLINI M， et al. The female pelvic floor through midlife and aging［J］. Maturitas， 2013， 76（3）： 230-234.

[3] DOUMOUCHTSIS S K， CHRYSANTHOPOULOU E L. Urogenital consequences in ageing women［J］. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol， 2013， 27（5）： 699-714.

[4] MENACHEM-ZIDON OBEN， REUBINOFF B， SHVEIKY D. Transplantation of mesenchymal stem cells derived from old rats improves healing and biomechanical properties of vaginal tissue following surgical incision in aged rats［J］. Int J Mol Sci， 2024， 25（11）： 5714.

[5] PETROS P E. Re： Alterations in connective tissue metabolism in stress incontinence and prolapse［J］. J Urol， 2012， 187（6）： 2281.

[6] FANG C Y， ZENG Z T， YE J S， et al. Progress of mesenchymal stem cells affecting extracellular matrix metabolism in the treatment of female stress urinary incontinence［J］. Stem Cell Res Ther， 2025， 16（1）： 95.

[7] ZHAO B， LIN H J， JIANG X C， et al. Exosome-like nanoparticles derived from fruits， vegetables， and herbs： innovative strategies of therapeutic and drug delivery［J］. Theranostics， 2024， 14（12）： 4598-4621.

[8] CAO M， DIAO N N， CAI X L， et al. Plant exosome nanovesicles （PENs）： green delivery platforms［J］. Mater Horiz， 2023， 10（10）： 3879-3894.

[9] FENG H， YUE Y， ZHANG Y， et al. Plant-derived exosome-like nanoparticles： emerging nanosystems for enhanced tissue engineering［J］. Int J Nanomedicine， 2024， 19： 1189-1204.

[10] KALLURI R， LEBLEU V S. The biology， function， and biomedical applications of exosomes［J］. Science， 2020， 367（6478）： eaau6977.

[11] SUN Z X， ZHENG Y Z， WANG T R， et al. Aloe vera gel and rind-derived nanoparticles mitigate skin photoaging via activation of Nrf2/ARE pathway［J］. Int J Nanomedicine， 2025， 20： 4051-4067.

[12] CHOI W， CHO J H， PARK S H， et al. Ginseng root-derived exosome-like nanoparticles protect skin from UV irradiation and oxidative stress by suppressing activator protein-1 signaling and limiting the generation of reactive oxygen species［J］. J Ginseng Res， 2024， 48（2）： 211-219.

[13] SRIWASTVA M K， DENG Z B， WANG B M， et al. Exosome-like nanoparticles from Mulberry bark prevent DSS-induced colitis via the AhR/COPS8 pathway［J］. EMBO Rep， 2022， 23（3）： e53365.

[14] HSU P， KAMIJYO Y， KOIKE E， et al. Exosome-like nanovesicles derived from kale juice enhance collagen production by downregulating Smad7 in human skin fibroblasts［J］. Front Nutr， 2025， 12： 1486572.

[15] JEON Y D， LEE J H， LEE Y M， et al. Puerarin inhibits inflammation and oxidative stress in dextran sulfate sodium-induced colitis mice model［J］. Biomedecine Pharmacother， 2020， 124： 109847.

[16] TIYASATKULKOVIT W， MALAIVIJITNOND S， CHAROENPHANDHU N， et al. Pueraria mirifica extract and puerarin enhance proliferation and expression of alkaline phosphatase and type Ⅰ collagen in primary baboon osteoblasts［J］. Phytomedicine， 2014， 21（12）： 1498-1503.

[17] KIM M， KIM H S， OH J， et al. Ameliorative effects of Kyung-Ok-Ko and its mixture with Pueraria lobata Ohwi on postmenopausal osteoporosis by promoting phytoestrogenic activity in rats［J］. Front Nutr， 2023， 10： 1171346.

[18] KAMIYA Y， ODAMA M， MIZUGUTI A， et al. Puerarin blocks the aging phenotype in human dermal fibroblasts［J］. PLoS One， 2021， 16（4）： e0249367.

[19] LIU S， HU H J， ZHANG M， et al. Puerarin delays mammary gland aging by regulating gut microbiota and inhibiting the p38MAPK signaling pathway［J］. J Agric Food Chem， 2024， 72（19）： 10879-10896.

[20] LI Y， HONG L， LIU C， et al. Effect of puerarin on collagen metabolism of fibroblasts in pelvic tissue of women with pelvic organ prolapse［J］. Mol Med Rep， 2018， 17（2）： 2705-2711.

[21] LU Y， XU J， TANG R， et al. Edible pueraria Lobata-derived exosome-like nanovesicles ameliorate dextran sulfate sodium-induced colitis associated lung inflammation through modulating macrophage polarization［J］. Biomedecine Pharmacother， 2024， 170： 116098.

[22] ZHAN W Q， DENG M Z， HUANG X Q， et al. Pueraria lobata-derived exosome-like nanovesicles alleviate osteoporosis by enhacning autophagy［J］. J Control Release， 2023， 364： 644-653.

[23] ZHANG J， YU H Y， MAN M Q， et al. Aging in the dermis： Fibroblast senescence and its significance［J］. Aging Cell， 2024， 23（2）： e14054.

[24] WANG B M， ZHUANG X Y， DENG Z B， et al. Targeted drug delivery to intestinal macrophages by bioactive nanovesicles released from grapefruit［J］. Mol Ther， 2014， 22（3）： 522-534.

[25] PERUT F， RONCUZZI L， AVNET S， et al. Strawberry-derived exosome-like nanoparticles prevent oxidative stress in human mesenchymal stromal cells［J］. Biomolecules， 2021， 11（1）： 87.

[26] CHEN Q B， ZU M H， GONG H L， et al. Tea leaf-derived exosome-like nanotherapeutics retard breast tumor growth by pro-apoptosis and microbiota modulation［J］. J Nanobiotechnology， 2023， 21（1）： 6.

[27] HUANG Y， LIU H B， SUN X L， et al. Honeysuckle-derived microRNA2911 directly inhibits varicella-zoster virus replication by targeting IE62 gene［J］. J Neurovirol， 2019， 25（4）： 457-463.

[28] YAN J Y， CHEN S Y， YI Z M， et al. The role of p21 in cellular senescence and aging-related diseases［J］. Mol Cells， 2024， 47（11）： 100113.

[29] STOJANOVIC B， JOVANOVIC I， DIMITRIJEVIC STOJANOVIC M， et al. Oxidative stress-driven cellular senescence： mechanistic crosstalk and therapeutic horizons［J］. Antioxidants （Basel）， 2025， 14（8）： 987.

[30] VON ZGLINICKI T. Oxidative stress and cell senescence as drivers of ageing： Chicken and egg［J］. Ageing Res Rev， 2024， 102： 102558.

基金资助

国家自然科学基金面上项目(82371639)

国家自然科学基金面上项目(82571874)