敲低硒蛋白N1基因对L929细胞衰老的影响及其机制

Effect of selenoprotein N1 gene on senescence of L929 cells and its mechanism

摘要

目的 探讨硒蛋白N1（SEPN1）基因在D-半乳糖（D-gal）诱导的L929细胞衰老中的作用，并阐明其对细胞增殖、氧化应激、内质网应激、线粒体功能和细胞外基质（ECM）合成影响的信号机制。 方法 采用D-gal处理L929细胞建立细胞衰老模型。实验分为对照组和D-gal诱导组（D-gal组），利用小干扰RNA（siRNA）敲低SEPN1基因，分为阴性对照组（si-NC组）和si-SEPN1组。采用β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色法观察各组L929细胞染色情况并计算SA-β-gal阳性细胞百分率，Western blotting法检测各组L929细胞中SEPN1、P21、P16、Ⅰ型胶原蛋白（Col Ⅰ）、Ⅲ型胶原蛋白（Col Ⅲ）、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和C/EBP同源蛋白（CHOP）蛋白表达水平，2'-7'-二氯荧光素二乙酸（DCFH-DA）荧光探针法检测各组细胞中活性氧（ROS）水平，采用试剂盒检测各组细胞线粒体膜电位水平，采用Fluo-4 AM钙离子（Ca²⁺）荧光探针检测各组L929细胞中Ca²⁺水平，5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）染色检测各组L929细胞增殖活性，免疫荧光法检测各组L929细胞中Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白表达水平。 结果 SA-β-gal染色法，与对照组比较，D-gal组L929细胞中SA-β-gal阳性细胞百分率明显升高（P<0.01）；与si-NC组比较，si-SEPN1组SA-β-gal阳性细胞百分率明显升高（P<0.01）。Western blotting法，与对照组比较，D-gal组L929细胞中P21和P16蛋白表达水平明显升高（P<0.01），SEPN1蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。EdU染色，与对照组比较，D-gal组L929细胞增殖活性明显降低（P<0.01）；与si-NC组比较，si-SEPN1组L929细胞增殖活性明显降低（P<0.01）。DCFH-DA荧光探针法，与对照组比较，D-gal组L929细胞中ROS水平明显升高（P<0.01）；与si-NC组比较，si-SEPN1组细胞中ROS水平明显升高（P<0.05）。Western blotting法，与si-NC组比较，si-SEPN1组细胞中SEPN1、Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01），P21、P16、GRP78和CHOP蛋白表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01）。与si-NC组比较，si-SEPN1组细胞线粒体膜电位水平明显降低（P<0.01）；与si-NC组比较，si-SEPN1组细胞中Ca²⁺水平明显升高（P<0.05）。与si-NC组比较，si-SEPN1组L929细胞中Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白表达水平均明显降低（P<0.05或P<0.01）。 结论 敲低SEPN1可促进L929细胞衰老，抑制细胞增殖以及Col Ⅰ和Col Ⅲ合成，其作用机制可能与诱导内质网应激、损伤线粒体功能、Ca²⁺超载和细胞内ROS增加有关。

Abstract

Objective To discuss the role of selenoprotein N1 （SEPN1） gene in D-galactose （D-gal）- induced senescence of L929 cells， and to clarify its signaling mechanism on cell proliferation， oxidative stress， endoplasmic reticulum stress， mitochondrial function， and extracellular matrix synthesis（ECM）. Methods D-gal was used to treat the L929 cells to establish a cell senescence model. The experiment was divided into control group and D-gal-induced group （D-gal group）. Small interfering RNA （siRNA） was used to knock down SEPN1 gene， and the cells were divided into negative control group （si-NC group） and si-SEPN1 group. SA-β-gal staining was used to observe the staining condition of L929 cells in various groups and calculate the percentage of SA-β-gal positive cells； Western blotting method was used to detect the expression levels of SEPN1， P21， P16， collagen type Ⅰ（Col Ⅰ）， collagen type Ⅲ（Col Ⅲ）， glucose-regulated protein 78 （GRP78）， and C/EBP homologous protein （CHOP） proteins in the L929 cells in various groups； 2'-7'- dichlorofluorescein diacetate （DCFH-DA） fluorescent probe method was used to detect the levels of reactive oxygen species （ROS） in the cells in various groups； kits were used to detect the mitochondrial membrane potential levels in the cells in various groups； Fluo-4 AM calcium ion （Ca²⁺） fluorescent probe was used to detect the Ca²⁺ levels in the L929 cells in various groups； 5-ethynyl-2'- deoxyuridine （EdU） staining was used to detect the proliferation activity of L929 cells in various groups； immunofluorescence method was used to detect the expression levels of Col Ⅰ and Col Ⅲ proteins in the L929 cells in various groups. Results The SA-β-gal staining results showed that compared with control group， the percentage of SA-β-gal positive cells in L929 cells in D-gal group was significantly increased （P<0.01）； compared with si-NC group， the percentage of SA-β-gal positive cells in si-SEPN1 group was significantly increased （P<0.01）. The Western blotting method results showed that compared with control group， the expression levels of P21 and P16 proteins in L929 cells in D-gal group were significantly increased （P<0.01）， and the expression level of SEPN1 protein was significantly decreased （P<0.01）. The EdU staining results showed that compared with control group， the proliferation activity of L929 cells in D-gal group was significantly decreased （P<0.01）； compared with si-NC group， the proliferation activity of L929 cells in si-SEPN1 group was significantly decreased （P<0.01）. The DCFH-DA fluorescent probe method results showed that compared with control group， the ROS level in L929 cells in D-gal group was significantly increased （P<0.01）； compared with si-NC group， the ROS level in the cells in si-SEPN1 group was significantly increased （P<0.05）. The Western blotting method results showed that compared with si-NC group， the expression levels of SEPN1， Col Ⅰ and Col Ⅲ proteins in the cells in si-SEPN1 group were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）， and the expression levels of P21， P16， GRP78 and CHOP proteins were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. The mitochondrial membrane potential assay results showed that compared with si-NC group， the level of mitochondrial membrane potential in the cells in si-SEPN1 group was significantly decreased （P<0.01）. The Fluo-4 AM calcium ion fluorescent probe results showed that compared with si-NC group， the Ca²⁺ level in the cells in si-SEPN1 group was significantly increased （P<0.05）. The immunofluorescence method results showed that compared with si-NC group， the expression levels of Col Ⅰ and Col Ⅲ proteins in the L929 cells in si-SEPN1 group were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion Knockdown of SEPN1 can promote senescence of L929 cells， and inhibit cell proliferation and synthesis of Col Ⅰ and Col Ⅲ； its mechanism may be related to induction of endoplasmic reticulum stress， impairment of mitochondrial function， Ca²⁺ overload， and increase of intracellular ROS.

Graphical abstract

关键词

盆底功能障碍性疾病 / 硒蛋白N1 / 细胞衰老 / 内质网应激 / 线粒体功能障碍 / 成纤维细胞

Key words

Pelvic floor dysfunction diseases / Selenoprotein N1 / Cell senescence / Endoplasmic reticulum stress / Mitochondrial dysfunction / Fibroblasts

女性盆腔器官脱垂（pelvic organ prolapse，POP）是一种常见的盆底功能障碍性疾病，其病因在于盆底支持结构薄弱，包括胶原蛋白和结缔组织。该状况由组织退化、创伤和先天发育异常等因素引发，导致盆底支持系统受损，进而造成盆腔器官下降并穿过阴道壁^［1］。研究^［2-3］显示：衰老是POP发生发展的核心风险因素，其严重程度及预后均与衰老进程密切相关，POP严重降低中老年女性的生活质量。盆腔组织中衰老成纤维细胞会导致组织功能障碍和器官老化，降低盆底肌支持能力和完整性^［4］。

细胞衰老是一种稳定的细胞周期停滞状态，与机体衰老、组织功能减退和多种年龄相关疾病密切相关^［5］。D-半乳糖（D-galactose，D-gal）已被广泛应用于建立诱导体外和体内衰老模型，其通过促进活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成和晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）形成，加速细胞老化^［6］。内质网（endoplasmic reticulum，ER）和线粒体作为细胞内重要的细胞器，其功能紊乱在细胞衰老进程中发挥核心作用^［7］。二者通过线粒体相关内质网膜（mitochondria-associated membranes，MAMs）紧密偶联，形成功能上的协同单元^［8］。硒蛋白N1（selenoprotein N1，SEPN1）是一种主要位于内质网 的 硒 代 半 胱 氨 酸 蛋 白，其 在 维 持 钙 离 子（calcium ion，Ca²⁺）稳态、抗氧化防御和肌肉发育中起重要作用^［9］。GERMANI等^［10］研究发现：SEPN1敲除会导致线粒体Ca²⁺摄取显著减少，线粒体膜电位降低和线粒体三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生成减少。提示SEPN1缺失影响内质网与线粒体间的Ca²⁺稳态，同时损伤线粒体功能。尽管SEPN1相关疾病（如刚性脊柱肌营养不良症）均与肌肉无力有关，但其在细胞衰老，尤其是成纤维细胞衰老中的作用仍不明确。本研究探讨SEPN1在细胞衰老过程中的表达变化，分析SEPN1缺失对L929成纤维细胞衰老、内质网应激、线粒体功能和胶原蛋白合成功能的影响，阐明SEPN1在细胞衰老中的潜在机制，为POP的发病机制研究提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1　细胞、主要试剂和仪器

小鼠成纤维细胞L929购于武汉普诺赛生命科技有限公司。MEM培养基购于武汉Pricella生物技术有限公司，胎牛血清（fetal bovineserum，FBS）购于美国Gemini Bio-Products公司，D-gal购于上海国药集团化学试剂有限公司，小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）由安徽通用生物公司合成，转染试剂Lipofectamine 3000购于美国Thermo Fisher Scientific 公 司。 衰 老 相 关 β-半 乳 糖 苷 酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal）染色试剂盒购自北京Solarbio科技有限公司。RIPA裂解缓冲液、苯甲磺酰氟（phenyl methane sulfonyl fluoride，PMSF）及蛋白酶抑制剂Cocktail购于武汉赛维尔生物技术有限公司，聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）购于美国Pall 公 司，增 强 化 学 发 光 试 剂（enhanced chemi luminescence，ECL）购 于 美 国 Thermo Fisher Scientific公司。线粒体膜电位染料四甲基罗丹明乙酯（tetramethyl rhodamine ethyl ester，TMRE）、Ca²⁺荧光探针Fluo-4 AM、ROS荧光探针2'，7'-二氯 荧 光 素 二 乙 酸（2'，7'-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）和5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）细胞增殖检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司，多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）、Triton X-100、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和DAPI购于北京Solarbio科技有限公司，SEPN1、P21、P16、Ⅰ型胶原蛋白 （collagen type Ⅰ， Col Ⅰ）、Ⅲ型胶原蛋白（collagen type Ⅲ，Col Ⅲ）、葡萄糖调节蛋白78 （glucose-regulated protein 78， GRP78）、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）和α-Tubulin抗体和HRP偶联二抗均购于武汉Proteintech公司。CO₂细胞培养箱（型号：HERAcell 150i）购于美国Thermo Fisher Scientific公司，低温高速离心机（型号：5810R）购于德国Eppendorf公司，蛋白电泳及转膜系统（型号：MINI）、恒压/恒流电源（型号：PowerPac Basic）和化学发光仪（型号：ChemiDoc^TM Touch）购于美国Bio-Rad公司，恒温摇床（型号：IS-RDD3）购于美国Crystal公司，倒置荧光显微镜（型号：Olympus IX73）购于日本Olympus公司。

1.2　L929细胞培养、衰老模型制备和分组

L929细胞来源于小鼠结缔组织。在MEM培养基中添加10% FBS，于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养，每2 d更换1次培养基。当细胞达到约70%融合时进行传代或冻存。根据处理方式将细胞分为对照组（细胞未进行任何处理，继续常规培养）和衰老模型组（D-gal组，将处于对数生长期的L929 细胞暴露于20 g·L^-1 D-gal处理48 h，以建立D-gal诱导的细胞衰老模型）。

1.3　L929细胞转染si-SEPN1和分组

L929细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔约含有2×10⁵个细胞，待细胞贴壁生长后进行siRNA转染。采用 Lipofectamine 3000 转染试剂，按照说明书操作，将40 nmol siRNA转染至细胞中。SEPN1 siRNA 由安徽通用生物公司设计并合成，其正义链序列为5'-CCAUGAAGCCUGAAGACAUTT-3'，反义链序列为5'-AUGUCUUCAGGCUUCAUGGTT-3'。根据转染条件将细胞分为阴性对照组（si-NC组，转染si-NC以排除转染操作的非特异性影响）和实验组（si-SEPN1组，转染SEPN1特异性siRNA以抑制SEPN1的表达）。转染48 h后收集细胞，用于后续实验检测。

1.4　SA-β-gal染色法观察各组L929细胞染色情况并计算SA-β-gal阳性细胞百分率

使用衰老相关SA-β-gal染色试剂盒对各组细胞进行染色。按照说明书操作，染色结束后于光学显微镜下观察并随机选取多个视野拍照记录，计数细胞并计算SA-β-gal阳性细胞百分率。SA-β-gal阳性细胞百分率=蓝色阳性细胞数/总细胞数×100%。每组统计3个视野，取平均值。

1.5　Western blotting法检测各组L929细胞中SEPN1、P21、P16、Col Ⅰ、Col Ⅲ、GRP78和CHOP蛋白表达水平

使用RIPA裂解缓冲液、PMSF和Cocktail从L929细胞中分离总蛋白。通过10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离后转至0.45 μm PVDF膜。用5%脱脂牛奶室温封闭1 h后，于4 ℃下孵育一抗过夜，SEPN1（1∶1 000）、P21 （1∶2 000）、P16（1∶2 000）、Col Ⅰ（1∶1 000）、Col Ⅲ（1∶5 000）、GRP78（1∶3 000）、CHOP（1∶1 000）和α-Tubulin（1∶10 000）。二抗HRP偶联（1∶10 000），室温孵育1 h。ECL显影后使用Bio-Rad成像系统拍照。采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以α-Tubulin为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。随后进行归一化处理，确保消除样品加样量和膜处理差异的影响，从而更准确地比较各组目的蛋白表达水平。将对照组和si-NC组的相对表达量设为1（100%），其他实验组的相对表达量按对照组进行归一化处理：归一化表达量=实验组相对表达量/对照组相对表达量。归一化后的数据用于统计学分析。

1.6　DCFH-DA荧光探针法检测各组细胞中ROS水平

各组细胞按分组处理后，弃去培养液，加入适量DCFH-DA荧光探针工作液，于37 ℃、避光条件下孵育20 min。孵育结束后，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤3次，以充分去除未进入细胞内的探针。随后于倒置荧光显微镜下观察并采集图像，激发波长和发射波长按试剂盒说明书设置。每组随机选取3个视野拍照，并采用Image J图像分析软件对荧光图像进行定量分析，测定各视野的平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI），取3个视野的平均值作为该组细胞内ROS水平。荧光强度越高，表明细胞中ROS水平越高。

1.7　采用试剂盒检测各组细胞线粒体膜电位水平

各组细胞按分组处理后，弃去培养液，加入适量 TMRE 染料工作液，于37 ℃、避光条件下孵育30 min。染色结束后，用PBS缓冲液洗涤3次，以去除多余染料。随后于倒置荧光显微镜下观察并采集红色荧光图像，激发波长和发射波长按试剂盒说明书设置。每组随机选取3个视野拍照，并采用Image J图像分析软件对图像进行荧光强度分析，测定各视野的平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI），取其平均值作为该组线粒体膜电位水平。线粒体膜电位以红色荧光表示，荧光强度越高，提示线粒体膜电位水平越高；荧光强度降低则提示线粒体膜电位水平降低。

1.8　Fluo-4 AM Ca²⁺荧光探针检测各组L929细胞中Ca²⁺水平

各组L929细胞按分组处理后，弃去培养液，加入Fluo-4 AM Ca²⁺荧光探针工作液（终浓度2 μmol·L^-1），于37 ℃、避光条件下孵育30 min。孵育结束后，用PBS缓冲液洗涤3次，以去除细胞外残余探针。随后于倒置荧光显微镜下观察并采集绿色荧光图像，激发波长和发射波长按试剂盒说明书设置。每组随机选取3个视野拍照，并采用Image J图像分析软件测定各视野MFI，取平均值，以平均MFI代表细胞中Ca²⁺水平。

1.9　EdU染色检测各组L929细胞增殖活性

EdU试剂盒染色后固定、透化和Click标记。在荧光显微镜下EdU标记的阳性细胞为红色。随机选取3个不重复的视野计数阳性细胞数和总细胞数，计算EdU阳性细胞率。EdU阳性细胞率=EdU阳性细胞数/总细胞数×100%，以EdU阳性细胞率代表细胞增殖活性。

1.10　免疫荧光法检测各组L929细胞中Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白表达情况

将L929细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞融合度达到70%~80%后，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS缓冲液洗涤3次；随后加入0.5% Triton X-100室温透化20 min，PBS缓冲液洗涤3次。再以5% BSA封闭1 h，加入一抗（Col Ⅰ和Col Ⅲ）于4 ℃孵育过夜。次日PBS缓冲液洗涤3次后，加入相应荧光二抗避光孵育，并以DAPI复染细胞核。染色完成后，于倒置荧光显微镜下采集图像。Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白表达情况根据荧光信号强弱进行判定，荧光强度越强表示其表达水平越高。每组随机选取3个视野拍照，采用Image J图像分析软件测定MFI，并以细胞核数进行校正后取平均值，作为该组细胞Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白表达水平。图像采集过程中各组曝光参数保持一致。

1.11　统计学分析

采用GraphPad Prism 9.5软件进行统计学分析。各组SA-β-gal阳性细胞百分率、细胞增殖活性、细胞中ROS水平、线粒体膜电位水平和Ca²⁺水平及相关蛋白表达水平经检验确认符合正态分布，以x±s表示。2组间样本均数比较采用两独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　各组L929细胞中SA-β-gal阳性细胞百分率

与对照组（11.60%±3.10%）比较，D-gal组L929细胞中SA-β-gal阳性细胞百分率（64.80%± 3.70%） 明显升高（P<0.01）； 与si-NC组 （15.60%± 1.30%）比较，si-SEPN1组L929细胞中SA-β-gal阳性细胞百分率（72.00%±3.70%）明显升高（P<0.01）。见图1。

2.2　2组L929细胞中P21、P16和SEPN1蛋白表达水平

与对照组比较，D-gal组L929细胞中P21和P16蛋白表达水平明显升高（P<0.01），SEPN1蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。见图2。

2.3　各 组 L929 细 胞 增 殖 活 性

与 对 照 组（41.80%±5.10%）比较，D-gal组L929细胞增殖活 性（17.40%±5.40%）明 显 降 低（P<0.01）；与si-NC组（31.67%±6.95%）比较，si-SEPN1组L929细胞增殖活性（7.84%±1.74%）明显降低（P<0.01）。见图3和4。

2.4　各组L929细胞中ROS水平

与对照组（63.40±12.03）比较，D-gal组L929细胞中ROS水平（140.95±2.26）明显升高（P<0.01）；与si-NC组（46.98±6.94）比较，si-SEPN1组L929细胞中ROS水平（158.80±44.55）明显升高（P<0.05）。见图5。

2.5　敲低SEPN1后2组L929细胞中衰老相关蛋白表达水平

与si-NC组比较，si-SEPN1组细胞中SEPN1、Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白表达水平明显降低（P<0.05 或 P<0.01）， P21、 P16、 GRP78 和CHOP蛋白表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01）。见图6。

2.6　敲低SEPN1后2组L929细胞线粒体膜电位水平和细胞中Ca²⁺水平

与si-NC组（115.56±3.89）比较，si-SEPN1组L929细胞线粒体膜电位水平（58.59±3.86）明显降低（P<0.01）；与si-NC组（58.32±12.62）比较，si-SEPN1组L929细胞中Ca²⁺水平（188.67±58.65）明显升高（P<0.05）。见图7和8。

2.7　2组L929细胞中Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白表达水平

与si-NC组（1.067±0.044和0.894±0.057）比较，si-SEPN1组L929细胞中Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白表达水平（0.862±0.091和0.409±0.114）均明显降低（P<0.05或P<0.01）。见图9。

3 讨 论

本研究从细胞衰老视角出发，探讨硒蛋白家族成员SEPN1在成纤维细胞功能衰退中的作用及其潜在机制，为理解POP的分子基础提供了新的思路。近年来，细胞衰老已被认为是POP等退行性疾病的重要驱动因素之一。随着年龄增长，盆底结缔组织中成纤维细胞功能下降、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）代谢失衡及修复能力减弱，均可导致组织支持力不足^［11-13］。研究^［14-15］显示：衰老成纤维细胞不仅分泌胶原能力下降，还会释放衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）因子，如白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、基质金属蛋白酶（matrix metallo proteinase，MMP）-2和MMP-9等，进一步加剧ECM降解。本研究结果显示：D-gal诱导的衰老模型中SEPN1蛋白表达显著下调，提示其可能是成纤维细胞抗衰老能力丧失的关键调控因子。

SEPN1是一种位于内质网膜上的硒依赖性还原酶，主要负责调控细胞内氧化还原平衡和钙稳态^［16-18］。研究^{［10，19-20］}发现：SEPN1缺失可导致肌肉细胞和干细胞中氧化应激水平升高及线粒体损伤，从而触发细胞功能衰退。本研究结果显示：敲低SEPN1导致GRP78和CHOP蛋白表达上调，提示内质网应激被激活。研究^［21-22］显示：GRP78是未折叠蛋白（unfolded protein response，UPR）反应早期的标志蛋白，而CHOP则在持续应激下促进细胞衰老和凋亡。长期内质网应激会通过抑制蛋白质折叠和分泌功能，破坏胶原蛋白的正确加工，从而影响结缔组织完整性^［23-24］。因此，SEPN1的降低可能通过削弱内质网抗压能力，加速POP相关组织退变过程。

本研究结果显示：SEPN1缺失同时伴随线粒体膜电位水平下降、ROS水平升高及Ca²⁺过载，表明其调控范围延伸至内质网-线粒体相互作用层面。研究^［8，25］发现：内质网与线粒体通过膜接触位点MAMs介导的钙信号传递在维持能量代谢与细胞命运决定中发挥关键作用，当MAMs稳态破坏时，Ca²⁺过度释放至线粒体可诱发氧化应激和能量耗竭，从而加速衰老过程^［26］。因此，本研究结果提示SEPN1可能通过稳定MAMs介导的钙稳态来延缓成纤维细胞的衰老进程。

在功能层面，SEPN1的缺失显著降低了Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白的合成。胶原是盆底组织维持张力和弹性的关键基质蛋白，其减少会直接削弱组织机械强度。既往研究^［27］发现：POP患者的前阴道筋膜组织中Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白明显减少，并伴随合成-降解平衡失调。氧化应激被认为是导致胶原交联障碍和基质重塑紊乱的重要因素^［28-29］。提示胶原下调可能是SEPN1介导的抗氧化保护丧失所致，进一步支持SEPN1在维持基质稳态中的重要性。

综上所述，SEPN1下调可引起内质网应激及钙信号异常，导致线粒体功能障碍与ROS过量积累，激活P16/P21通路并诱发细胞衰老，从而抑制胶原合成和组织修复。这一机制不仅拓展了硒蛋白家族在结缔组织稳态维持中的研究领域，也为POP等退行性疾病的干预提供了新的分子靶点。

参考文献

[1] COLLINS S， LEWICKY-GAUPP C. Pelvic organ prolapse［J］. Gastroenterol Clin North Am， 2022， 51（1）： 177-193.

[2] SIVALINGARAJAH R， BALASINGAM B， URUTHIRAKUMAR P， et al. Gynecological morbidity in geriatric women： findings from a cross-sectional study in a tertiary care center in northern Sri Lanka［J］. Cureus， 2025， 17（6）： e85416.

[3] LI P P， MA H Y， ZHANG J， et al. Global trends in prevalence and future projections of pelvic organ prolapse： a 30-year epidemiological study［J］. Int Urogynecol J， 2025， 36（5）： 991-1002.

[4] GULER Z， ROOVERS J P. Role of fibroblasts and myofibroblasts on the pathogenesis and treatment of pelvic organ prolapse［J］. Biomolecules， 2022， 12（1）： 94.

[5] CHILDS B G， GLUSCEVIC M， BAKER D J， et al. Senescent cells： an emerging target for diseases of ageing［J］. Nat Rev Drug Discov， 2017， 16（10）： 718-735.

[6] HUANG G X， SUN S N， LIAO M D， et al. METTL3-mediated m6A modification regulates D-galactose-induced skin fibroblast senescence through miR-208a-5p［J］. Front Immunol， 2025， 16： 1577783.

[7] LÓPEZ-OTÍN C， BLASCO M A， PARTRIDGE L， et al. Hallmarks of aging： an expanding universe［J］. Cell， 2023， 186（2）： 243-278.

[8] BARAZZUOL L， GIAMOGANTE F， CALÌ T. Mitochondria associated membranes （MAMs）： architecture and physiopathological role［J］. Cell Calcium， 2021， 94： 102343.

[9] MAKIO T， CHEN J S， SIMMEN T. ER stress as a sentinel mechanism for ER Ca²⁺ homeostasis［J］. Cell Calcium， 2024， 124： 102961.

[10] GERMANI S， VAN HO A T， CHERUBINI A， et al. SEPN1-related myopathy depends on the oxidoreductase ERO1A and is druggable with the chemical chaperone TUDCA［J］. Cell Rep Med， 2024， 5（3）： 101439.

[11] RUI B J， RUI G H， YANG Y F. Unveiling pathogenesis of pelvic organ prolapse through transcriptomic and bioinformatic analyses in uterosacral ligament tissues of postmenopausal women［J］. Front Genet， 2025， 16： 1588278.

[12] TAPPY E， SHI H L， PRUSZYNSKI J， et al. Use of the senolytics dasatinib and quercetin for prevention of pelvic organ prolapse in a mouse animal model［J］. Aging， 2024， 16（19）： 12685-12696.

[13] HUANG L W， ZHAO Z W， WEN J R， et al. Cellular senescence： a pathogenic mechanism of pelvic organ prolapse （Review）［J］. Mol Med Rep， 2020， 22（3）： 2155-2162.

[14] NAN L， GUO P C， HUI W， et al. Recent advances in dermal fibroblast senescence and skin aging： unraveling mechanisms and pioneering therapeutic strategies［J］. Front Pharmacol， 2025， 16： 1592596.

[15] MA Z J， DING Y J， DING X F， et al. PDK4 rescues high-glucose-induced senescent fibroblasts and promotes diabetic wound healing through enhancing glycolysis and regulating YAP and JNK pathway［J］. Cell Death Discov， 2023， 9（1）： 424.

[16] MIAO Z R， WANG W， MIAO Z Y， et al. Role of Selenoprotein W in participating in the progression of non-alcoholic fatty liver disease［J］. Redox Biol， 2024， 71： 103114.

[17] POTHION H， JEHAN C， TOSTIVINT H， et al. Selenoprotein T： an essential oxidoreductase serving as a guardian of endoplasmic reticulum homeostasis［J］. Antioxid Redox Signal， 2020， 33（17）： 1257-1275.

[18] OUYANG P， CAI Z Y， PENG J Y， et al. SELENOK-dependent CD36 palmitoylation regulates microglial functions and Aβ phagocytosis［J］. Redox Biol， 2024， 70： 103064.

[19] KIM B S， JUNG J S， JANG J H， et al. Nuclear Argonaute 2 regulates adipose tissue-derived stem cell survival through direct control of miR10b and selenoprotein N1 expression［J］. Aging Cell， 2011， 10（2）： 277-291.

[20] VARONE E， POZZER D， DI MODICA S， et al. SELENON （SEPN1） protects skeletal muscle from saturated fatty acid-induced ER stress and insulin resistance［J］. Redox Biol， 2019， 24： 101176.

[21] CHEN X， CUBILLOS-RUIZ J R. Endoplasmic reticulum stress signals in the tumour and its microenvironment［J］. Nat Rev Cancer， 2021， 21（2）： 71-88.

[22] REN J， BI Y G， SOWERS J R， et al. Endoplasmic reticulum stress and unfolded protein response in cardiovascular diseases［J］. Nat Rev Cardiol， 2021， 18（7）： 499-521.

[23] GAO S Y， CHEN T， DENG C L， et al. An endoplasmic reticulum stress-responsive nanocomposite hydrogel for diabetic wound healing through a fibroblast-immune cell dual regulation hub［J］. J Nanobiotechnology， 2025， 23（1）： 689.

[24] FARHAN H， ZAHOOR M， TAUER J T， et al. The endoplasmic reticulum proteostasis network and bone disease［J］. Trends Mol Med， 2026， 32（2）： 119-132.

[25] SANG M D， LI X D， CHEN M， et al. Role of mitochondria-associated ER in apoptosis［J］. Cell Biochem Funct， 2025， 43（7）： e70105.

[26] MADREITER-SOKOLOWSKI C T， THOMAS C， RISTOW M. Interrelation between ROS and Ca²⁺ in aging and age-related diseases［J］. Redox Biol， 2020， 36： 101678.

[27] KONG M， WANG Z， HAO Y， et al. Role of the integrin-β1/TGF-β1 signaling pathway in the pathogenesis of pelvic organ prolapse： a study on vaginal wall tissue alterations and molecular dysfunction［J］. Mol Med Rep， 2025， 31（4）： 104.

[28] ZHENG Y J， LEI J D， ZHANG A， et al. Regulatory mechanisms of transforming growth factor-β in senescence of fibroblast associated with refractory skin diseases［J］. Exp Gerontol， 2025， 211： 112900.

[29] YAN Y F， PENG J， HE W， et al. SGK1 inhibits oxidative injury and extracellular matrix degradation by activating the GSK-3β （Ser9）/Fyn/NRF2 pathway in pelvic organ prolapse［J］. Life Sci， 2025， 380： 123939.

基金资助

国家自然科学基金项目(82371639)

国家自然科学基金项目(82571874)

湖北省科技厅科技创新项目(2025CCB011)