组蛋白去乙酰化酶6抑制剂ACY-241对巨噬细胞极化和食管癌细胞生物学行为的影响及其机制

Effect of histone deacetylase 6 inhibitor ACY-241 on macrophage polarization and biological behaviors of esophageal cancer cells and its mechanism

摘要

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）抑制剂ACY-241对巨噬细胞极化及食管鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并阐明其作用机制。 方法 采用佛波酯诱导人单核细胞白血病细胞系THP-1分化为M0型巨噬细胞，将M0型巨噬细胞分别与人食管鳞状细胞癌细胞KYSE150和HDAC6抑制剂ACY-241处理的KYSE150细胞进行共培养，采用流式细胞术检测共培养后巨噬细胞极化情况，酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定共培养后KYSE150细胞上清中CC趋化因子配体2（CCL2）水平，Western blotting法检测共培养后2组巨噬细胞中CC趋化因子受体2（CCR2）蛋白表达水平，使用pLVX-CCL2慢病毒及其阴性对照pLVX-NC慢病毒转染KYSE150细胞，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法和Western blotting法检测转染效果；将M0型巨噬细胞分别与转染慢病毒、用ACY-241处理的KYSE150细胞进行共培养，分为对照组、ACY-241组、pLVX-NC+ACY-241组和pLVX-CCL2+ACY-241组，ELISA法测定各组KYSE150细胞上清中CCL2水平，Western blotting法检测各组巨噬细胞中CCR2蛋白表达水平，流式细胞术检测各组巨噬细胞极化情况，RT-qPCR法检测各组巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素10（IL-10）和精氨酸酶1（Arg-1）mRNA表达水平，细胞计数试剂盒8（CCK-8）法、克隆形成实验和Transwell小室实验分别检测各组KYSE150细胞增殖活性、克隆形成数和迁移细胞数及侵袭细胞数。 结果 与对照组比较，ACY-241组巨噬细胞中M1型巨噬细胞百分率升高（P<0.05），M2型巨噬细胞百分率降低（P<0.05），KYSE150细胞上清中CCL2水平降低（P<0.05），巨噬细胞中CCR2蛋白表达水平降低（P<0.05）。转染pLVX-CCL2慢病毒的KYSE150细胞中CCL2 mRNA及蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）。与对照组比较，ACY-241组巨噬细胞中iNOS和IL-6 mRNA表达水平明显升高（P<0.05），IL-10和Arg-1 mRNA表达水平明显降低（P<0.05），KYSE150细胞增殖活性降低（P<0.05），克隆形成数、迁移细胞数和侵袭细胞数均减少（P<0.05）；与pLVX-NC+ACY-241组比较，pLVX-CCL2+ACY-241组KYSE150细胞上清中CCL2水平升高（P<0.05），巨噬细胞中CCR2蛋白表达水平升高（P<0.05），巨噬细胞中M1型巨噬细胞百分率降低（P<0.05）、M2型巨噬细胞百分率升高（P<0.05），巨噬细胞中iNOS和IL-6 mRNA表达水平降低（P<0.05）、IL-10和Arg-1 mRNA表达水平升高（P<0.05），KYSE150细胞增殖活性升高（P<0.05），KYSE150细胞克隆形成数、迁移细胞数和侵袭细胞数均增加（P<0.05）。 结论 HDAC6抑制剂ACY-241可促进巨噬细胞向M1型极化并减少其向M2型极化，抑制食管鳞状细胞癌KYSE150细胞增殖、迁移和侵袭，其机制可能与阻抑CCL2/CCR2轴有关。

Abstract

Objective To discuss the effect of histone deacetylase 6 （HDAC6） inhibitor ACY-241 on macrophage polarization and the proliferation， migration and invasion of esophageal squamous cell carcinoma cells， and to clarify its mechanism. Methods Phorbol ester was used to induce human monocytic leukemia cell line THP-1 to differentiate into M0 macrophages. The M0 macrophages were co-cultured with human esophageal squamous cell carcinoma cells KYSE150 and KYSE150 cells treated with HDAC6 inhibitor ACY-241， respectively. Flow cytometry was used to detect macrophage polarization after co-culture； enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to determine the level of CC chemokine ligand 2 （CCL2） in the supernatant of KYSE150 cells after co-culture； Western blotting method was used to detect the expression level of CC chemokine receptor 2 （CCR2） protein in macrophages in two groups after co-culture； pLVX-CCL2 lentivirus and its negative control pLVX-NC lentivirus were used to transfect KYSE150 cells， and real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） and Western blotting methods were used to detect the transfection efficiency. The M0 macrophages were co-cultured with KYSE150 cells transfected with lentivirus and treated with ACY-241， and divided into control group， ACY-241 group， pLVX-NC+ACY-241 group and pLVX-CCL2+ACY-241 group； ELISA method was used to determine the levels of CCL2 in supernatant of KYSE150 cells in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of CCR2 protein in macrophages in various groups； flow cytometry was used to detect macrophage polarization in various groups； RT-qPCR method was used to detect the expression levels of inducible nitric oxide synthase （iNOS）， interleukin-6 （IL-6）， interleukin-10 （IL-10） and arginase 1 （Arg-1） mRNA in macrophages in various groups； CCK-8 method， colony formation assay and Transwell chamber assay were used to detect the proliferation activities， colony formation numbers， number of migration cells and number of invasion cells in the KYSE150 cells in various groups， respectively. Results Compared with control group， the percentage of M1 macrophages in ACY-241 group was increased （P<0.05）， the percentage of M2 macrophages was decreased （P<0.05）， the level of CCL2 in the supernatant of KYSE150 cells was decreased （P<0.05）， and the expression level of CCR2 protein in macrophages was decreased （P<0.05）. After transfection with pLVX-CCL2 lentivirus， the expression levels of CCL2 mRNA and protein in KYSE150 cells were significantly increased （P<0.05）. Compared with control group， the expression levels of iNOS and IL-6 mRNA in macrophages in ACY-241 group were significantly increased （P<0.05）， the expression levels of IL-10 and Arg-1 mRNA were significantly decreased （P<0.05）， the proliferation activity of KYSE150 cells was decreased （P<0.05）， and the colony formation number， number of migration cells and number of invasion cells were decreased （P<0.05）. Compared with pLVX-NC+ACY-241 group， the level of CCL2 in the supernatant of KYSE150 cells in pLVX-CCL2+ACY-241 group was increased （P<0.05）， the expression level of CCR2 protein in macrophages was increased （P<0.05）， the percentage of M1 macrophages was decreased （P<0.05）， the percentage of M2 macrophages was increased （P<0.05）， the expression levels of iNOS and IL-6 mRNA in macrophages were decreased （P<0.05） and the expression levels of IL-10 and Arg-1 mRNA were increased （P<0.05）， the proliferation activity of KYSE150 cells was increased （P<0.05）， and the colony formation number， number of migration cells and number of invasion cells in KYSE150 cells were increased （P<0.05）. Conclusion HDAC6 inhibitor ACY-241 can promote macrophage polarization towards M1 type and reduce its polarization towards M2 type， and inhibit the proliferation， migration and invasion of esophageal squamous cell carcinoma KYSE150 cells； its mechanism may be related to suppressing the CCL2/CCR2 axis.

Graphical abstract

关键词

食管鳞状细胞癌 / 组蛋白去乙酰化酶6 / 巨噬细胞极化 / CC趋化因子配体2 / CC趋化因子受体2

Key words

Esophageal squamous cell carcinoma / Histone deacetylase 6 / Macrophage polarization / CC chemokine ligand 2 / CC chemokine receptor 2

食管癌是严重威胁人类健康的消化系统恶性肿瘤，是全球第七大常见恶性肿瘤，每年有超过47万例新诊断病例^［1］。食管癌主要有食管腺癌和食管鳞状细胞癌2种组织学形式。我国是食管鳞状细胞癌的高发国家之一，超过90%的食管癌患者属于该类型^［2］。近年来，尽管早期筛查和治疗手段有所进展，但由于诊断滞后、肿瘤侵袭性强和耐药性等问题，患者总体预后仍不理想^［3］。因此，迫切需要进一步探索该疾病的分子机制并寻找新的治疗策略。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）是肿瘤微环境中的重要免疫细胞，其通过分泌多种细胞因子和趋化因子调节肿瘤微环境，影响肿瘤细胞的生物学行为^［4］。根据TAM在肿瘤微环境中的功能可将其分为M1型和M2型，其中M1型巨噬细胞通常具有抗肿瘤作用，能够通过分泌促炎因子抑制肿瘤的增殖和转移；而M2型巨噬细胞则通过分泌免疫抑制因子促进肿瘤的生长、迁移和侵袭及免疫逃逸^［5-6］。揭示TAM的极化机制并促进其向M1型分化，是近年来肿瘤精准医疗的新型治疗选择。组蛋白去乙酰化酶6（histone deacetylase 6，HDAC6）作为一种非组蛋白去乙酰化酶，在多种肿瘤类型中被证实高表达，并与细胞增殖和转移及耐药性存在密切关联^［7-9］。近年来，HDAC6抑制剂在肿瘤治疗研究中逐渐展现出潜力。已有研究^［10-11］显示：HDAC6可通过调节免疫细胞功能促进肿瘤进展，抑制其活性则有助于改善抗肿瘤免疫反应。但目前尚缺乏关于HDAC6在食管鳞状细胞癌中调控TAM极化及其作用机制的相关研究。基于此，本研究探讨HDAC6抑制剂对巨噬细胞极化的调节作用及其对食管鳞状细胞癌细胞行为的影响，并分析其作用机制，以期为食管鳞状细胞癌的免疫治疗提供理论依据和新策略。

1 材料与方法

1.1　细胞、主要试剂和仪器

人食管鳞状细胞癌细胞系KYSE150和人单核细胞白血病细胞系THP-1（中国科学院上海生命科学研究院）。RPMI-1640培养基、胎牛血清和1%青-链霉素混合液（美国Gibco公司），佛波酯和Polybrene（美国Sigma-Aldrich公司），HDAC6抑制剂ACY-241（美国Cayman公司），Transwell小室（上海优尔达生物科技有限公司），TRIzol试剂盒、RevertAid第一链cDNA 合成试剂盒和PowerTrack^TM SYBR Green Master Mix试剂盒（美国Thermo Fisher公司），CC趋化因子配体2（CC chemokine ligand 2，CCL2）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司），RIPA裂解液、蛋白定量试剂盒、增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂和结晶紫染色液（上海碧云天生物技术股份有限公司），抗CCL2抗体和抗GAPDH抗体（美国Santa Cruz Biotechnology公司），PE标记的F4/80抗体、APC标记的CD86抗体和APC标记的CD206抗体（美国BD Biosciences公司），pLVX-CCL2慢病毒载体及其阴性对照p-LVX-NC（广州赛诚生物科技有限公司）。IX73倒置荧光显微镜（日本Olympus公司），XSP-8CA光学显微镜（上海光学仪器厂），FACSCanto Ⅱ流式细胞仪（美国BD Biosciences公司），Nano-300微量分光光度计（杭州佑宁科技有限公司），Applied Biosystems 7500实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），多功能酶标仪（上海优尔达公司），DYCP-31E垂直电泳槽（北京六一仪器厂）。

1.2　共培养体系的制备和分组处理

用含10%胎牛血清、1%青-链霉素的RPMI-1640培养基分别培养KYSE150细胞和THP-1细胞，置于37 ℃、5%CO₂条件下，48 h更换1次培养基，取处于对数生长期的细胞进行实验。采用Transwell小室构建细胞共培养系统^［12］，上室与下室以0.4 µm聚碳酸酯膜相隔，在含6孔细胞培养板的上室接种1×10⁵个THP-1细胞，添加100 µg·L^-1佛波酯处理48 h，将其诱导分化为M0型巨噬细胞，在6孔细胞培养板底部（下室）接种1×10⁵个KYSE150细胞，记为对照组；ACY-241组为6孔细胞培养板底部（下室）接种1×10⁵个KYSE150细胞，并用10 μmol·L^-1 HDAC6抑制剂ACY-241处理细胞，上室接种细胞数量和处理方式与对照组相同。将共培养体系置于37 ℃、5%CO₂条件下，48 h后收集细胞，检测巨噬细胞极化情况、CCL2分泌水平和CC趋化因子受体2（CC chemokine receptor 2，CCR2）蛋白表达水平。

1.3　流式细胞术检测巨噬细胞极化状态

收集共培养体系中的上层小室内THP-1细胞，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤，结合缓冲溶液重悬，调整细胞浓度为1×10⁵ mL^-1，吸取100 μL移入流式管，依次加入PE标记的F4/80抗体、APC标记的CD86抗体或CD206抗体，室温避光染色30 min，PBS缓冲液洗涤细胞，再用400 μL结合缓冲溶液重悬，在1 h内通过流式细胞仪进行分析，检测巨噬细胞表型分布情况。

1.4　采用试剂盒检测共培养体系中下室各组KYSE150细胞上清中CCL2水平

收集下层KYSE150细胞的培养上清，2 000 r·min^-1离心10 min，取上清，按照ELISA试剂盒说明书操作，测定KYSE150细胞上清中CCL2水平，将相应浓度的标准品和样本上清液加到孔中，依次加入生物素标记的抗体、酶标试剂和显示剂进行反应。使用酶标仪测定波长450 nm处各孔的吸光度（A）值，通过标准曲线计算各组细胞上清中CCL2水平。

1.5　Western blotting法检测共培养体系中上室各组巨噬细胞中CCR2蛋白表达水平

在收集的巨噬细胞中加入RIPA裂解液裂解细胞，提取总蛋白并测定浓度。蛋白加热变性，取等量30 µg加载至十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），通过电泳分离，转至PVDF膜上，在5%脱脂奶粉中封闭2 h，加入稀释的CCR2抗体（1∶1 000）孵育过夜，洗膜后，用HRP标记的IgG抗体（1∶5 000）室温孵育1 h。通过ECL显影，Image J软件分析CCR2蛋白条带灰度值，GAPDH作为内参蛋白进行标准化处理，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.6　制备CCL2过表达的KYSE150细胞及构建M0型巨噬细胞共培养体系

培养KYSE150细胞至对数生长期，按每孔1×10⁵个细胞的密度接种于6孔细胞培养板，在37 ℃、5%CO₂条件下过夜培养至达到60%~70%融合度，分别将pLVX-CCL2慢病毒和pLVX-NC慢病毒溶液加入到细胞培养液中，同时加入5 mg·L^-1 Polybrene，摇晃均匀，置于37 ℃、5%CO₂条件下感染48 h，用嘌呤霉素进行筛选，并通过RT-qPCR和Western blotting法检测转染后KYSE150细胞中CCL2 mRNA和蛋白表达。根据“1.2”中方法建立巨噬细胞与肿瘤细胞共培养体系，各组的上室均为M0型巨噬细胞，各组的下室不同，具体分组与处理如下：①对照组，下室为KYSE150细胞；②ACY-241组，下室为10 μmol·L^-1 ACY-241处理的KYSE150细胞；③pLVX-NC+ACY-241组，下室为转染pLVX-NC慢病毒的KYSE150细胞并用10 μmol·L^-1 ACY-241处理；④pLVX-CCL2+ACY-241组，下室为转染pLVX-CCL2慢病毒的KYSE150细胞并用10 μmol·L^-1 ACY-241处理。将上述体系置于37 ℃、5%CO₂条件下，共培养48 h后，进行后续实验。

1.7　RT-qPCR法检测各组KYSE150细胞中CCL2 mRNA表达水平及各组巨噬细胞分泌物相关基因mRNA表达水平

收集慢病毒转染后的KYSE150细胞及共培养后的各组巨噬细胞，使用TRIzol试剂并按照说明书提取细胞总RNA，测定其浓度和纯度。使用反转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，反应体系包含总RNA、反转录酶、dNTPs和Oligo（dT）引物，反应条件：42 ℃孵育60 min、70 ℃加热5 min。设计诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素10（interleukin-10，IL-10）和精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）基因的引物，见表1。采用PowerTrack^TM SYBR Green Master Mix进行qPCR反应，配置20 µL 反 应 体 系： PowerTrack^TM SYBR Green Master Mix 10 µL、上下游引物各0.5 µL、cDNA 1 µL、无酶水补足至20 µL，反应条件：95 ℃、3 min，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，共40个循环，实验重复3次。采用2^-△△Ct法计算目的基因表达水平。

1.8　细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8，CCK-8）法检测各组细胞增殖活性

将共培养后的KYSE150细胞以每孔1×10⁴个的密度接种至96孔细胞培养板中，在37 ℃、5%CO₂条件下培养，根据设置培养的时间点（0、24、48和72 h），在孔内加入10 µL CCK-8试剂，并继续孵育2 h，使用酶标仪于波长450 nm处测定（A）值，以A值表示细胞增殖活性。

1.9　克隆形成实验检测各组KYSE150细胞克隆形成数

将共培养后的KYSE150细胞接种至6孔细胞培养板，每孔接种500个细胞，在37 ℃、5% CO₂条件下培养。培养14 d后，细胞有明显可见的克隆形成，用PBS缓冲液洗涤，4%多聚甲醛固定细胞10 min，结晶紫染料染色15 min，在光学显微镜下观察并计数克隆数目，一个克隆定义为由≥50个细胞组成的聚集体。

1.10　Transwell小室实验检测各组KYSE150细胞的迁移细胞数和侵袭细胞数

在Transwell小室的上室中加入5×10⁴个共培养后的KYSE150细胞，下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，在37 ℃、5% CO₂条件下培养48 h，洗涤小室，去除未迁移的细胞，4%多聚甲醛固定细胞10 min，结晶紫染料染色15 min，在光学显微镜下观察并计数迁移数目。侵袭实验先用Matrigel包被小室上层，其余步骤与迁移实验相同，计数侵袭细胞数目。

1.11　统计学分析

采用 SPSS 25.0 和GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析及绘图。各组M1型和M2型巨噬细胞百分率，细胞上清中CCL2水平，细胞中CCR2蛋白表达水平、CCL2 mRNA和蛋白表达水平及iNOS、IL-6、IL-10和Arg-1 mRNA表达水平，细胞增殖活性、克隆形成数和迁移细胞数及侵袭细胞数均符合正态分布且方差齐，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　2组巨噬细胞的极化表型

与对照组［M1型巨噬细胞百分率（16.97%±1.38%）、M2型巨噬细胞百分率（40.56%±3.69%）］比较，ACY-241组共培养后巨噬细胞中F4/80⁺CD86⁺标记的M1型巨噬细胞百分率（34.39%±3.02%）明显升高（P<0.05），F4/80⁺CD206⁺标记的M2型巨噬细胞百分率（21.06%± 1.84%）明显降低（P<0.05）。见图1。提示ACY-241能够促进巨噬细胞向M1型极化并抑制其向M2型极化。

2.2　共培养体系中2组KYSE150细胞上清中CCL2水平

与对照组 （422.34 ng·L^-1±41.90 ng·L^-1）比较，ACY-241组KYSE150细胞上清中CCL2水平（214.65 ng·L^-1±22.38 ng·L^-1）明显降低（P<0.05）。

2.3　共培养体系中各组巨噬细胞中CCR2蛋白表达水平

与对照组（0.77±0.06）比较，ACY-241组巨噬细胞中CCR2蛋白表达水平（0.26±0.03）明显降低（P<0.05）。见图2。

2.4　转染CCL2慢病毒后KYSE150细胞中CCL2 mRNA和蛋白表达水平

与KYSE150细胞（1.00±0.04）和转染pLVX-NC慢病毒的KYSE150细胞（1.02±0.11）比较，转染pLVX-CCL2慢病毒的KYSE150细胞中CCL2 mRNA表达水平（4.68±0.43）明显升高（P<0.05）。与KYSE150细胞和转染pLVX-NC慢病毒的KYSE150细胞比较，转染pLVX-CCL2慢病毒的KYSE150细胞中CCL2蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。见图3。提示成功构建CCL2过表达的KYSE150细胞。

2.5　CCL2过表达后各组KYSE150细胞上清中CCL2水平

与对照组比较，ACY-241组KYSE150细胞上清中CCL2水平明显降低（P<0.05）；与pLVX-NC + ACY-241 组 比 较，pLVX-CCL2 + ACY-241组KYSE150细胞上清中CCL2水平明显升高（P<0.05）。见图4。

2.6　CCL2过表达后各组巨噬细胞中CCR2蛋白表达水平

与对照组比较，ACY-241组巨噬细胞中CCR2蛋白表达水平明显降低（P<0.05）；与pLVX-NC + ACY-241 组 比 较，pLVX-CCL2 + ACY-241组巨噬细胞中CCR2蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。见图5。

2.7　CCL2过表达后各组巨噬细胞的极化表型

与对照组比较，ACY-241组巨噬细胞中F4/80⁺CD86⁺标记的M1型巨噬细胞百分率明显升高（P<0.05），F4/80⁺CD206⁺标记的M2型巨噬细胞百分率明显降低（P<0.05）；与pLVX-NC+ACY-241组比较，pLVX-CCL2+ACY-241组巨噬细胞中F4/80⁺CD86⁺标记的M1型巨噬细胞百分率明显降低（P<0.05），F4/80⁺CD206⁺标记的M2型巨噬细胞百分率明显升高（P<0.05）。见图6和7。

2.8　CCL2过表达后各组巨噬细胞分泌物相关基因mRNA表达水平

与对照组比较，ACY-241组巨噬细胞中iNOS和IL-6 mRNA表达水平明显升高（P<0.05），IL-10和Arg-1 mRNA表达水平明显降低（P<0.05）；与pLVX-NC+ACY-241组比较，pLVX-CCL2+ACY-241组巨噬细胞中iNOS和IL-6 mRNA表达水平明显降低（P<0.05），IL-10和Arg-1 mRNA表达水平明显升高（P<0.05）。见图8。

2.9　CCL2过表达后各组KYSE150细胞的增殖活性和克隆形成数

与对照组比较，ACY-241组KYSE150细胞增殖活性明显降低（P<0.05）；与pLVX-NC+ACY-241 组 比 较， pLVX-CCL2+ACY-241组KYSE150细胞增殖活性明显升高（P<0.05）。见图9。

与对照组比较，ACY-241组KYSE150细胞克隆形成数明显减少（P<0.05）；与pLVX-NC+ACY-241 组 比 较，pLVX-CCL2 + ACY-241 组KYSE150细胞克隆形成数明显增加（P<0.05）。见图10和11。

2.10　CCL2过表达后各组KYSE150细胞的迁移细胞数和侵袭细胞数

与对照组比较，ACY-241组KYSE150细胞的迁移细胞数和侵袭细胞数明显减少（P<0.05）；与pLVX-NC+ACY-241组比较，pLVX-CCL2+ACY-241组ACY-241组KYSE150细胞的迁移细胞数和侵袭细胞数明显增加（P<0.05）。见图12和13。

3 讨 论

由于食管鳞状细胞癌早期症状不典型、缺乏有效的诊断和治疗靶点，且大部分患者在确诊时已发生转移，其5年生存率仅为20%，对人类健康造成严重威胁^［13］。因此，深入探讨食管鳞状细胞癌的发病机制，对寻找新的治疗靶点和预后指标以改善患者预后具有重要意义。TAM与肿瘤的发展和转移存在密切关联^［14-15］；其具有高度可塑性，在肿瘤微环境的刺激下，抗肿瘤的M1型与促肿瘤的M2型之间能够相互转化。研究^［16-17］表明：M2型巨噬细胞可以促进食管鳞状细胞癌的生长、侵袭和转移。本研究结果显示：HDAC6抑制剂ACY-241在食管鳞状细胞癌细胞与巨噬细胞共培养体系中，能够促进巨噬细胞向M1型极化并抑制其向M2型极化，提示HDAC6抑制剂ACY-241可能通过重塑TAM的功能状态，改善肿瘤免疫微环境，发挥抗肿瘤作用。

研究^［18-20］显示：HDAC6在多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用，其通过调控细胞周期、转移、血管生成和耐药性等机制增强肿瘤细胞的适应性及侵袭性。研究^［21］发现：HDAC6高表达与食管鳞状细胞癌的不良预后有关，而使用HDAC6抑制剂ACY-1215可以显著抑制食管鳞状细胞癌细胞增殖，并导致G₂/M期停滞和细胞凋亡。HDAC6可促进TAM向M2型极化并加速肿瘤进展，而使用其抑制剂或敲低HDAC6则阻止M2型极化并抑制肿瘤发展^［22-23］。ACY-241又名西塔里诺司他，是一种特异性的HDAC6抑制剂。本研究采用食管鳞状细胞癌细胞系KYSE150与巨噬细胞共培养模拟肿瘤微环境，结果显示：HDAC6抑制剂ACY-241处理的KYSE150细胞与巨噬细胞共培养后，巨噬细胞M1型巨噬细胞百分率升高，M2型巨噬细胞百分率降低，iNOS和IL-6 mRNA表达水平升高，IL-10和Arg-1 mRNA表达水平降低，表明HDAC6抑制剂ACY-241能够促进食管鳞状细胞癌微环境中TAM向M1型极化，抑制其向M2型极化；将HDAC6抑制剂ACY-241处理的KYSE150细胞与巨噬细胞共培养后，KYSE150细胞的增殖活性降低，克隆形成数、迁移细胞数和侵袭细胞数均减少。上述结果提示：HDAC6抑制剂ACY-241抑制TAM对食管鳞状细胞癌细胞生长具有促进作用，该作用可能与调节TAM极化有关。

趋化因子通过与细胞表面表达的G蛋白耦联趋化因子受体结合，诱导靶细胞的趋化反应，进而影响免疫应答、炎症、肿瘤发展和组织修复等生物学过程^［24］。趋化因子CCL2及其受体CCR2在肿瘤进展中发挥重要作用。在肿瘤微环境中，由肿瘤细胞分泌的CCL2通过激活多种机制促进肿瘤细胞生长和增殖，并与其受体CCR2结合促使其向肿瘤部位迁移和聚集，诱导单核细胞分化为TAM，从而促进肿瘤生长和免疫逃逸^［25］。YANG等^［26］研究显示：CCL2在食管鳞状细胞癌组织中高表达，并与TAM积累存在密切关联，阻断CCL2/CCR2轴可以减少TAM募集并抑制其向M2型极化，降低肿瘤发生率，并增强CD8⁺ T淋巴细胞的抗肿瘤功效。本研究结果显示：HDAC6抑制剂ACY-241处理的巨噬细胞与KYSE150细胞共培养下，KYSE150细胞上清中CCL2水平降低，巨噬细胞中CCR2蛋白表达水平降低；而将CCL2过表达的KYSE150细胞采用HDAC6抑制剂ACY-241处理，并与巨噬细胞共培养后，KYSE150细胞上清中CCL2水平升高，巨噬细胞中CCR2蛋白表达上调。巨噬细胞中M1型巨噬细胞百分率降低，M2型巨噬细胞百分率升高，M1型分泌物iNOS和IL-6 mRNA表达水平降低，M2型分泌物IL-10和Arg-1 mRNA表达水平升高，KYSE150细胞的增殖活性升高，克隆形成数、迁移细胞数和侵袭细胞数均增加。上述结果表明：HDAC6抑制剂ACY-241通过阻断CCL2/CCR2轴促进TAM向M1型极化、抑制其向M2型极化，从而抑制食管鳞状细胞癌细胞的生物学行为。

综上所述，HDAC6抑制剂ACY-241能够调节食管鳞状细胞癌微环境中TAM极化，通过促进TAM向M1型极化并抑制其向M2型极化，抑制食管鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭，该机制可能与阻断CCL2/CCR2轴有关。

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基金资助

甘肃省科技厅自然科学基金项目(GSWSKY2022-37)