过表达circ_ITCH通过调节星形胶质细胞活化对大鼠脊髓损伤修复的促进作用

Promotion effect of overexpression of circ_ITCH on repairment of spinal cord injury by regulating astrocyte activation in rats

摘要

目的 探讨过表达环状RNA（circRNA）_ITCH对大鼠脊髓损伤（SCI）的促进作用，并阐明其可能的作用机制。 方法 采用改良Allen’s打击法建立SCI大鼠模型，将造模成功大鼠随机分为假手术组、SCI模型组（SCI组）、空载腺相关病毒组（AAV-NC组）和circ_ITCH过表达腺相关病毒组（AAV-circ_ITCH组），每组15只。使用微量注射器向大鼠损伤脊髓内注射6 μL AVV-circ_ITCH和AAV-NC进行干预，假手术组和SCI组大鼠注射等量生理盐水。采用斜板实验和BBB运动评定量表评估各组大鼠后肢运动功能，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组大鼠脊髓损伤组织中circ_ITCH表达水平，HE染色观察各组大鼠脊髓损伤组织病理形态表现，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测各组大鼠脊髓损伤组织中白细胞介素（IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平，Western blotting法检测各组大鼠脊髓损伤组织中胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、神经蛋白聚糖（Neurocan）和波形蛋白（Vimentin）表达水平，免疫荧光法检测各组大鼠脊髓损伤组织中星形胶质细胞活化标志物GFAP蛋白表达情况。 结果 与假手术组比较，SCI组大鼠脊髓组织损伤明显，斜板角度和BBB评分明显降低（P<0.05），脊髓损伤组织中circ_ITCH表达水平明显降低（P<0.05），IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显升高（P<0.05），GFAP、Neurocan和Vimentin蛋白表达水平及GFAP蛋白荧光强度明显升高（P<0.05）。与SCI组比较，AAV- circ_ITCH组大鼠脊髓组织损伤明显改善，斜板角度和BBB评分明显升高（P<0.05），脊髓损伤组织中circ_ITCH表达水平明显升高（P<0.05），IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显降低（P<0.05），GFAP、Neurocan和Vimentin蛋白表达水平及GFAP蛋白荧光强度明显降低（P<0.05）；AAV-NC组以上指标差异均无统计学意义（P>0.05）。 结论 过表达circ_ITCH可减轻脊髓损伤大鼠的脊髓组织损伤，促进大鼠运动功能恢复，其机制可能与抑制神经炎症和星形胶质细胞活化有关。

Abstract

Objective To discuss the promotion effect of overexpression of circular RNA （circRNA）_ITCH on spinal cord injury （SCI） in the rats， and to clarify its possible mechanism. Methods The rat model of SCI was established by modified Allen’s method. The successfully modeled rats were randomly divided into sham operation group， SCI model group （SCI group）， empty adeno-associated virus group （AAV-NC group） and circ_ITCH overexpression adeno-associated virus group （AAV-circ_ITCH group）， with 15 rats in each group. Microsyringe was used to inject 6 μL of AAV-circ_ITCH and AAV-NC into the injured spinal cord of rats for intervention， and the rats in sham group and SCI group were injected with the same volume of normal saline. Inclined plane test and BBB locomotor rating scale were used to evaluate the hind limb motor function of rats in various groups； real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression levels of circ_ITCH in the spinal cord injury tissue of rats in various groups； HE staining was used to observe the pathomorphological manifestations of the spinal cord injury tissue of the rats in various groups； enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the levels of interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in spinal cord injury tissue of the rats in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of glial fibrillary acidic protein （GFAP）， neurocan and vimentin proteins in spinal cord injury tissue of the rats in various groups； immunofluorescence method was used to detect the expression of GFAP protein， a marker of astrocyte activation， in the spinal cord injury tissue of rats in various groups. Results Compared with sham operation group， the rats in SCI group showed obvious spinal cord tissue injury， the inclined plane angle and BBB score were significantly decreased （P<0.05）， the expression level of circ_ITCH in the spinal cord injury tissue was significantly decreased （P<0.05）， the levels of IL-1β， IL-6 and TNF-α were significantly increased （P<0.05）， and the expression levels of GFAP， neurocan and vimentin proteins as well as the fluorescence intensity of GFAP protein were significantly increased （P<0.05）. Compared with SCI group， the rats in AAV-circ_ITCH group showed significantly ameliorated spinal cord tissue injury， the inclined plane angle and BBB score were significantly increased （P<0.05）， the expression level of circ_ITCH in the spinal cord injury tissue was significantly increased （P<0.05）， the levels of IL-1β， IL-6 and TNF-α were significantly decreased （P<0.05）， and the expression levels of GFAP， neurocan and vimentin proteins as well as the fluorescence intensity of GFAP protein were significantly decreased （P<0.05）； in AAV-NC group， there were no statistically significant differences in the above indicators （P>0.05）. Conclusion Overexpression of circ_ITCH can alleviate spinal cord tissue injury in the rats with SCI and promote the recovery of motor function in the rats； its mechanism may be related to inhibiting neuroinflammation and astrocyte activation.

Graphical abstract

关键词

脊髓损伤 / 环状RNA_ITCH / 星形胶质细胞 / 神经功能 / 运动功能

Key words

Spinal cord injury / Circular RNA_ITCH / Astrocytes / Neurological function / Motor function

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是常见的创伤性疾病，通常由于脊柱遭遇外伤导致骨折和椎骨脱位，损伤初期以神经实质破坏和出血等症状为特征，随着时间的延长，神经组织内的机械和生理变化将激活一系列继发损伤^［1］。全球有200~300万人因运动和机动车事故等为常见原因患SCI，并遗留相关残疾，严重威胁患者的身心健康^［2］。相关研究^［3-4］显示：损伤脊髓神经元再生能力的减弱和炎性细胞浸润导致的胶质瘢痕形成，是影响轴突再生的重要因素，抑制星形胶质细胞活化形成胶质瘢痕是治疗SCI的有效途径。环状RNA（cicular RNA，circRNA）是一类表达稳定、不易降解的特殊 非 编 码 RNA，近 年 来，circRNA- 微 小 RNA（microRNA，miRNA）-信使RNA（messenger RNA，mRNA）的相互竞争或结合在疾病中发挥作用引起人们的关注。研究^［5］显示：circRNA在中枢神经系统中大量表达，参与神经发育、退变和轴突生长等过程，多种circRNA可抑制星形胶质细胞活化。其中circ_ITCH与免疫调节、肿瘤发生和炎症反应等生物学功能有关，可改善慢性肾小球肾炎中的肾功能障碍和炎症损伤，并抑制膀胱癌细胞增殖及迁移等关键病理进程^［6-7］。但circ_ITCH是否可改善SCI后的神经损伤，目前尚未完全阐明。本研究通过构建SCI大鼠模型，探讨过表达circ_ITCH对SCI的作用及其可能的机制，为SCI的早期治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1　实验动物、病毒、主要试剂和仪器

60只SPF级SD雄性大鼠，8周龄，体质量200~220 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2024-0001，实验动物使用许可证号：SYXK（鄂）2022-0124。动物分笼饲养，温度22 ℃~24 ℃，相对湿度40%~70%，自由进食饮水。本研究获得武汉贝赛模式生物中心实验动物福利伦理委员会的批准，批准号：BSMS动（福）第2024-11-22A号。circ_ITCH过表达腺相关病毒（AAV-circ_ITCH）及其空载腺相关病毒（AAV-NC）购自和元生物技术（上海）股份有限公司。胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、神经蛋白聚糖（Neurocan）和波形蛋白（Vimentin）抗体购自英国Abcam公司，HE染液购自武汉赛维尔生物科技有限公司，TransScript^® Green One-Step qRT-PCR SuperMix试剂盒购自北京全式金生物技术股份有限公司，白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒购自南京建成生物工程有限公司。微量注射器（规格：10 μL）购自德国Hamilton公司，多功能酶标仪（型号：SpectraMax iD3）购自美国MolecularDevices公司，实时荧光定量PCR（real-time florescence quantitative PCR，RT-qPCR）系统和凝胶成像系统（型号：QuantStudio^TM 3，iBright^TM CL750）购自美国Thermo公司。

1.2　SCI模型的制备、分组和处理

参考文献［8］方法，采用改良Allen’s打击法建立SCI模型，3%异氟烷吸入麻醉大鼠，于背部去毛备皮，做切口暴露T8~T10节段棘突及椎板，咬骨钳咬除T8~T10节段棘突及椎板，暴露T10脊髓。采用10 g冲击器在30 mm处自由下落，打击T10神经节段，以撞击瞬间大鼠下肢扑动、鼠尾迅速来回摆动及脊髓损伤处缺血水肿提示造模成功。将造模成功大鼠随机分为SCI模型组（SCI组）、AAV-NC组和AAV-circ_ITCH组，另设置仅暴露脊髓未经打击损伤的大鼠作为假手术组，每组15只。造模后立即使用微量注射器分别向AAV-NC组和AAV-circ_ITCH组大鼠脊髓损伤处注射2 μL AAV-NC^［9］或AAV-circ_ITCH进行干预，假手术组和SCI组大鼠注射等量生理盐水。术后28 d处死大鼠，取材进行相关检测。

1.3　斜板实验和BBB运动评定量表评估各组大鼠后肢运动功能

于术后第1、3、7、14和21天，采用斜板实验和BBB运动评定量表评估各组大鼠后肢运动功能。斜板实验：参考文献［10］方法，将大鼠置于40°倾斜的木板上适应1 min，正式实验开始后，每当大鼠可在当前角度的木板上坚持5 s不滑落时增加木板斜度，每次增加5°，直至大鼠在5 s内滑落，每只大鼠每角度重复5次，记录3次以上坚持5 s时的最大斜度。BBB运动评定量表评分：参考文献［11］方法，观察各组大鼠后肢关节运动能力及协调能力等，并进行评分，后肢完全瘫痪记0分，后肢运动功能完全正常记21分，后肢运动能力损伤越严重则分数越低。

1.4　RT-qPCR法检测各组大鼠脊髓损伤组织中circ_ITCH表达水平

取各组大鼠损伤处脊髓组织，放入预冷的研磨管中，加入TRIzol溶液和研磨珠，于冰上充分研磨至无可见组织块，离心后白色沉淀即为RNA，使用一步法RT-qPCR试剂盒将RNA反转录为cDNA，反应程序：25 ℃、5 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 s，配置含有预混液、cDNA、无酶水和引物PCR反应体系进行扩增，95 ℃、15 s变性，60 ℃、30 s退火或延伸，共40个循环。引物序列：circ_ITCH上游引物5'-GCAGA-GGCCAACACTGGAA-3'，下游引物5'-TCCTT-GAAGCTGACTACGCTGAG-3'；GAPDH上游引物5'-CCAGGTGGTCTCCTCTGA-3'，下游引物5'-GCTGTAGCCAAATCGTTGT-3'。采用2^-△△Ct法计算各组大鼠脊髓组织中circ_ITCH表达水平。

1.5　HE染色观察各组大鼠脊髓损伤组织病理形态表现

将各组大鼠脊髓组织切片脱蜡至水，放入苏木素染液中染色3 min，自来水冲洗，再经苏木素分化、返蓝，加入伊红染液中染色5 min，无水乙醇脱水5 min，二甲苯透明5 min，中性树胶封片、镜检，观察各组大鼠脊髓损伤组织病理形态表现。

1.6　采用试剂盒检测各组大鼠脊髓损伤组织中IL-1β、IL-6和TNF-α水平

取各组大鼠损伤处脊髓组织，加入预冷的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）充分匀浆，4 000 r·min^-1离心5 min后取上清，按照试剂盒说明书操作，酶标仪检测各孔吸光度（A）值，根据标准孔结果绘制标准曲线，计算各组大鼠脊髓损伤组织中IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.7　Western blotting法检测各组大鼠脊髓损伤组织中GFAP、Neurocan和Vimentin蛋白表达水平

取各组大鼠损伤处脊髓组织，放入预冷的研磨管中，加入10倍体积裂解液和研磨珠，充分研磨后于冰上继续裂解30 min，12 000 r·min^-1离心10 min后取上清，即为总蛋白溶液，BCA法测定蛋白浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）（恒压200 V，30 min）分离蛋白，然后转至乙醇活化后的PVDF膜上（转膜条件：恒流300 mA，30 min），加入5%脱脂牛奶室温封闭30 min，倒掉封闭液，加入1∶1 000稀释的一抗溶液（兔抗GFAP、Neurocan、Vimentin和GAPDH）慢摇过夜，回收一抗，加入1∶5 000稀释的HRP标记二抗室温孵育30 min，回收二抗，用TBST溶液洗膜3次，加入预配制的增强型化学发光试剂（enhanced chemiluminescence，ECL）溶液进行化学发光。使用凝胶成像系统对条带进行图像采集，分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.8　免疫荧光法检测各组大鼠脊髓损伤组织中GFAP蛋白荧光强度

取各组大鼠损伤处脊髓组织作冰冻切片，于37 ℃烘箱中烘烤10 min，控干水分后固定液固定。柠檬酸和乙二胺四乙酸（ethlene diamine tetracetic acid，EDTA）修复抗原，滴加胎牛血清封闭30 min，加入1∶5 000稀释的一抗（兔抗GFAP）4 ℃孵育过夜，加入1∶10 000稀释的CY3标记二抗，室温孵育1 h，DAPI复染细胞核10 min，淬灭组织自发荧光后封片，荧光显微镜下观察阳性结果，使用Image-Pro Plus软件分析图像积分光密度（integrated optical density，IOD）值，以IOD代表GFA蛋白荧光强度。

1.9　统计学分析

采用SPSS 26.0软件进行数据统计学分析。各组大鼠斜板角度和BBB评分，各组大鼠骨髓损伤组织中circ_ITCH表达水平，IL-1β、IL-6和TNF-α水平以及GFAP、Neurocan和Vimentin蛋白表达水平及GFAP蛋白荧光强度均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　各组大鼠斜板角度和BBB评分

与假手术组比较，SCI组大鼠术后第1、3、7、14和21天斜板角度和BBB评分明显降低（P<0.05）；与SCI组比较，AAV-circ_ITCH组大鼠术后第3、7、14和21天斜板角度和BBB评分明显升高（P<0.05），AAV-NC组各时间点上述指标差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。

2.2　各组大鼠脊髓损伤组织中circ_ITCH表达水平

与假手术组（1.00±0.02）比较，SCI组大鼠脊髓损伤组织中circ_ITCH表达水平（0.56±0.03）明 显 降 低（P<0.05）；与SCI 组 比 较，AAV-circ_ITCH组大鼠脊髓损伤组织中circ_ITCH表 达 水 平（1.65±0.07）明 显 升 高（P<0.05），AAV-NC组大鼠脊髓损伤组织中circ_ITCH表达水平（0.52±0.02）差异无统计学意义（P>0.05）。上述结果表明，circ_ITCH低表达可能与SCI的恶性进展有关。

2.3　各组大鼠脊髓损伤组织病理形态表现

假手术组大鼠脊髓损伤组织灰质与白质界限清晰，神经元形态正常、结构完整，未见明显病理学改变。SCI组和AAV-NC组大鼠脊髓损伤组织灰质与白质界限模糊，损伤区可见大量细胞碎片及白质区域疏松、缺损，伴有红细胞淤积及炎性细胞浸润，神经元表现为尼氏体消失和胞体固缩等退化特征。AAV-circ_ITCH组大鼠脊髓组织损伤程度较SCI组有明显改善，髓鞘结构相对完整。见图2。

2.4　各组大鼠脊髓损伤组织中IL-1β、IL-6和TNF-α水平

与假手术组比较，SCI组大鼠脊髓损伤组织中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显升高（P<0.05）；与SCI组比较，AAV-circ_ITCH组大鼠脊髓损伤组织中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显降低（P<0.05），AAV-NC组大鼠脊髓损伤组织中上述指标差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.5　各组大鼠脊髓损伤组织中GFAP、Neurocan和Vimentin蛋白表达水平

与假手术组比较，SCI组大鼠脊髓损伤组织中GFAP、Neurocan和Vimentin蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；与SCI组比较，AAV-circ_ITCH组大鼠脊髓损伤组织中GFAP、Neurocan和Vimentin蛋白表达水平明显降低（P<0.05），AAV-NC组大鼠脊髓损伤组织中上述指标差异无统计学意义（P>0.05）。见图3和表2。

2.6　各组大鼠脊髓损伤组织中GFAP蛋白荧光强度

与假手术组（1 045.12±136.99）比较，SCI组大鼠脊髓损伤组织中GFAP蛋白荧光强度（5 389.00± 453.79）明 显 升 高（P<0.05）；与SCI组比较，AAV-circ_ITCH组大鼠脊髓损伤组织中GFAP蛋白荧光强度（2 933.83±138.63）明显降低（P<0.05），AAV-NC组大鼠脊髓损伤组织中GFAP蛋白荧光强度（4 767.30±424.85）差异无统计学意义（P>0.05）。见图4。

3 讨 论

损伤导致的脊髓血管供应中断或低血压灌注不足可能使SCI患者出现心动过缓乃至神经源性休克等严重临床表现，损伤部位的持续增大和囊肿形成也是SCI的标志性特征，致使约三分之一的患者出现脊髓空洞，随着时间的推移，逐渐发展为四肢感觉麻痹、痉挛和僵硬^［12-13］。基础实验阶段，因在脊髓病理学和恢复方面特征与人类最为相似，大鼠SCI模型成为评估不同实验治疗策略的主要研究对象，造模方法主要为压迫或挫伤脊髓^［14］。本研究采用冲击器从高处自由落下打击大鼠T10神经阶段，以模拟各种形式的物理冲击压碎人骨管并压迫脊髓，导致其运动功能和自主神经功能受损。本研究结果显示：与假手术组比较，SCI组大鼠斜板角度和BBB评分明显降低，同时脊髓损伤区白质中存在大量细胞碎片和空洞形成，神经元损伤明显，提示造模成功。circ_ITCH作为关键的细胞调节因子参与多种脊椎相关疾病的病理过程，如椎间盘退变患者髓核组织中circ_ITCH表达水平较正常受试者明显升高，过表达circ_ITCH可抑制髓核细胞增殖^［15］；但其在SCI中的作用尚未明确。本研究结果显示：与假手术组比较，SCI组大鼠脊髓损伤组织 中 circ_ITCH 表 达 水 平 明 显 降 低，过 表 达circ_ITCH可提高SCI大鼠斜板角度和BBB评分，修复脊髓组织病理损伤。

SCI原发性损伤持续数周后会引发继发性损伤，包括血管损伤、水肿、炎症、纤维胶质细胞瘢痕和囊肿形成等，组织中的恶劣环境使得神经元难以再生，导致疾病的持续恶化^［16-18］。其中IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性细胞因子的释放和渗透促进神经元的炎症损伤，同时，病变周围的肥大反应性星形胶质细胞聚集形成胶质细胞瘢痕，成为物理屏障抑制轴突生长^［19-21］。反应性星形胶质细胞堆积的特征通常是星形胶质细胞标志物GFAP数量的增加及激活星形胶质细胞标志物Vimentin和胶质瘢痕相关蛋白Neurocan等表达水平升高^［21-23］。KAN等^［24］研究发现：白藜芦醇治疗可促进脊髓损伤修复并减少神经胶质增生面积，表现为IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性细胞因子水平的降低和脊髓中GFAP表达的减少。本研究结果显示：与假手术组比较，SCI组大鼠脊髓损伤组织中IL-1β、IL-6和TNF-α水平以及GFAP、Neurocan和Vimentin蛋白表达水平明显升高，提示神经炎症和星形胶质细胞的激活可能抑制神经元再生，使SCI难以被修复，与KAN等^［21］研究结果一致。而过表达circ_ITCH可明显降低SCI大鼠脊髓组织中IL-1β、IL-6 和 TNF-α 水 平 以 及 GFAP、 Neurocan 和Vimentin蛋白表达水平，提示circ_ITCH可能是通过抑制神经炎症和星形胶质细胞活化起到SCI的改善作用。

综上所述，本研究从动物水平验证了过表达circ_ITCH可改善SCI导致的大鼠运动功能障碍和脊髓组织的病理学改变，其途径可能与抑制神经炎症和星形胶质细胞活化有关，但该过程中是否涉及其他分子机制，目前尚未明确。本课题组下一步将通过生物信息学分析寻找circ_ITCH下游与SCI相关的靶基因，并分别从体内和体外水平进行验证，以完善机制研究，旨在为circ_ITCH作为治疗SCI的新靶点提供更多数据支持。

参考文献

[1] IZZY S. Traumatic spinal cord injury［J］. Continuum （Minneap Minn）， 2024， 30（1）： 53-72.

[2] QUADRI S A， FAROOQUI M， IKRAM A， et al. Recent update on basic mechanisms of spinal cord injury［J］. Neurosurg Rev， 2020， 43（2）： 425-441.

[3] REYES C， MOKALLED M H. Astrocyte-neuron interactions in spinal cord injury［J］. Adv Neurobiol， 2024， 39： 213-231.

[4] XU J H， FANG S， DENG S X， et al. Generation of neural organoids for spinal-cord regeneration via the direct reprogramming of human astrocytes［J］. Nat Biomed Eng， 2023， 7（3）： 253-269.

[5] LONG C M， LI Z， SONG W， et al. The roles of non-coding RNA targeting astrocytes in cerebral ischemia［J］. Mol Neurobiol， 2024， 61（8）： 5814-5825.

[6] WANG D， GAO Q， HUANG S J， et al. Circular E3 ubiquitin-protein ligase improves renal function and alleviates inflammation and renal injury in chronic glomerulonephritis rats via the microRNA-146a-5p/tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein gamma axis［J］. J Physiol Pharmacol， 2024， 75（3）： 327-337.

[7] YANG F， GUO Z F， WU J W， et al. Circ-ITCH inhibits bladder cancer progression through miR-184/FOXO3 axis［J］. Am J Transl Res， 2024， 16（12）： 7911-7923.

[8] LI S L， ZHOU J B， ZHANG J J， et al. Construction of rat spinal cord injury model based on Allen’s animal model［J］. Saudi J Biol Sci， 2019， 26（8）： 2122-2126.

[9] QIN C， LIU Y， XU P P， et al. Inhibition by rno-circRNA-013017 of the apoptosis of motor neurons in anterior horn and descending axonal degeneration in rats after traumatic spinal cord injury［J］. Front Neurosci， 2022， 16： 1065897.

[10] RIVLIN A S， TATOR C H. Objective clinical assessment of motor function after experimental spinal cord injury in the rat［J］. J Neurosurg， 1977， 47（4）： 577-581.

[11] BASSO D M， BEATTIE M S， BRESNAHAN J C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats［J］. J Neurotrauma， 1995， 12（1）： 1-21.

[12] ANJUM A， YAZID M D， FAUZI DAUD M， et al. Spinal cord injury： pathophysiology， multimolecular interactions， and underlying recovery mechanisms［J］. Int J Mol Sci， 2020， 21（20）： 7533.

[13] 方 露， 谢财忠， 王红星， 等. 脊髓损伤后痉挛的机制及其治疗研究进展［J］. 中国康复医学杂志， 2020， 35（1）： 112-118.

[14] FRANTSUZOV R， MONDAL S， WALSH C M， et al. A finite element model of contusion spinal cord injury in rodents［J］. J Mech Behav Biomed Mater， 2023， 142： 105856.

[15] ZHANG F， LIN F L， XU Z W， et al. Circular RNA ITCH promotes extracellular matrix degradation via activating Wnt/β-catenin signaling in intervertebral disc degeneration［J］. Aging， 2021， 13（10）： 14185-14197.

[16] 刘京松， 史 旭， 万 然， 等. 外泌体及其在继发性脊髓损伤中作用的研究进展［J］. 中国脊柱脊髓杂志， 2020， 30（1）： 71-75.

[17] 唐润妍， 惠首智， 张 明， 等. PD1基因敲除加重小鼠脊髓损伤后继发性损伤的研究［J］. 神经解剖学杂志， 2021， 37（5）： 517-524.

[18] 刘丹丹， 秦合伟， 高 洋， 等. 干细胞调控巨噬细胞极化缓解脊髓损伤的研究进展［J］. 解放军医学杂志， 2025， 50（9）： 1195-1208.

[19] CLIFFORD T， FINKEL Z， RODRIGUEZ B， et al. Current advancements in spinal cord injury research-glial scar formation and neural regeneration［J］. Cells， 2023， 12（6）： 853.

[20] 刘 曌， 王丽君， 万东君. 抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白IgG抗体相关疾病的临床特征分析［J］. 中风与神经疾病杂志， 2025， 42（3）： 233-238.

[21] CAI J J， KONG J D， MA S， et al. Upregulation of TRPC6 inhibits astrocyte activation and proliferation after spinal cord injury in rats by suppressing AQP4 expression［J］. Brain Res Bull， 2022， 190： 12-21.

[22] 石 美， 汤云萍， 刘绛巍， 等. HIF-1α通过调控TRPV通道对细胞功能的影响［J］. 中国兽医学报， 2025， 45（8）： 1784-1791， 1800.

[23] CHEN K Z， LIU S X， LI Y W， et al. Vimentin as a potential target for diverse nervous system diseases［J］. Neural Regen Res， 2023， 18（5）： 969-975.

[24] KAN S L， LIU C J， ZHAO X Y， et al. Resveratrol improves the prognosis of rats after spinal cord injury by inhibiting mitogen-activated protein kinases signaling pathway［J］. Sci Rep， 2023， 13（1）： 19723.

基金资助

湖北省科技厅自然科学基金一般面上项目(2023AFB994)