沉默XBP1通过调控Nrf2介导的铁死亡对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的影响

Effect of silencing XBP1 on recovery of neurological function in rats with spinal cord injury by regulating Nrf2-mediated ferroptosis

摘要

目的 探讨沉默X盒结合蛋白1（XBP1）对脊髓损伤（SCI）大鼠神经功能恢复的影响，并阐明其可能的作用机制。 方法 将75只体质量为200~240 g的雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组（SCI组）、阴性对照慢病毒组（sh-NC组）、XBP1基因沉默组（sh-XBP1组）和sh-XBP1+核因子E2相关因子2（Nrf2）抑制剂ML385组（sh-XBP1+ML385组），每组15只。采用改良Allen’s法制备大鼠SCI模型，给予脊髓内注射相应慢病毒和腹腔注射ML385干预。采用BBB运动功能评分和旷场实验评估各组大鼠后肢运动功能，HE染色观察各组大鼠脊髓组织病理形态表现，免疫荧光法检测各组大鼠脊髓组织中神经元特异性标志物神经元核蛋白（NeuN）表达水平，试剂盒法检测各组大鼠脊髓组织中丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）水平及超氧化物歧化酶（SOD）活性，试剂盒检测各组大鼠脊髓组织中亚铁离子（Fe²⁺）水平，Western blotting法检测各组大鼠脊髓组织中XBP1、Nrf2、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和溶质载体超家族7成员11（SLC7A11）蛋白表达水平。 结果 BBB运动功能评分和旷场实验，与假手术组比较，术后第7、14、21和28天SCI组大鼠BBB运动功能评分和旷场实验总移动距离明显降低（P<0.01）；与SCI组比较，术后第14、21和28天sh-XBP1组大鼠BBB运动功能评分和旷场实验总移动距离明显升高（P<0.05或P<0.01）；与sh-XBP1组比较，术后第21和28天sh-XBP1+ML385组大鼠BBB运动功能评分和旷场实验总移动距离明显降低（P<0.01）。HE染色，假手术组大鼠脊髓组织结构完整，染色均匀清晰；SCI组、sh-NC组和sh-XBP1+ML385组大鼠脊髓组织损伤严重，有水肿现象，神经细胞分布杂乱，形态、数量异常；sh-XBP1组大鼠脊髓组织结构较完整，神经细胞状态明显改善。免疫荧光法，与假手术组比较，SCI组大鼠脊髓组织中NeuN蛋白表达水平明显降低（P<0.01）；与SCI组比较，sh-XBP1组大鼠脊髓组织中NeuN蛋白表达水平明显升高（P<0.01）；与sh-XBP1组比较，sh-XBP1+ML385组大鼠脊髓组织中NeuN蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。试剂盒检测法，与假手术组比较，SCI组大鼠脊髓组织中MDA和Fe²⁺水平明显升高（P<0.01），GSH水平和SOD活性明显降低（P<0.01）；与SCI组比较，sh-XBP1组大鼠脊髓组织中MDA和Fe²⁺水平明显降低（P<0.01），GSH水平和SOD活性明显升高（P<0.01）；与sh-XBP1组比较，sh-XBP1+ML385组大鼠脊髓组织中MDA和Fe²⁺水平明显升高（P<0.01），GSH水平和SOD活性明显降低（P<0.01）。Western blotting法，与假手术组比较，SCI组大鼠脊髓组织中XBP1蛋白表达水平明显升高（P<0.01），Nrf2、GPX4和SLC7A11蛋白表达水平明显降低（P<0.01）；与SCI组比较，sh-XBP1组大鼠脊髓组织中XBP1蛋白水平明显降低（P<0.01），Nrf2、GPX4和SLC7A11蛋白表达水平明显升高（P<0.01）；与sh-XBP1组比较，sh-XBP1+ML385组大鼠脊髓组织中Nrf2、GPX4和SLC7A11蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。 结论 XBP1基因沉默可以促进SCI大鼠神经功能恢复，其作用机制可能与上调Nrf2表达、抑制脊髓组织神经细胞铁死亡有关。

Abstract

Objectives To discuss the effect of silencing X-box binding protein 1 （XBP1） on neurological functional recovery in the rats with spinal cord injury （SCI）， and to clarify its possible mechanism. Methods Seventy-five male SD rats with body mass of 200-240 g were randomly divided into sham operation group， model group （SCI group）， negative control lentivirus group （sh-NC group）， XBP1 gene silencing group （sh-XBP1 group）， and sh-XBP1+nuclear factor E2-related factor 2 （Nrf2） inhibitor ML385 group （sh-XBP1+ML385 group）， with 15 rats in each group. The modified Allen’s method was used to establish the SCI models of rats； the corresponding lentivirus were injected into the spinal cord and ML385 was intraperitoneally injected for intervention. BBB motor function score and open field test were used to evaluate the hindlimb motor function of the rats in various groups； HE staining was used to observe the histopathological morphology of spinal cord tissue of the rats in various groups； immunofluorescence method was used to observe the expression levels of neuronal specific marker neuronal nuclear protein （NeuN） in spinal cord tissue of the rats in various groups； kits was used to detect the levels of malondialdehyde （MDA） and glutathione （GSH） and the activities of superoxide dismutase （SOD） in spinal cord tissue of the rats in various groups； a kit was used to detect the levels of ferrous ion （Fe²⁺） in spinal cord tissue of the rats in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of XBP1， Nrf2， glutathione peroxidase 4 （GPX4）， and solute carrier super family 7 member 11 （SLC7A11） proteins in spinal cord tissue of the rats in various groups. Results The BBB motor function score and open field test results showed that compared with sham operation group， the BBB motor function scores and total moving distances in open field test of the rats in SCI group were significantly decreased at 7， 14， 21， and 28 d after surgery （P<0.01）； compared with SCI group， the BBB motor function scores and total moving distances in open field test of the rats in sh-XBP1 group were significantly increased at 14， 21， and 28 d after surgery （P<0.05 or P<0.01）； compared with sh-XBP1 group， the BBB motor function scores and total moving distances in open field test of the rats in sh-XBP1+ML385 group were significantly decreased at 21 and 28 d after surgery （P<0.01）. The HE staining results showed that in sham operation group， the spinal cord tissue structure of the rats was intact， with uniform and clear staining； in SCI group， sh-NC group， and sh-XBP1+ML385 group， the spinal cord tissue of the rats was severely injured， with edema， disordered distribution of nerve cells， and abnormal morphology and number； in sh-XBP1 group， the spinal cord tissue structure of the rats was relatively intact， and the state of nerve cells was significantly improved. The immunofluorescence method results showed that compared with sham operation group， the expression level of NeuN protein in spinal cord tissue of the rats in SCI group was significantly decreased （P<0.01）； compared with SCI group， the expression level of NeuN protein in spinal cord tissue of the rats in sh-XBP1 group was significantly increased （P<0.01）； compared with sh-XBP1 group， the expression level of NeuN protein in spinal cord tissue of the rats in sh-XBP1+ML385 group was significantly decreased （P<0.05）. The ELISA and kit results showed that compared with sham operation group， the levels of MDA and Fe²⁺ in spinal cord tissue of the rats in SCI group were significantly increased （P<0.01）， and the level of GSH and the activity of SOD were significantly decreased （P<0.01）； compared with SCI group， the levels of MDA and Fe²⁺ in spinal cord tissue of the rats in sh-XBP1 group were significantly decreased （P<0.01）， and the level of GSH and the activity of SOD were significantly increased （P<0.01）； compared with sh-XBP1 group， the levels of MDA and Fe²⁺ in spinal cord tissue of the rats in sh-XBP1+ML385 group were significantly increased （P<0.01）， and the level of GSH and the activity of SOD were significantly decreased （P<0.01）. The Western blotting method results showed that compared with sham operation group， the expression level of XBP1 protein in spinal cord tissue of the rats in SCI group was significantly increased （P<0.01）， and the expression levels of Nrf2， GPX4， and SLC7A11 proteins were significantly decreased （P<0.01）； compared with SCI group， the expression level of XBP1 protein in spinal cord tissue of the rats in sh-XBP1 group was significantly decreased （P<0.01）， and the expression levels of Nrf2， GPX4， and SLC7A11 proteins were significantly increased （P<0.01）； compared with sh-XBP1 group， the expression levels of Nrf2， GPX4， and SLC7A11 proteins in spinal cord tissue of the rats in sh-XBP1+ML385 group were significantly decreased （P<0.01）. Conclusion Silencing of XBP1 gene can promote neurological functional recovery in the rats with SCI， and its mechanism may be related to up-regulation of Nrf2 expression and inhibition of ferroptosis in nerve cells of spinal cord tissue.

Graphical abstract

关键词

脊髓损伤 / X盒结合蛋白1 / 铁死亡 / 核因子E2相关因子2 / 神经细胞

Key words

Spinal cord injury / X-box binding protein 1 / Ferroptosis / Nuclear factor E2-related factor 2 / Nerve cells

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一类导致运动和感觉功能障碍的高致残性疾病，严重的SCI给患者及其家庭带来极大的身体及心理负担，如何治疗SCI现已成为全世界亟需解决的难题。既往研究^［1-2］显示：在脊髓受到外力冲击后，会造成受损区域局部血管损伤、神经细胞死亡和血脑屏障被破坏等，其中神经细胞死亡是SCI后神经损伤和神经功能障碍的关键决定因素。铁死亡是程序性细胞死亡的一种新型途径，研究^［3］发现：铁死亡与SCI的病理过程密切相关。ZHOU等^［4］研究显示：向SCI小鼠腹腔注射原花青素后，铁死亡相关因子水平明显降低，SCI小鼠运动功能明显改善，提示抑制细胞铁死亡可能是改善SCI的潜在有效途径。X盒结合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1）属于内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）通路相关蛋白，是一种未折叠蛋白反应元件的转录调控因子，与蛋白质折叠和内质网构建有密切关联。研究^［5］显示：XBP1是SCI中介导铁死亡的基因之一，表明XBP1可能在SCI后铁死亡进程中发挥关键的调控作用。核因子E2相关因子2（nuclear factor E 2-related factor 2，Nrf2）/溶质载体超家族7成员11（solute carrier super family 7 member 11，SLC7A11）/谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）信号通路参与介导细胞铁死亡，通过激活该细胞通路可以增强抗氧化能力，抑制细胞铁死亡的发生^［6］。LIU等^［7］研究显示：ERS可通过XBP1/滑膜细胞凋亡抑制物1（synovial apoptosis inhibitor 1，SYVN1/Hrd1）/Nrf2通路诱发铁死亡，进而加剧糖尿病肾病。提示XBP1可能通过诱发铁死亡加剧SCI后神经损伤，限制运动功能恢复，但能否通过调控XBP1抑制Nrf2介导的铁死亡从而治疗SCI目前尚未完全阐明。因此，本研究探讨沉默XBP1对SCI大鼠具有神经保护作用及其可能的作用机制，旨在为SCI的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1　实验动物、主要试剂和仪器

75只SPF级8周龄健康雄性SD大鼠，体质量为200~240 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2021-0002，实验动物使用许可证号：SYXK（湘）2024-0019。Nrf2抑制剂ML385购自美国MCE公司，HE染色试剂盒、丙二 醛（malondialdehyde， MDA）、 谷 胱 甘 肽（glutathione，GSH）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，亚铁离子（Fe²⁺）水平检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，神经元核蛋白（neuronal nuclei，NeuN）、XBP1、Nrf2、GPX4、SLC7A11和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体购自英国Abcam公司，XBP1干扰慢病毒（sh-XBP1）及其阴性对照（sh-NC）由上海吉玛制药技术有限公司提供。荧光显微镜购自日本Olympus公司，蛋白电泳仪购自美国Bio-Rad公司，高速离心机购于德国Eppendorf公司，多功能酶标仪购自美国Molecular Devices公司。

1.2　实验动物分组和模型制备

将大鼠随机分为假手术组、模型组（SCI组）、阴性对照慢病毒组（sh-NC组）、XBP1基因沉默组（sh-XBP1组）和sh-XBP1+Nrf2抑制剂ML385组（sh-XBP1+ML385组），每组15只。除假手术组外，其余各组大鼠采用改良Allen’s法建立SCI模型^［8］：麻醉大鼠后，俯卧位固定于无菌操作台，暴露T8~T10节段棘突及椎板，钝性分离T8~T10节段脊椎椎骨上的肌肉，咬骨钳咬除T8~T10节段棘突及椎板，暴露T10脊髓。选择20 g冲击器从30 mm处自由下落，打击T10神经节段，以撞击瞬间大鼠下肢扑动、鼠尾迅速来回摆动为造模成功。假手术组大鼠仅暴露脊髓后缝合。

1.3　给药方法

大鼠SCI后，根据分组要求使用微量注射器分别向sh-NC组、sh-XBP1组和sh-XBP1+ML385组大鼠损伤脊髓内注射5 μL sh-NC和sh-XBP1慢病毒（滴度：2.5×10⁹ TU·mL^-1），假手术组和SCI组大鼠注射相同剂量的生理盐水。sh-XBP1+ML385组大鼠需要额外腹腔注射30 mg·kg^-1 ML385^［9］，每日1次，连续干预4周，其余各组大鼠腹腔注射等次等剂量生理盐水。干预结束后，各组随机选取5只大鼠进行后肢运动功能评价，5只大鼠进行脊髓组织HE染色和免疫荧光检测，5只大鼠进行脊髓组织试剂盒检测和Western blotting法检测。

1.4　BBB运动功能评分和旷场实验评估各组大鼠后肢运动功能

于术前（0 d）和术后7、14、21及28 d，各组随机选取5只大鼠采用BBB运动功能评分和旷场实验，评估各组大鼠后肢运动功能。BBB评分：将大鼠置于设有挡板的平台适应10 min后，观察大鼠后肢运动情况，观察时长为5 min。0分为完全瘫痪，无法活动；21分为运动功能正常，分数越高代表后肢运动功能恢复越好。旷场实验：高强度隔音的环境中，记录大鼠于110 cm×110 cm的旷场内自由活动5 min的总移动距离。

1.5　HE染色观察各组大鼠脊髓组织病理形态表现

1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，取损伤脊髓段放入4%多聚甲醛固定48 h后进行常规包埋处理，制作4 μm脊髓组织石蜡切片。将各组大鼠脊髓组织石蜡切片脱蜡至水，苏木素染色3 min，水洗，再经分化、返蓝，伊红染液染色2 min，无水乙醇脱水，二甲苯透明，最后中性树胶封片，显微镜下观察各组大鼠脊髓组织病理形态表现。

1.6　免疫荧光法检测各组大鼠脊髓组织中神经元特异性标志物NeuN蛋白表达水平

取损伤脊髓组织，4%多聚甲醛浸泡过夜后进行OCT包埋制作石蜡切片。切片加入0.5% Triton X-100浸泡15 min，10%山羊血清封闭2 h，加入NeuN一抗工作液（1∶100稀释），4 ℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3次，避光环境下加入荧光素标记的二抗，室温孵育2 h，弃去二抗加入DAPI，室温孵育15 min，PBS缓冲液清洗3次后封片，荧光显微镜下观察并拍照。采用Image-Pro Plus图像分析软件分析图像的积分光密度 （integrated optical density， IOD）值， 以IOD代表大鼠脊髓组织中NeuN蛋白表达水平。

1.7　采用试剂盒检测各组大鼠脊髓组织中MDA、GSH和Fe²⁺水平及SOD活性

取各组大鼠脊髓组织匀浆上清液，设置空白对照孔，参照试剂盒说明书进行预实验确定最佳稀释浓度后正式开始实验。分别于酶标仪波长535 nm、412 nm、593 nm和450 nm处检测吸光度（A）值，以A值为纵坐标，标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，计算各组大鼠脊髓组织中MDA（μmol·g^-1）、GSH（μmol·g^-1）和Fe²⁺（μmol·g^-1）水平及SOD活性（μ·mg^-1）。

1.8　Western blotting法检测各组大鼠脊髓组织中XBP1、Nrf2、GPX4和SLC7A11蛋白表达水平

脊髓组织经PBS缓冲液冲洗后，加入裂解液低温匀浆，离心取上清，BCA法检测蛋白浓度。蛋白样本经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、转膜后TBST溶液清洗2次，置于封闭液中室温封闭1 h。加入XBP1、Nrf2、GPX4、SLC7A11和GAPDH一抗工作液（1∶1 000稀释），于摇床上4 ℃孵育过夜，加二抗稀释液（1∶1 000稀释）室温孵育1 h，TBST溶液清洗，滴加ECL化学发光液显影，采用Image J图像分析软件分析蛋白条带灰度值，以GAPDH 为 内 参，计 算 XBP1、 Nrf2、 GPX4 和SLC7A11蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.9　统计学分析

采用SPSS 26.0统计软件进行统计学分析，GraphPad Prism 8.0软件绘制图像。各组大鼠BBB运动功能评分和旷场实验总移动距离，大鼠脊髓组织中MDA、GSH和Fe²⁺水平及SOD活性，大鼠脊髓组织中XBP1和铁死亡相关蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示。多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　各组大鼠后肢运动功能评价

术后第7、14、21和28天，与假手术组比较，SCI组大鼠BBB运动功能评分和旷场实验总移动距离明显降低（P<0.01）。术后第14天，与SCI组比较，sh-XBP1组大鼠BBB运动功能评分差异无统计学意义（P>0.05），旷场实验总移动距离明显升高（P<0.05）。术后第21天，与SCI组比较，sh-XBP1组大鼠BBB运动功能评分和旷场实验总移动距离明显升高（P<0.01）； 与sh-XBP1组比较， sh-XBP1+ML385组大鼠BBB运动功能评分明显降低（P<0.01）。术后第28天，与SCI组比较，sh-XBP1组大鼠BBB运动功能评分和旷场实验总移动距离明显升高（P<0.01）；与sh-XBP1组比较，sh-XBP1+ML385组大鼠BBB运动功能评分和旷场实验总移动距离明显降低（P<0.05或P<0.01）。见图1。

2.2　各组大鼠脊髓组织病理形态表现

假手术组大鼠脊髓组织结构完整，染色均匀清晰，神经细胞形态正常，未见明显空泡或水肿现象。SCI组和sh-NC组大鼠脊髓组织损伤严重，组织疏松，有水肿现象，神经细胞分布杂乱，数量异常，可见大量空泡形成。sh-XBP1组大鼠脊髓组织结构较完整，神经细胞状态明显改善，水肿范围缩小，空泡现象减少。sh-XBP1+ML385组大鼠脊髓组织病理损伤较sh-XBP1组加重，神经细胞分布较杂乱，可见空泡现象。见图2。

2.3　各组大鼠脊髓组织中NeuN蛋白表达水平

免疫荧光法检测结果显示：与假手术组（33.57±1.86）比较，SCI组大鼠脊髓组织中NeuN蛋白表达水平（15.15±2.03）明显降低（P<0.01）。与SCI组比较，sh-XBP1组大鼠脊髓组织中NeuN蛋白表达水平（20.58±2.13）明显升高（P<0.01），sh-NC组大鼠脊髓组织中NeuN蛋白表达水平（14.46±1.72）差异无统计学意义（P > 0.05）。与 sh-XBP1 组 比 较， sh-XBP1+ML385组大鼠脊髓组织中NeuN蛋白表达水平（17.43±1.80）明显降低（P<0.05）。见图3。

2.4　各组大鼠脊髓组织中MDA和GSH水平及SOD活性

ELISA法检测结果显示：与假手术组比较，SCI组大鼠脊髓组织中MDA水平明显升高（P<0.01），GSH水平和SOD活性明显降低（P<0.01）。与SCI组比较，sh-XBP1组大鼠脊髓组织中MDA水平明显降低（P<0.01），GSH水平和SOD活性明显升高（P<0.01）；sh-NC组差异无统计学意义（P>0.05）。与sh-XBP1组比较，sh-XBP1+ML385组大鼠脊髓组织中MDA水平明显升高（P<0.01），GSH水平和SOD活性明显降低（P<0.01）。见表1。

2.5　各组大鼠脊髓组织中Fe²⁺水平

与假手术组（10.21 μmol·g^-1±1.05 μmol·g^-1）比较，SCI组大鼠 脊 髓 组 织 中 Fe²⁺ 水 平（19.68 μmol·g^-1 ± 1.83 μmol·g^-1）明显升高（P<0.01）。与SCI组比较，sh-XBP1组大鼠脊髓组织中Fe²⁺水平（12.63 μmol·g^-1±1.09 μmol·g^-1）明显降低（P<0.01），sh-NC组（20.02 μmol·g^-1±1.96 μmol·g^-1）差异无统计学意义 （P>0.05）。与sh-XBP1组比较，sh-XBP1+ML385组大鼠脊髓组织中Fe²⁺水平（18.72 μmol·g^-1±1.24 μmol·g^-1）明显升高（P<0.01）。

2.6　各组大鼠脊髓组织中XBP1、Nrf2、GPX4和SLC7A11蛋白表达水平

Western blotting法检测结果显示：与假手术组比较，SCI组大鼠脊髓组织中XBP1蛋白表达水平明显升高（P<0.01），Nrf2、GPX4和SLC7A11蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。与SCI组比较，sh-XBP1组大鼠脊髓组织中XBP1蛋白表达水平明显降低（P<0.01），Nrf2、GPX4和SLC7A11蛋白表达水平明显升高（P<0.01）；sh-NC组差异无统计学意义（P>0.05）。与sh-XBP1组比较，sh-XBP1+ML385组大鼠脊髓组织中XBP1蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05），Nrf2、GPX4和SLC7A11蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。见图4。

3 讨 论

SCI是一种高致残率和死亡率的神经中枢系统疾病，近年来，全球范围内SCI的发病率正逐年上升。病理生理学将SCI分为原发性损伤和继发性损伤，原发性损伤主要源于外力撞击导致的脊髓出血和细胞坏死，在继发性损伤阶段，细胞在促凋亡因子等调控机制的作用下出现功能障碍或死亡，并伴有炎性细胞浸润和细胞肿胀等过程^［11］，抑制细胞死亡在SCI的治疗中起着至关重要的作用。XBP1是一种参与未折叠蛋白反应的转录因子，是ERS途径的关键信号调控蛋白。XBP1参与SCI的病程发展，符禹玄等^［12］研究发现：移植神经调节蛋白1基因修饰的骨髓基质干细胞能够降低SCI大鼠脊髓组织中XBP1、葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）和C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）等ERS相关蛋白表达水平，抑制脊髓组织细胞凋亡，促进SCI大鼠运动功能恢复。研究^［13］显示：敲除端粒酶RNA组分通过下调XBP1表达在SCI期间发挥了抗炎和抗细胞凋亡作用。本研究通过改良Allen’s法建立SCI大鼠模型，结果显示：SCI组大鼠脊髓组织中XBP1蛋白表达水平明显升高，而沉默XBP1后不仅显著改善了大鼠后肢运动功能，还增加了神经元特异性标志物NeuN的表达，提示抑制XBP1表达对SCI的神经具有保护作用。

铁死亡是由铁超载引发的一种可调节的细胞死亡途径，其特征主要表现为严重脂质过氧化、活性氧（reactive oxygen species，ROS）沉积及铁代谢紊乱。研究^［14］显示：细胞内Fe²⁺积累是铁死亡发生的主要标志，当Fe²⁺与过氧化氢反应时，能够诱发芬顿反应形成脂质过氧化物，脂质过氧化反应严重破坏细胞膜的完整性，致使细胞发生程序性死亡。SCI原发性损伤阶段伴有局部出血，红细胞聚集破裂，出现溶血现象，导致受损区域Fe²⁺水平升高，而铁超载会进一步激活ROS，ROS代谢失衡则引发氧化应激反应和铁死亡^［15-16］。陶经纬等^［17］发现：川芎嗪能够通过调节SCI后的铁代谢平衡，抑制神经细胞铁死亡，发挥神经保护作用。YAO等^［18］研究显示：SCI后脊髓组织中SLC7A11、GSH和GPX4等铁死亡标志物水平发生改变，给予去铁胺干预后铁死亡被抑制，神经元得到保护。抑制铁死亡已成为治疗SCI的重点研究方向。本研究结果显示：SCI后脊髓组织中Fe²⁺水平异常升高，同时伴有脂质过氧化产物MDA和抗氧化酶GSH水平升高，SOD活性降低，上述变化在XBP1沉默后得到显著逆转，提示下调XBP1表达能够抑制细胞铁死亡发生。

Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路是调控细胞铁死亡的关键路径，涉及抗氧化应激、铁代谢平衡和脂质过氧化等生物学过程^［19-20］。Nrf2是调控细胞氧化还原平衡的中心转录因子，对SLC7A11和GPX4具有调控作用，其介导的抗氧化反应与抑制细胞铁死亡密切相关^［21-22］。SLC7A11是一种参与GSH合成的铁死亡调节剂，能够调节GPX4的表达^［23］。GPX4是一种抗氧化防御酶，活化后可促进GSH合成，减少脂质过氧化物积累，该过程是抑制细胞铁死亡的重要抗氧化途径。在针对SCI的研究^［24］中，红景天苷通过激活Nrf2信号通路抑制SCI后细胞氧化应激和炎症反应，脂肪来源干细胞外泌体（adipose-derived stem cell derived exosomes，ADSC-Exos）通过Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路抑制铁死亡，促进SCI后神经和血管功能恢复^［25］。研究^［26］发现：紫杉醇可以通过下调XBP1表达抑制棕榈酸酯诱导后发生的ERS，增加Nrf2和血红素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）等抗氧化因子水平，改善肌动蛋白细胞骨架，提示XBP1可能对Nrf2具有调控作用。本研究结果显示：SCI大鼠脊髓组织中Nrf2、GPX4和SLC7A11蛋白表达水平降低，表明该信号通路被抑制，而沉默XBP1表达可明显上调Nrf2、GPX4和SLC7A11蛋白表达并增强GSH合成和抗氧化能力，降低MDA水平，表明沉默XBP1可通过活化Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路增强细胞抗氧化能力，进而抑制铁死亡发生发展。同时，本研究通过使用Nrf2特异性抑制剂ML385进行干预，发现其能显著减弱XBP1沉默对SCI的保护作用，进一步验证了Nrf2信号通路在XBP1调控网络中的重要作用。

综上所述，本研究初步验证了沉默XBP1可能通过调控Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路，抑制细胞铁死亡，修复神经元细胞损伤，促进SCI后神经功能恢复。本研究为XBP1应用于SCI治疗提供了实验基础和理论支持。

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基金资助

湖南省中医药管理局项目(D2022030)

2024年度湖南省第二人民医院（湖南省脑科医院）与湖南中医药大学校院联合基金项目(2024XYLH237)