基于葡萄籽原花青素对口腔鳞状细胞癌抗癌作用的网络药理学分析和体外实验验证

Network pharmacology analysis and in vitro experimental validation of anticancer effect of grape seed proanthocyanidins against oral squamous cell carcinoma

摘要

目的 采用网络药理学、分子对接技术和体外细胞实验阐明葡萄籽原花青素（GSPE）对口腔鳞状细胞癌（OSCC）潜在的抗癌分子靶点及其机制，并探讨其对OSCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响。 方法 通过Pubchem、Swisstarget Prediction、SuperPred、TargetNet、Genecards和在线人类孟德尔遗传（OMIM）数据库分别获取原花青素（PACs）和OSCC的预测靶点，韦恩图筛选PACs抗OSCC的潜在靶基因，根据David 6.8数据库进行基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析预测其作用机制，应用String 12.0构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，采用Cytoscape软件和分子对接筛选并初步验证PACs与核心靶点的结合能力。体外培养人舌鳞状细胞癌SCC-15和CAL-27细胞，不同浓度GSPE处理并分为对照组（完全培养基）和5、10及20 mg·L^-1 GSPE组。通过细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测各组细胞存活率，细胞划痕实验检测各组细胞划痕愈合率，Transwell小室实验检测各组侵袭细胞数，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组细胞中核心靶点mRNA表达水平。 结果 网络药理学预测GSPE抗OSCC的潜在作用靶点50个，经筛选和分子对接初步验证后得到热休克蛋白90α家庭A类成员1（HSP90AA1）、B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）和核因子κB1（NFKB1）是GSPE抗OSCC的核心靶点，GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析主要涉及癌症相关通路和癌症中的微小RNA（miRNA）等。CCK-8法，与对照组比较，5、10和20 mg·L^-1 GSPE组处理12、24、48及72 h后细胞存活率均明显降低（P<0.05或P<0.01）。细胞划痕实验，与对照组比较，5、10和20 mg·L^-1 GSPE组处理12及24 h后细胞划痕愈合率均明显降低（P<0.05或P<0.01）。Transwell小室实验，与对照组比较，5、10和20 mg·L^-1 GSPE组侵袭细胞数明显降低（P<0.01）。RT-qPCR法，与HOK细胞比较，SCC-15和CAL-27细胞中HSP90AA1、Bcl-2、PTGS2和NFKB1 mRNA表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01）；与对照组比较，5、10和20 mg·L^-1 GSPE组SCC-15细胞中HSP90AA1、Bcl-2及PTGS2 mRNA表达水平明显降低（P<0.01），10和20 mg·L^-1 GSPE组SCC-15细胞中NFKB1 mRNA表达水平均明显降低（P<0.01），5、10和20 mg·L^-1 GSPE组CAL-27细胞中HSP90AA1、Bcl-2和NFKB1 mRNA表达水平均明显降低（P<0.01），10和20 mg·L^-1 GSPE组CAL-27细胞中PTGS2 mRNA表达水平明显降低（P<0.01）。 结论 GSPE通过HSP90AA1、Bcl-2、PTGS2和NFKB1等靶点调控癌症相关通路及癌症中miRNA等发挥抗OSCC作用，体外细胞实验验证研究表明GSPE可抑制OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭。

Abstract

Objective To clarify the potential anti-cancer molecular targets and mechanism of grape seed proanthocyanidin extract （GSPE） on oral squamous cell carcinoma （OSCC） with network pharmacology， molecular docking technology and in vitro cell experiments， and to discuss its effects on proliferation， migration and invasion of OSCC cells. Methods Pubchem， Swisstarget Prediction， SuperPred， TargetNet， Genecards and Online Mendelian Inheriatance in Man （OMIM） databases were used to obtain the predicted targets of proanthocyanidins （PACs） and OSCC， respectively； Venn diagram was used to screen the potential target genes of PACs against OSCC； Gene Ontology （GO） functional enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） signaling pathway enrichment analysis were performed according to David 6.8 database to predict the mechanism of action； String 12.0 was used to construct the protein-protein interaction（PPI） network； Cytoscape software and molecular docking were used to screen and preliminarily verify the binding ability of PACs with the core targets. Human tongue squamous cell carcinoma SCC-15 and CAL-27 cells were cultured in vitro， treated with different concentrations of GSPE， and divided into control group （complete medium） and 5， 10 and 20 mg·L^-1 GSPE groups. CCK-8 method was used to detect the survival rates of the cells in various groups； cell scratch assay was used to detect the scratch healing rates of the cells in various groups； Transwell chamber assay was used to detect the number of invasive cells in various groups； real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） was used to detect the mRNA expression levels of the core targets in the cells in various groups. Results Network pharmacology predicted 50 potential targets of GSPE against OSCC. After screening and preliminary verification by molecular docking， heat shock protein 90 alpha family class A member 1（HSP90AA1）， B-cell lymphoma-2（Bcl-2）， prostaglandin-endoperoxide synthase 2（PTGS2） and nuclear factor kappa B1（NFKB1） were identified as the core targets of GSPE against OSCC. GO function enrichment analysis and KEGG signaling pathway enrichment analysis mainly involved pathways in cancer and microRNAs （miRNAs） in cancer， etc. The CCK-8 assay results showed that compared with control group， the survival rates of the cells in 5， 10 and 20 mg·L^-1 GSPE groups were significantly decreased after treatment for 12， 24， 48 and 72 h （P<0.05 or P<0.01）. The cell scratch assay results showed that compared with control group， the scratch assay rates of the cells in 5， 10 and 20 mg·L^-1 GSPE groups were significantly decreased after treatment for 12 and 24 h （P<0.05 or P<0.01）. The Transwell chamber assay results showed that compared with control group， the numbers of invasion cells in 5， 10 and 20 mg·L⁻¹ GSPE groups were significantly decreased （P<0.01）. The RT-qPCR results showed that compared with HOK cells， the expression levels of HSP90AA1， Bcl-2， PTGS2 and NFKB1 mRNA in SCC-15 and CAL-27 cells were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）； compared with control group， the expression levels of HSP90AA1， Bcl-2 and PTGS2 mRNA in SCC-15 cells in 5， 10 and 20 mg·L⁻¹ GSPE groups were significantly decreased （P<0.01）， the expression levels of NFKB1 mRNA in SCC-15 cells in 10 and 20 mg·L⁻¹ GSPE groups were significantly decreased （P<0.01）， the expression levels of HSP90AA1， Bcl-2 and NFKB1 in CAL-27 cells in 5， 10 and 20 mg·L⁻¹ GSPE groups were significantly decreased （P<0.01）， the expression levels of PTGS2 mRNA in CAL-27 cells in 10 and 20 mg·L⁻¹ GSPE groups were significantly decreased （P<0.01）. Conclusion GSPE exerts anti-OSCC effects by regulating pathways in cancer and miRNAs in cancer， etc. through targets such as HSP90AA1， Bcl-2， PTGS2 and NFKB1. In vitro cell experiment validation study shows that GSPE can inhibit the proliferation， migration and invasion of OSCC cells.

Graphical abstract

关键词

葡萄籽原花青素 / 口腔鳞状细胞癌 / 细胞增殖 / 细胞迁移 / 细胞侵袭

Key words

Grape seed proanthocyanidin extract / Oral squamous cell carcinoma / Cell proliferation / Cell migration / Cell invasion

口腔鳞状细胞癌（oral cavity squamous cell carcinoma，OSCC）作为口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，因高发病率和高死亡率已成为公共卫生领域的重要挑战^［1］。近年来，随着对OSCC发病机制的深入研究，越来越多的天然药物在肿瘤学领域展现出巨大潜力。与合成药物比较，许多植物提取物（姜黄中的姜黄素^［2-3］和葡萄中的白藜芦醇^［4］）具有多重优势，其对癌细胞表现出选择性细胞毒性，能显著降低对正常组织的损伤；植物提取物的天然来源特性赋予其更好的生物相容性和人体耐受性；同时，植物提取物的获取成本相对较低，可有效减轻患者用药经济负担^［5］。相关化合物通过靶向关键致癌信号通路，如磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）^［2］和核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）^［3］信号通路影响癌细胞的增殖和凋亡以及血管生成和转移。

葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidins，GSPE）作为一类药理活性很强的天然多酚类物质，是原花青素（proanthocyanidins， PACs）、没食子酸、儿茶素、表儿茶素和类黄酮等物质的主要来源，已被证实具有抗氧化、抗炎、抗菌和抗糖尿病等特性^［6］，特别是在抗癌方面表现出显著的潜力，如食管鳞状细胞癌、肝细胞癌、乳腺癌和肺癌等^［7］。研究^［8］显示：使用GSPE可导致口腔角质形成细胞中P53基因的过表达，从而影响细胞的凋亡。但GSPE抗OSCC的具体分子机制尚缺乏全面深入研究。

本研究采用网络药理学方法联合分子对接技术预测GSPE抗OSCC的核心作用靶点，同时通过体外细胞实验探讨GSPE对OSCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响，验证GSPE抗OSCC的核心靶点和可能的作用机制，为OSCC的治疗提供新型药物和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1　数据库检索、靶点筛选和核心靶点获取

从Pubchem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 中获得PACs的化学结构和Canonical Smiles号，导入Targetnet（http：//targetnet.scbdd.com/）、Swisstarget Prediction（http：//swisstargetprediction.ch/）和SuperPred（https：//prediction.charite.de/）数据库中，获取PACs的潜在靶向蛋白，利用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）将下载的靶点蛋白名称转换为基因名称，合并并去除重复靶点；同时，从在线人类孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）（https：//www.omim.org/）和GeneCards（https：//www.genecards.org/）疾病数据库检索OSCC相关靶点。使用Venny图在线平台对PACs与OSCC相关的疾病靶点取交集，并制作韦恩图，确定PACs抗OSCC的潜在作用靶点。将潜在靶点导入String 12.0数据库（https：//cn.string-db.org/），构建蛋白质-蛋白质互作（protein-protein interaction，PPI）网络，使用Cytoscape 3.8.0软件对网络进行可视化分析。利用CytoNCA插件计算PPI网络中每个节点的拓扑参数，进一步筛选出核心靶点。

1.2　基因本体论（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析

使用David 6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析，以识别PACs抗OSCC的潜在靶点。GO功能富集分析包含生物过程（biological process，BP）、分 子 功 能（molecular function，MF）和细胞组成（cellular component，CC）。KEGG信号通路富集分析用于识别与相关靶点有关的信号通路。富集分析设置了显著性阈值P<0.05。富集分析结果导入至微生信在线可视化平台（www.bioinformatics.com.cn）进行整理和可视化展示，通过气泡图和柱状图直观呈现富集程度较高的GO功能和KEGG信号通路。以富集基因数目、P值及富集倍数为主要评价指标，明确靶点所富集的生物学功能、细胞定位和关键信号通路。

1.3　分子对接技术分析验证PACs与核心靶点的结合能力

分别从PubChem数据库和PDB数据库（http：//www.rcsb.org/）下载PACs的分子结构及目标蛋白的3D晶体结构。并使用Getbox Plugin插件获取对接口袋参数，将处理后的蛋白质和PACs的文件导入 AutoDock Tools 1.5.6 软件， 转换为PDBQT 格 式。通 过 AutoDock Vina 1.1.2 和PyMOL 2.6.0软件进行分子对接及可视化对接结果。以结合自由能为主要评价指标，观察PACs与核心靶点的结合能力。

1.4　细胞、主要试剂和仪器

人口腔上皮角质细胞（human oral keratinocyte，HOK）由北京北纳联创生物科技有限公司提供，OSCC细胞株（人舌鳞状细胞癌SCC-15细胞和人舌鳞状细胞癌CAL-27细胞）购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）细胞库。GSPE（含PACs>95%）购自天津尖峰生物公司，细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8，CCK-8）购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，Matrigel基质胶和Transwell小室购自美国Corning公司，逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）试剂盒购自美国US EVERBRIGHT Inc公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成，细胞培养所用的MEM基础培养基、DMEM高糖培养基、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（1×）和无血清无蛋白非程序细胞冻存液均购自武汉普诺赛生命科技有限公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自浙江天杭生物科技股份有限公司，1%青-链霉素双抗、结晶紫和胰蛋白酶均购自北京索莱宝科技有限公司。细胞培养箱（型号：BC-J160）购自上海博迅医疗生物仪器股份有限公司，超净工作台（型号：AC2-4S1）购自新加坡ESCO 科 技 有 限 公 司，-80 ℃ 冰 箱（型 号：Forma^TM 991） 和 多 功 能 酶 标 仪（型 号：Multiskan^TM FC）购自美国Thermo公司，PCR热循环仪（型号：Mastercycler nexus GSX1）购自德国 Eppendorf 公 司， RT-qPCR 仪 （型 号：LightCycler^®96）购自瑞士Roche公司。

1.5　细胞培养、GSPE最佳浓度选择和细胞分组

将FBS和MEM/DMEM高糖培养基按1∶9比例混合，向该培养基中加入1%青-链霉素，配制成完全培养基。在37 ℃、5%CO₂的培养箱环境下培养HOK、SCC-15和CAL-27细胞。待SCC-15和CAL-27细胞生长密度达到80%~90%时，将其分别以每孔5×10³个细胞的密度接种至96孔细胞培养板中。24 h后以0、2.5、5、10、20、40、80、160和320 mg·L^-1 GSPE分别处理24和48 h，采用CCK-8法避光下测定波长450 nm处吸光度（A）值，并计算细胞存活率，细胞存活率=（实验组A值-空白组A值）/（对照组A值-空白组A值）×100%。利用GraphPad Prism 9.5软件绘制剂量-效应曲线，计算24和48 h的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC₅₀），并根据其结果将实验分为对照组（完全培养基）和5、10及20 mg·L^-1 GSPE组。

1.6　CCK-8法检测各组细胞存活率

将处于对数生长期的SCC-15和CAL-27细胞接种于96孔细胞培养板中，培养24 h。按照分组继续培养12、24、48和72 h后，在避光条件下将CCK-8试剂与DMEM高糖培养基按1∶10的比例加入每个孔中，并在避光条件下孵育1 h。于波长450 nm处测量A值，并计算细胞存活率。细胞存活率=（实验孔A值-空白孔A值）/（对照孔A值-空白孔A值）×100%。

1.7　细胞划痕实验检测各组细胞划痕愈合率

将处于对数期的SCC-15和CAL-27细胞接种于6孔细胞培养板中，24 h后用200 µL枪头的尖端垂直划线，去除旧培养基，PBS缓冲液清洗2次，加入按分组的GSPE与无血清DMEM配置培养基，在显微镜下观察0、12和24 h的愈合情况并拍摄照片。使用Image J软件分析和处理各组细胞划痕区域，并计算各组细胞划痕愈合率。划痕愈合率=（0 h划痕面积-处理时间划痕面积）/0 h划痕面积×100%。

1.8　Transwell小室实验检测各组细胞侵袭细胞数

收集按分组处理24 h的SCC-15和CAL-27细胞接种于24孔Transwell小室，向下室加入含20% FBS的培养基，在培养箱中继续培养48 h。甲醛固定小室30 min，室温下自然干燥10 min，0.1%结晶紫染色15 min，彻底冲洗后，观察并计数随机视野下染色的跨膜细胞数，取多个视野均值进行统计分析，以跨膜细胞数代表各组细胞侵袭细胞数。

1.9　RT-qPCR法检测各组细胞中核心靶点相关基因mRNA表达水平

利用试剂盒分别提取HOK细胞和分组处理24 h的SCC-15及CAL-27细胞总RNA，逆转录和PCR扩增在每个组中均进行了3次重复。cDNA模板、引物和荧光试剂混合后，使用RT-qPCR试剂盒进行定量分析。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参基因，采用2^-△△Ct法计算目的基因表达水平。热休克蛋白90α家族A类成员1（heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90AA1）、B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、前 列 腺 素 内 过 氧 化 物 合 酶 2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）和核因子κB1（nuclear factor kappa B1，NFKB1）引物序列见表1。

1.10　统计学分析

采用GraphPad Prism 9.5软件进行统计学分析和图形绘制。各组细胞存活率、划痕愈合率、侵袭细胞数和核心靶点相关基因mRNA表达水平均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　数据库检索、靶点筛选和核心靶点获取

共筛选出PACs的174个潜在作用靶点；获得OSCC相关靶点1 948个，取交集后得到PACs抗OSCC的潜在作用靶点50个。见图1。PPI网络中含50个节点和308条边。见图2。确定PACs抗OSCC的潜在核心靶点有雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）、HSP90AA1、Bcl-2、PTGS2和NFKB1。见图3。

2.2　核心靶点的GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析

GO功能富集分布注释中，与BP相关的条目共有124个（P<0.05），与CC相关的条目共有35个（P<0.05），与MF相关的条目共有70个（P<0.05）。GO功能富集分析检测结果显示：BP主要涉及一氧化氮生物合成的正向调节、异源生物代谢和细胞对雌激素刺激的反应；CC主要涉及受体胞质、细胞核和胞质基质；MF主要涉及蛋白质结合、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）结合和蛋白质同源二聚化活性等。见图4。KEGG信号通路富集分析选取P<0.05的前20条通路绘制柱状图，其中涉及的信号通路包括癌症相关通路和癌症中微小RNA（microRNA，miRNA）等。见图5。

2.3　PACs与核心靶点的分子对接分析

选取PACs与核心靶点（HSP90AA1、Bcl-2、PTGS2、NFKB1和ESR1）进行分子对接，结果显示：5个靶基因编码的蛋白与PACs分子之间的结合能分别为-8.1、-8.1、-10.6、-8.1和-7.6 kcal·mol^-1，表明PACs与核心靶点HSP90AA1、Bcl-2、PTGS2及NFKB1之间有较强的结合活性。见图6。

2.4　各组细胞存活率

SCC-15细胞作用24和48 h的IC₅₀分别为10.240及8.944 mg·L^-1，CAL-27细胞对应IC₅₀分别为11.410和8.759 mg·L^-1。基于上述IC₅₀结果，选取5、10和20 mg·L^-1作为后续实验浓度。CCK-8法检测结果显示：与对照组比较，5、10和20 mg·L^-1 GSPE组细胞存活率均明显降低（P<0.05或P<0.01）。见表2。

2.5　各组细胞划痕愈合率

各组SCC-15和CAL-27细胞处理0、12和24 h后划痕愈合情况见图7。结果显示：与对照组比较，5、10和20 mg·L^-1 GSPE组细胞划痕愈合率均明显降低（P<0.05或P<0.01）。见表3。

2.6　各组细胞的侵袭细胞数

分组处理48 h的SCC-15和CAL-27细胞固定染色后其侵袭情况见图8。Transwell小室实验检测结果显示：与对照组比较，5、10和20 mg·L^-1 GSPE组侵袭细胞数明显降低（P<0.01）。见表4。

2.7　各组细胞中核心靶点mRNA表达水平

与HOK细 胞 比 较，SCC-15 和 CAL-27 细 胞 中HSP90AA1、Bcl-2、PTGS2和NFKB1 mRNA表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01）。见图9。与对照组比较，5、10和20 mg·L^-1 GSPE组SCC-15细胞中HSP90AA1、Bcl-2和PTGS2 mRNA表达水平均明显降低（P<0.01），10和20 mg·L^-1 GSPE组SCC-15细胞中NFKB1 mRNA表达水平明显降低（P<0.01），5、10和20 mg·L^-1 GSPE组CAL-27细胞中HSP90AA1、Bcl-2和NFKB1 mRNA表达水平明显降低（P<0.01），10和20 mg·L^-1GSPE组CAL-27细胞中PTGS2 mRNA表达水平明显降低（P<0.01）。见图10。

3 讨 论

口腔癌是全球第六大风险癌症，其致死率是常见癌症（前列腺癌和乳腺癌）的3~4倍。而OSCC作为口腔癌的主要病理类型，占比为90%~95%，其高侵袭性和转移倾向导致患者5年生存率长期为50%~60%^［1］。OSCC的常规治疗包括手术后放射治疗或联合顺铂的放射治疗和化学治疗，其晚期患者的5年生存率仍不理想，且治疗方式常常伴随着严重的功能障碍和美容缺陷，影响患者的言语及吞咽等重要生理功能^［9］。传统化学治疗药物产生的全身毒性、免疫抑制和肿瘤细胞的耐药性复发，已成为临床治疗的重大挑战^［10］。因此，寻找新型、高效和低毒的治疗策略成为OSCC研究领域的重要方向。

研究^［5］显示：天然植物来源的化合物可以针对癌细胞表现出细胞毒性作用，并且因其较小的不良反应和潜在的药用价值，在肿瘤防治领域展现出巨大潜力。GSPE作为一类天然多酚类化合物，因其抗氧化特性和潜在的抗癌价值备受关注，其结构中富含的酚羟基使其具有强大的自由基清除能力^［7］。研究^［11］显示：GSPE在正常细胞中缺乏毒性，但对不同类型的癌细胞均具有较强的抗癌活性，其抗癌机制涉及多靶点调控。在食管癌ECA109细胞中，GSPE可调节Bcl-2家族蛋白的平衡，上调促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X-protein，Bax），下调抗凋亡蛋白Bcl-2，导致线粒体膜电位改变，释放细胞色素C，激活Caspase-3，最终诱导癌细胞凋亡^［12］。葡萄籽提取物还能以时间-剂量依赖性方式抑制肝癌HepG2细胞的存活，诱导凋亡和G₂/M期细胞周期停滞，并增加活性氧的产生^［13］。研究^［14］发现：GSPE还能抑制AKT/NF-κB信号通路并发挥抗肿瘤作用。

本研究初步探讨GSPE抗OSCC细胞的潜在分子机制和生物学行为的影响。通过网络药理学分析发现GSPE的50个抗OSCC的治疗靶点，构建PPI网络和分子对接筛选后，最终确定了HSP90AA1、Bcl-2、PTGS2和NFKB1为核心靶点，并富集至癌症相关通路和癌症中的miRNA关键信号通路。本研究结果显示：GSPE可有效抑制OSCC细胞的增殖，并通过有效阻断细胞迁移和侵袭发挥抗转移作用，且上述抑制作用具有剂量依赖性。同时，RT-qPCR实验检测结果显示：与HOK细胞比较，HSP90AA1、Bcl-2、PTGS2和NFKB1 mRNA在OSCC细胞中高表达，且GSPE可显著降低OSCC细胞中的上述核心靶点的表达。PI3K/Akt信号传导通路作为抗肿瘤治疗的重要靶点，与肿瘤细胞的增殖、生长、迁移、侵袭和血管生成等生物学行为存在密切联系^［15］。已有研究^［16］证实：HSP90AA1表达水平的下调可激活PI3K/AKT信号通路，通过减轻炎症反应并抑制细胞凋亡途径，发挥细胞保护效应。Bcl-2作为重要的抗凋亡蛋白分子，其表达下调对鳞状细胞癌具有显著的抑癌作用，且该过程可能与PI3K/AKT信号通路的活性降低有关^［17］。在OSCC中，炎症因子白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）在缺氧微环境下可通过激活NF-κB通路，诱导PTGS2持续过表达^［18］。PTGS2的异常高表达不仅可以通过介导Bcl-2的抗凋亡作用影响上皮细胞存活^［19］，还与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信号通路的激活存在密切联系，为肿瘤细胞的迁移和侵袭提供了有利的微环境条件^［20］。NFKB1的过表达可上调抗凋亡基因Bcl-2的转录水平，从而抑制肿瘤细胞的凋亡进程，且其高表达状态多见于中晚期（Ⅲ或Ⅳ期）和低分化肿瘤^［21］；而低分化OSCC的炎症微环境更显著，可进一步激活NFKB1，形成“炎症-癌变”的恶性循环^［22］。

综上所述，本研究通过网络药理学、分子对接技术和体外细胞实验研究表明GSPE可能通过HSP90AA1、Bcl-2、PTGS2和NFKB1等靶点，进一步调控癌症相关通路和癌症中的miRNA等发挥抗OSCC作用，且GSPE可以抑制OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭，有望成为OSCC治疗的辅助药物或新型治疗药物，具有广阔的应用前景。本研究重点关注了GSPE中的主要成分的作用，未来需要更精细地分离鉴定发挥主要药效的关键活性单体及其组合。

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基金资助

新疆生产建设兵团科技局指导性科技计划项目(2024ZD067)

石河子大学第一附属医院科技计划项目(ZP2024003)

石河子大学第一附属医院科技计划项目(ZP2024005)