芝麻素调控AMPK/SIRT1自噬通路对阿尔茨海默病模型大鼠学习和记忆能力的影响

Effect of sesamin on learning and memory abilities of rats with Alzheimer’s disease model through regulating AMPK/SIRT1 autophagy pathway

摘要

目的 探讨芝麻素（Ses）调控单磷酸腺苷（AMP）活化蛋白激酶（AMPK）/沉默信息调节因子1（SIRT1）自噬通路对阿尔茨海默病（AD）大鼠学习和记忆能力的影响。 方法 90只雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、低剂量Ses组（Ses-L组）、高剂量Ses组（Ses-H组）、阳性对照多奈哌齐（Donepezil）组和高剂量Ses+AMPK抑制剂Compound C组（Ses-H+Compound C组），每组15只。采用跳台实验检查各组大鼠跳台潜伏期和触电数，Morris水迷宫实验检测各组大鼠逃避潜伏期和穿越平台数，HE染色观察各组大鼠海马CA1区神经元病理形态表现，TUNEL染色检测各组大鼠海马组织中神经元凋亡率，透射电子显微镜观察各组大鼠海马CA1区自噬体的形成情况，Western blotting法检测各组大鼠海马CA1区组织中苄氯素1（Beclin1）、微管相关蛋白1轻链3（LC3）、AMPK、磷酸化AMPK（p-AMPK）和沉默信息调节因子1（SIRT1）蛋白表达水平。 结果 跳台实验、Morris水迷宫实验和HE染色，与对照组比较，模型组大鼠跳台潜伏期缩短（P<0.05），触电数增加（P<0.05）；逃避潜伏期延长（P<0.05），穿越平台数减少（P<0.05），大部分神经元出现核固缩，正常细胞数目减少，神经元凋亡率升高（P<0.05）。与模型组比较，Ses-L组、Ses-H组和Donepezil组大鼠跳台潜伏期延长（P<0.05），触电数减少（P<0.05）；逃避潜伏期缩短（P<0.05），穿越平台数增加（P<0.05）；海马CA1区神经元结构和形态有所改善，神经元凋亡率降低（P<0.05）。与Ses-L组比较，Ses-H组和Donepezil组大鼠跳台潜伏期延长（P<0.05），触电数减少（P<0.05）；逃避潜伏期缩短（P<0.05），穿越平台数增加（P<0.05），海马CA1区病理损伤进一步减轻，神经元凋亡率降低（P<0.05）。与Ses-H组比较，Ses-H+Compound C组大鼠跳台潜伏期缩短（P<0.05），触电数增加（P<0.05）；逃避潜伏期延长（P<0.05），穿越平台数减少（P<0.05）；海马CA1区可见大量核固缩的神经元，神经元凋亡率升高（P<0.05）。TUNEL染色和Western blotting法，与对照组比较，模型组大鼠海马CA1区自噬体数量减少，Beclin1和SIRT1蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p-AMPK/AMPK比值降低（P<0.05）；与模型组比较，Ses-L组、Ses-H组和Donepezil组大鼠海马CA1区自噬体数量增多，Beclin1和SIRT1蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p-AMPK/AMPK比值升高（P<0.05）；与Ses-L组比较，Ses-H组和Donepezil组大鼠海马CA1区自噬体数量增多，Beclin1和SIRT1蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p-AMPK/AMPK比值升高（P<0.05）；与Ses-H组比较，Ses-H+Compound C组大鼠海马CA1区自噬体数量减少，Beclin1和SIRT1蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p-AMPK/AMPK比值降低（P<0.05）。 结论 Ses可改善AD模型大鼠学习和记忆能力，可能与Ses激活AMPK/SIRT1自噬通路有关。

Abstract

Objective To discuss the effect of sesamin （Ses） regulating adenosine monophosphate （AMP）-activated protein kinase （AMPK）/silent information regulator 1 （SIRT1） autophagy pathway on the learning and memory abilities of rats with Alzheimer’s disease （AD）. Methods Ninety male SD rats were randomly divided into control group， model group， low dose of Ses group （Ses-L group）， high dose of Ses group （Ses-H group）， positive control Donepezil group（Donepezil group）， and high dose of Ses+AMPK inhibitor Compound C group （Ses-H+Compound C group）， with 15 rats in each group. Step-down test was used to examine the step-down latencies and numbers of electric shocks of the rats in various groups； Morris water maze test was used to detect the escape latency and number of platform crossings of the rats in various groups； HE staining was used to observe the pathological morphology of neurons in the hippocampal CA1 region of the rats in various groups； TUNEL staining was used to detect the apoptotic rate of neurons in the hippocampus tissue of the rats in various groups； transmission electron microscope was used to observe the formation of autophagosomes in the hippocampal CA1 region of the rats in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of rabbit primary antibodies against Beclin1， microtubule-associated protein 1 light chain 3 （LC3）， AMPK， phosphorylated AMPK （p-AMPK）， and SIRT1 proteins in the hippocampus CA1 region tissue of the rats in various groups. Results The step-down test， Morris water maze test and HE staining results showed that compared with control group， the step-down latency of the rats in model group was shortened （P<0.05）， and the number of electric shocks was increased （P<0.05）； the escape latency was prolonged （P<0.05）， and the number of platform crossings was decreased （P<0.05）； most neurons showed pyknosis， the number of normal cells was reduced， and the apoptotic rate of neurons was increased （P<0.05）. Compared with model group， the step-down latencies of the rats in Ses-L group， Ses-H group and Donepezil group were prolonged （P<0.05）， and the numbers of electric shocks were decreased （P<0.05）； the escape latencies were shortened （P<0.05）， and the numbers of platform crossings were increased （P<0.05）； the structure and morphology of neurons in hippocampal CA1 region were improved， and the apoptotic rates of neurons were decreased （P<0.05）. Compared with Ses-L group， the step-down latencies of the rats in Ses-H group and Donepezil group were prolonged （P<0.05）， and the number of electric shocks were decreased （P<0.05）； the escape latency was shortened （P<0.05）， and the numbers of platform crossings were increased （P<0.05）； the pathological damage in hippocampal CA1 region was further alleviated， and the apoptotic rate of neurons were decreased （P<0.05）. Compared with Ses-H group， the step-down latency of the rats in Ses-H+Compound C group was shortened （P<0.05）， and the number of electric shocks was increased （P<0.05）； the escape latency was prolonged （P<0.05）， and the number of platform crossings was decreased （P<0.05）； a large number of pyknotic neurons were observed in hippocampal CA1 region， and the apoptotic rate of neurons was increased （P<0.05）. The TUNEL staining and Western blotting results showed that compared with control group， the number of autophagosomes in hippocampal CA1 region of the rats in model group was decreased， the expression levels of Beclin1 and SIRT1 proteins and the ratios of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ and p-AMPK/AMPK were decreased （P<0.05）； compared with model group， the numbers of autophagosomes in hippocampal CA1 region of the rats in Ses-L group， Ses-H group and Donepezil group were increased， the expression levels of Beclin1 and SIRT1 proteins and the ratios of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ and p-AMPK/AMPK were increased （P<0.05）； compared with Ses-L group， the numbers of autophagosomes in hippocampal CA1 region of the rats in Ses-H group and Donepezil group were increased， the expression levels of Beclin1 and SIRT1 proteins and the ratios of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ and p-AMPK/AMPK were increased （P<0.05）； compared with Ses-H group， the number of autophagosomes in hippocampal CA1 region of the rats in Ses-H+Compound C group was decreased， the expression levels of Beclin1 and SIRT1 proteins and the ratios of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ and p-AMPK/AMPK were decreased （P<0.05）. Conclusion Ses can improve the learning and memory abilities of AD model rats， which may be related to the activation of AMPK/SIRT1 autophagy pathway by Ses.

Graphical abstract

关键词

芝麻素 / 腺苷酸活化蛋白激酶/沉默信息调节因子1自噬通路 / 阿尔茨海默病 / 学习和记忆能力 / 自噬

Key words

Sesamin / Activated protein kinase/Silent information regulator 1 autophagy pathway / Alzheimer’s disease / Learning and memory ability / Autophagy

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是以记忆力减退和认知能力下降为特征的一种进行性神经退行性疾病^［1］。尽管在了解AD的病理生理学方面取得了重大进展，但仍然没有有效的治疗方法治愈或减缓AD进展^［2］。研究^［3］显示：AD的发病机制涉及β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）的沉积和清除受损，而自噬是一种细胞内降解途径，其可清除聚集的蛋白，上调自噬可能是治疗AD的合理治疗策略^［3］。芝麻素（sesamin，Ses）是从芝麻中分离得到的一种天然木质素化合物，具有抗炎、抗癌、抗肥胖和脂肪分解等作用^［4］。研究^［5］显示：Ses可提高AD小鼠的学习和记忆能力。而Ses对学习和记忆能力的提高是否与激活自噬有关尚未阐明。单磷酸腺苷 （adenosine monophosphate， AMP）活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/沉默信息调节因子1（silence information regulator-1，SIRT1）通路是与自噬相关的通路，该通路的激活可有效上调自噬^［6］。而Ses能否通过调控AMPK/SIRT1自噬通路影响AD大鼠学习和记忆能力尚未见相关报道。本研究探讨Ses对AD大鼠学习和记忆能力的影响，并阐明其相关机制，为将Ses开发为治疗AD的候选药物提供实验依据，同时也为临床治疗AD提供新的作用靶点参考。

1 材料与方法

1.1　实验动物、主要试剂和仪器

90只雄性SD大鼠，体质量为220~240 g，购自导科医药技术（广东）公司，实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2022-0060。所有大鼠分笼饲养于牡丹江医科大学动物实验中心，实验动物使用许可证号：SYXK（黑）2024-015，饲养温度控制在（22±2）℃，相对湿度为45%~65%，光照周期为12 h明/12 h暗，实验期间大鼠自由摄食饮水。本研究获得牡丹江医科大学附属红旗医院动物福利与伦理委员会批准（IACUC-20240819-170）。Aβ_25-35购自美国MCE公司，Ses购自滁州仕诺达生物公司，多奈哌齐（Donepezil）购自上海吉至生化公司，AMPK抑制剂Compound C购自上海嵘崴达实业公司，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自上海李记生物公司，兔源一抗苄氯素1（Beclin1）、微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein light chain 3， LC3）、 AMPK、 磷酸化AMPK （phosphorylated AMPK，p-AMPK）、甘 油 醛 -3- 磷 酸 脱 氢 酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）和SIRT1及二抗均购自英国Abcam公司。DB006-2型脑立体定向仪（北京智鼠多宝生物科技有限责任公司），HB-800S跳台箱（淮北软隆生物科技有限公司），XR-XM101型Morris水迷宫（上海欣软信息科技有限公司），S800T-620HS型光学显微镜（苏州倍特嘉光电科技有限公司），ICX41荧光显微镜（广州华誉仪器科技有限责任公司），LEEM Ⅲ透射电子显微镜（上海麦科威半导体技术有限公司），Mini-PROTEAN^® Tetra Cell蛋白电泳仪（美国伯乐公司）。

1.2　大鼠AD模型的制备和分组

90只大鼠中随机选取75只大鼠构建AD模型^［7］，处于麻醉状态的大鼠固定于脑立体定向仪上以精准定位右侧脑室（依据《大鼠脑立体定位图谱》，前囟后0.8 mm，旁开1.8 mm，颅骨表面向下3.5 mm），将5 μL Aβ_25-35缓慢注入右侧脑室以构建AD模型，留针30 min，缝合伤口并滴加青霉素防止感染（Aβ_25-35在注射前需进行寡聚化处理以增强其神经毒性：首先将冻干肽粉末用无菌生理盐水溶解至1 g·L^-1，随后在37 ℃恒温孵育箱中避光孵育4~7 d，使其由无序结构转变为富含β-折叠结构的毒性寡聚体）。若大鼠出现运动迟缓、反应迟钝等现象则表明造模成功^［8］。将造模成功的75只大鼠随机分为模型组、低剂量Ses组（Ses-L组）、高剂量Ses组（Ses-H组）^［9］、阳性对照Donepezil组（Donepezil组）^［10］和高剂量Ses+AMPK抑制剂Compound C组（Ses-H+Compound C组）^［11］，每组15只。Ses-L组、Ses-H组和 Donepezil 组 大 鼠 每 天 分 别 灌 胃 80、160 和525 mg·kg^-1对应剂量的药物，此外每周还需尾静脉注射与Compound C等量的生理盐水；Ses-H+Compound C组大鼠每天需灌胃160 mg·kg^-1 Ses，每周还需尾静脉注射1 mg·kg^-1的Compound C；模型组大鼠每天需灌胃与Ses等体积的生理盐水，每周还需尾静脉注射与Compound C等量的生理盐水；另取15只大鼠作为对照组，该组大鼠操作过程同模型组，但向右侧脑室注射等体积的生理盐水，此外该组大鼠每天需灌胃与Ses组等体积的生理盐水，每周还需尾静脉注射与Compound C等量的生理盐水，给药持续8周。

1.3　跳台实验检测各组大鼠跳台潜伏期和触电数

于末次给药结束24 h后进行跳台实验测试。正式测试前，将大鼠单独放入跳台箱中适应5 min，不给予电刺激。适应结束后，立即通以36 V的交流电进行训练。当大鼠从安全平台跳下至电网时，即记为一次错误，并持续遭受电击，直至其再次跳回平台以逃避电击。训练阶段，每只大鼠最多接受5 min的电刺激，以使其形成“停留在平台上是安全的”记忆。24 h后进行记忆保持测试，将大鼠再次置于绝缘平台上，记录其跳台潜伏期（即从放入箱内至第一次跳下平台四足接触箱底的时间，设定最长潜伏期为300 s）和5 min内的触电次数^［12］。

1.4　Morris水迷宫实验检测各组大鼠逃避潜伏期和穿越平台数

在跳台实验结束后，采用Morris水迷宫评估各组大鼠空间学习记忆能力，首先进行连续6 d的空间获取训练，每日将大鼠从4个不同象限的入水点面向池壁放入水中，记录第7天大鼠找到隐藏于水面下平台所需的时间（即为逃避潜伏期），单次训练限时90 s；第8天进行空间探索测试，撤去平台后从距原平台最远的入水点放入大鼠，记录其在120 s内穿越平台的次数，即为穿越平台数^［13］。

1.5　HE染色观察各组大鼠海马CA1区神经元病理形态表现

每组选取5只大鼠，麻醉并处死，收集大鼠海马CA1区组织，将组织固定、包埋和制作切片，并行HE染色，观察各组大鼠海马CA1区神经元病理形态表现。

1.6　TUNEL染色检测各组大鼠海马组织中神经元凋亡率

取“1.5”中剩余的石蜡切片，经脱蜡、水化和细胞膜通透后，将切片与含有TUNEL的反应混合液在37 ℃湿盒中避光孵育60 min。随后，使用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI）对细胞核进行复染。染色完成后，在荧光显微镜下观察，凋亡的神经元细胞核呈现明亮的绿色荧光，而所有细胞的细胞核均显示蓝色荧光，计算各组大鼠海马组织中神经元凋亡率。神经元凋亡率=TUNEL阳性细胞数/DAPI阳性细胞总数×100%。

1.7　透射电子显微镜观察各组大鼠海马CA1区自噬体的形成情况

每组另选取5只大鼠，麻醉并处死，收集大鼠海马CA1区组织，将组织在4%多聚甲醛中浸泡4 h并在磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）中洗涤4 h后，将组织在1%四氧化锇中固定2 h。用梯度乙醇脱水后，将组织包埋在环氧树脂中。经醋酸铀和柠檬酸铅双染后用透射电子显微镜观察自噬体形成情况。

1.8　Western blotting法检测各组大鼠海马CA1区中Beclin1、LC3、AMPK、p-AMPK和SIRT1蛋白表达水平

选取每组剩余的5只大鼠麻醉并处死，收集大鼠海马CA1区组织，用RIPA裂解缓冲液裂解并提取组织匀浆中的总蛋白。将蛋白质进行电泳、转膜，取出转印完的PVDF膜，切出含有目的蛋白的条带，将条带置于含5%脱脂牛奶的孵育槽中室温封闭1 h，除去封闭液，加入一抗Beclin1、LC3、AMPK、p-AMPK、SIRT1和GAPDH（均1∶2 000），4 ℃摇床过夜孵育后，回收一抗，加入含Tween 20的Tris缓冲盐（Tris-buffered saline with Tween 20，TBST）在脱色摇床上洗脱膜3次，每次10 min。弃掉TBST溶液，加入二抗（1∶3 000）在摇床上孵育2 h，回收二抗，加入TBST溶液在脱色摇床上洗脱膜3次，每次10 min。加入ECL试剂显色，采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH蛋白条带灰度值。

1.9　统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。各组大鼠跳台潜伏期、触电数，各组大鼠逃避潜伏期和穿越平台数，各组大鼠海马组织中神经元凋亡率，各组大鼠海马CA1区中Beclin1、LC3、AMPK、p-AMPK和SIRT1蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用SNK- q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　各组大鼠跳台潜伏期和触电数

跳台实验检测结果显示：与对照组比较，模型组大鼠触电数增加（P<0.05），跳台潜伏期缩短（P<0.05）；与模型组比较，Ses-L组、Ses-H组和Donepezil组大鼠触电数减少（P<0.05），跳台潜伏期延长（P<0.05）；与Ses-L组比较，Ses-H组和Donepezil组大鼠触电数减少（P<0.05），跳台潜伏期延长（P<0.05）；与Ses-H组比较，Ses-H+Compound C组大鼠跳台潜伏期缩短（P<0.05），触电数增加（P<0.05）。见表1。

2.2　各组大鼠逃避潜伏期和穿越平台数

Morris水迷宫实验检测结果显示：与对照组比较，模型组大鼠逃避潜伏期延长（P<0.05），穿越平台数减少（P<0.05）；与模型组比较，Ses-L组、Ses-H组和Donepezil组大鼠逃避潜伏期缩短（P<0.05），穿越平台数增加（P<0.05）；与Ses-L组比较，Ses-H组和Donepezil组大鼠逃避潜伏期缩短（P<0.05），穿越平台数增加（P<0.05）；与Ses-H组比较，Ses-H+Compound C组大鼠逃避潜伏期延长（P<0.05），穿越平台数减少（P<0.05）。见表2。

2.3　各组大鼠海马CA1区神经元病理形态表现

HE染色观察结果显示：对照组大鼠海马CA1区神经元结构正常；模型组大鼠海马CA1区大部分神经元出现核固缩，正常细胞数目减少；与模型组比较，Ses-L组、Ses-H组和Donepezil组大鼠海马CA1区神经元结构和形态有所改善；与Ses-H组比较，Ses-H+Compound C组大鼠海马CA1区可见大量核固缩的神经元。见图1。

2.4　各组大鼠海马组织中神经元凋亡率

TUNEL染色检测结果显示：与对照组比较，模型组大鼠海马组织中神经元凋亡率升高（P<0.05）；与模型组比较，Ses-L组、Ses-H组和Donepezil组大鼠海马组织中神经元凋亡率降低（P<0.05）；与Ses-L组比较，Ses-H组和Donepezil组大鼠海马组织中神经元凋亡率降低（P<0.05）；与Ses-H组比较，Ses-H+Compound C组大鼠海马组织中神经元凋亡率升高（P<0.05）。见图2和表3。

2.5　各组大鼠海马CA1区自噬体形成情况

在透射电子显微镜下观察，自噬体典型形态为双层膜结构包裹未降解的胞质成分或细胞器。与对照组比较，模型组大鼠海马CA1区自噬体数量减少；与模型组比较，Ses-L组、Ses-H组和Donepezil组大鼠海马CA1区自噬体数量增多；与Ses-L组比较，Ses-H组和Donepezil组大鼠海马CA1区自噬体数量增多；与Ses-H组比较，Ses-H+Compound C组大鼠海马CA1区自噬体数量减少。见图3。

2.6　各组大鼠海马CA1区组织中Beclin1、AMPK和SIRT1蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p-AMPK/AMPK比值

Western blotting法检测结果显示：与对照组比较，模型组大鼠海马CA1区组织中Beclin1和SIRT1蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p-AMPK/AMPK比值均降低（P<0.05）；与模型组比较，Ses-L组、Ses-H组和Donepezil组大鼠海马CA1区组织中Beclin1和SIRT1蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p-AMPK/AMPK比值均升高（P<0.05）；与Ses-L组比较，Ses-H组和Donepezil组大鼠海马CA1区组织中Beclin1和SIRT1蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p-AMPK/AMPK比值均 升 高（P<0.05）；与 Ses-H 组 比 较，Ses-H+Compound C组大鼠海马CA1区组织中Beclin1和SIRT1蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p-AMPK/AMPK比值均降低（P<0.05）。见图4和表4。

3 讨 论

AD是一种常见的痴呆症，其伴有严重的记忆丧失，并以明显的神经病理学变化为特征，如Aβ斑块沉积和突触障碍等^［14-17］。研究^［18］显示：自噬在AD中受到损害，导致功能失调的细胞器积累、错误折叠的蛋白质聚集和神经元凋亡；自噬的激活会减轻化学治疗小鼠的认知功能障碍^［19］。本研究通过右侧脑室注射Aβ_25-35以构建AD模型，跳台实验属于被动回避实验，是评估实验动物学习和记忆能力的实验方法之一，通过动物对电击的回避行为，评估其学习和记忆功能。本研究跳台实验检测结果显示：与对照组比较，模型组大鼠跳台潜伏期缩短，触电数增加。Morris水迷宫实验是评估实验动物空间学习和记忆能力的常用方法，Morris水迷宫实验检测结果显示：与对照组比较，模型组大鼠逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少。提示模型组大鼠出现学习和记忆能力明显下降。为全面评估海马CA1区的病变程度，本研究采用HE染色观察各组大鼠海马组织病理形态，采用TUNEL染色检测各组大鼠海马组织中神经元凋亡情况，采用透射电子显微镜观察各组大鼠海马CA1区自噬体形成情况，结果显示：与对照组比较，模型组大鼠海马CA1区病理损伤严重、神经元大量凋亡、自噬体形成数目减少、自噬相关蛋白Beclin1表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下调，提示AD大鼠的自噬受到抑制，且神经元大量凋亡。

Ses是芝麻中最丰富的木质素，其可通过抑制细胞凋亡对缺氧诱导的神经元发挥保护作用^［20-22］。Ses改善了AD小鼠的认知功能障碍^［23］。本研究结果显示：与模型组比较，Ses-L组、Ses-H组和Donepezil组大鼠认知功能障碍得到改善，海马CA1区病理损伤减轻，神经元凋亡受到抑制，且Ses剂量越高，该趋势越明显；而与Donepezil组比较，Ses-H组对应指标的变化无显著性差异，提示Ses可抑制AD大鼠神经元凋亡，改善大鼠认知功能障碍。Ses可促进大鼠海马CA1区自噬体的形成及自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ的表达，且Ses剂量越高，促进作用越明显，表明Ses可激活AD大鼠自噬的发生。

AMPK/SIRT1作为自噬相关通路，磷酸化的AMPK可激活SIRT1，活化的SIRT1可以调节自噬体的形成^［24］。水陆地黄胶囊通过激活AMPK/SIRT1通路增强足细胞自噬，进而对糖尿病肾病大鼠发挥保护作用^［25］；二甲双胍通过激活AMPK/SIRT1介导的自噬来减轻小鼠骨关节炎模型中软骨的退化^［26］；二氢杨梅素可以改善AD模型大鼠的认知障碍，机制与激活AMPK/SIRT1通路有关^［27］。激活SIRT1可保护PC12神经元免受高糖诱导的凋亡^［28］。本研究结果显示：模型组大鼠海马CA1区组织中p-AMPK和SIRT1蛋白表达受到抑制，而Ses可促进p-AMPK和SIRT1蛋白表达，且Ses剂量越高，对应蛋白的表达越高，Ses可能通过激活AMPK/SIRT1介导的自噬来改善AD大鼠的学习和记忆能力。本研究将经高剂量Ses处理后的AD大鼠再用AMPK/SIRT1通路抑制剂Compound C进行干预，结果显示：Compound C减弱了高剂量Ses对神经元凋亡的抑制、自噬的促进以及学习和记忆能力的改善作用。

综上所述，Ses通过激活AMPK/SIRT1介导的自噬通路改善AD大鼠的学习和记忆能力，为进一步开发治疗AD的药物提供了新的参考依据。但Ses对AD大鼠学习和记忆能力的改善作用可能涉及的通路较多，其他通路有待后续实验进一步深入探究。

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基金资助

黑龙江省教育厅省属高等学校基本科研业务费科研项目(2024-KYYWF-0522)