急性冷暴露/复温所致大鼠心肌损伤模型的建立

Establishment of myocardial injury model of rats induced by acute cold exposure/rewarming

摘要

目的 筛选适宜的急性冷暴露（ACE）温度和复温时间，建立其诱导的大鼠心肌损伤模型，并通过血液生化学、病理形态学和分子生物学等指标综合评价模型建立条件的合理性及可行性。 方法 30只雄性Wistar大鼠随机分为-10 ℃、-15 ℃和-20 ℃冷暴露组，每组10只。通过观察各组大鼠死亡率确定最佳造模参数（温度和时间）。另取50只雄性Wistar大鼠随机分为对照组和急性冷暴露/复温（ACE/R）组，根据复温时间分为6/0、6/6、6/12和6/24 h组，每组10只。采用-15 ℃冷暴露6 h后复温相应时间建立ACE/R模型。检测各组大鼠核心体温，并评估各组大鼠心脏功能。HE染色观察各组大鼠心肌组织病理形态表现，测定各组大鼠血清中心肌肌钙蛋白I（cTnI）水平和天冬氨酸氨基转移酶（AST）及乳酸脱氢酶（LDH）活性，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测各组大鼠心肌组织中白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素18（IL-18）和白细胞介素6（IL-6）水平，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组大鼠心肌组织中IL-1β、IL-18、IL-6和肿瘤坏死因子α（TNF-α） mRNA表达水平。 结果 与对照组比较，不同时间点ACE/R组大鼠核心体温均明显降低（P<0.05或P<0.01）。与对照组比较，6/6、6/12和6/24组大鼠左室射血分数（LVEF）和左室短轴缩短率（LVFS）均明显降低（P<0.05或P<0.01），6/12组大鼠左心室舒张末期内径（LVIDd）和左心室收缩末期内径（LVIDs）明显升高（P<0.05）。与对照组比较，6/12组大鼠血清中cTnI水平和AST及LDH活性均明显升高（P<0.01）；HE染色，与对照组比较，6/12组大鼠心肌纤维排列紊乱、间隙增宽，伴大量炎症细胞浸润。ELISA法，与对照组比较，6/12组大鼠心肌组织中IL-1β、IL-18及IL-6水平明显升高（P<0.01）。RT-qPCR法，与对照组比较，6/12组大鼠心肌组织中IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α mRNA表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）。 结论 采用雄性Wistar大鼠于-15 ℃冷空气暴露6 h后室温复温12 h可建立ACE/R心肌损伤模型。

Abstract

Objective To screen the appropriate temperature and rewarming time of acute cold exposure （ACE） for establishing the rat model of myocardial injury induced by ACE， and to comprehensively evaluate the rationality and feasibility of the model establishment conditions through blood biochemistry， pathomorphology and molecular biology indicators. Methods Thirty male Wistar rats were randomly divided into -10 ℃， -15 ℃ and -20 ℃ cold exposure groups， with 10 rats in each group. The optimal modeling parameters （temperature and time） were determined by observing the mortality rates of the rats in various groups. Another fifty male Wistar rats were randomly divided into control group and rewarming （ACE/R） groups， which were further divided into 6/0， 6/6， 6/12 and 6/24 h groups according to rewarming time， with 10 rats in each group. The ACE/R model was established by cold exposure at -15 ℃ for 6 h followed by rewarming for corresponding time. The core body temperatures of the rats in various groups were detected， and the cardiac function of the rats in various groups was evaluated. HE staining was used to observe the pathological morphology of myocardium tissue of the rats in various groups； the serum levels of cardiac troponin I （cTnI） and the activities of aspartate aminotransferase （AST） and lactate dehydrogenase （LDH） of the rats in various groups were measured； enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect the levels of interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-18 （IL-18） and interleukin-6 （IL-6） in the myocardium tissue of the rats in various groups； real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） was used to detect the expression levels of IL-1β， IL-18， IL-6 and tumor necrosis factor-α （TNF-α） mRNA in the myocardium tissue of the rats in various groups. Results Compared with control group， the core body temperatures of the rats in ACE/R groups at different time points were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）. Compared with control group， the left ventricular ejection fraction （LVEF） and left ventricular fractional shortening （LVFS） of the rats in 6/6， 6/12 and 6/24 groups were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）， and the left ventricular internal diameter in diastole （LVIDd） and left ventricular internal diameter in systole （LVIDs） of the rats in 6/12 group were significantly increased （P<0.05）. Compared with control group， the serum level of cTnI and the activities of AST and LDH of the rats in 6/12 group were significantly increased （P<0.01）. HE staining results showed that compared with control group， the myocardium tissue of the rats in 6/12 group showed disordered arrangement of myocardial fibers， widened intercellular spaces， and a large number of inflammatory cell infiltration. The ELISA results showed that compared with control group， the levels of IL-1β， IL-18 and IL-6 in the myocardium tissue of the rats in 6/12 group were significantly increased （P<0.01）. The RT-qPCR results showed that compared with control group， the expression levels of IL-1β， IL-18， IL-6 and TNF-α mRNA in the myocardium tissue of the rats in 6/12 group were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion The ACE/R myocardial injury model can be established in the male Wistar rats by exposure of cold air at -15 ℃ for 6 h followed by rewarming at room temperature for 12 h.

Graphical abstract

关键词

急性冷暴露 / 心肌损伤 / 复温 / Wistar大鼠 / 疾病模型， 动物

Key words

Acute cold exposure / Myocardial injury / Rewarming / Wistar rats / Disease model， animal

全球疾病负担研究^［1］显示：2019年全球约1.69亿例死亡与非适宜温度暴露相关，其中低温导致的死亡风险显著高于高温。这一趋势在我国尤为突出，全国性数据分析研究^［2］显示：我国寒冷暴露相关死亡率为4.3/10万，死亡归因分值高达32.0%。高纬度和高原地区的冬季户外活动及低温环境从业人员面临着冷暴露损伤的威胁。急性冷暴露（acute cold exposure，ACE）会造成暴露部位皮肤和皮下组织的损伤，导致机体低体温，还可引发心脏、肾脏和肺等器官衰竭^［3-6］。复温虽然是冷暴露损伤系统性治疗的关键步骤^［7］，但急性冷暴露/复温（acute cold exposure/rewarming，ACE/R）过程中的血流再通可引发心肌缺血再灌注损伤，伴随炎症反应暴发和心肌细胞凋亡，最终加重心肌损伤^［8-9］。

目前，冷暴露损伤动物模型主要采用4 ℃冷水或冷空气循环暴露法建立，暴露时长为1 d至数周，属于慢性冷暴露模型。此类模型难以准确模拟机体寒冷暴露的双重特性，既具有延迟效应与短暂性损伤，又存在直接作用和持久性影响^［10］。因此，本研究选用雄性Wistar大鼠，通过-15 ℃冷空气暴露6 h后复温12 h的方法，建立ACE/R心肌损伤模型，并通过检测大鼠核心体温、心功能、血清心肌损伤标志物活性、心肌组织病理形态学变化及心肌组织炎症因子水平和mRNA表达水平进行综合评价。该模型为填补ACE/R心肌损伤动物模型提供参考，并改善传统慢性模型难以模拟急性损伤过程的缺陷，为深入分析ACE/R所致心肌损伤的机制提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1　实验动物、主要试剂和仪器

80只SPF级雄性Wistar大鼠，体质量200~220 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK-（辽）2020-0001，实验动物使用许可证号：SYXK-（吉）2022-0017。动物饲养于清洁通风环境中，维持12 h光照/12 h黑暗的昼夜循环，温度23 ℃~25 ℃，相对湿度65%~75%。定期更换垫料并进行环境消毒，提供标准饲料及清洁饮水，大鼠适应性饲养1周后进行实验。心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（江苏酶标生物科技有限公司），乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）试剂盒以及白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素18（interleukin-18，IL-18）和白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所），cDNA逆转录试剂盒和PerfectStart^® Green qPCR SuperMix（北京全式金生物技术股份有限公司）。低温实验舱（青岛海尔公司），BL-420I信息化集成化信号采集与处理系统（成都泰盟软件有限公司），Vivid I便携彩色多普勒超声仪（美国通用电气公司），超低温冰箱（美国NBS公司），SpectraMax PC plus384酶标仪（美国Molecular Devices公司），组织包埋机和病理切片机（德国Leica Biosystems公司），光学显微镜（日 本 Olympus 公 司），手 持 电 动 均 质 仪 （美 国BioSpec公司），高速低温离心机（德国Heraeus公司），T6紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）分析系统Mx3000P（美国安捷伦科技有限公司）。

1.2　实验动物分组和模型制备

30只雄性Wistar大鼠，按体质量分为-10 ℃、-15 ℃和-20 ℃冷暴露组，每组10只。将各组大鼠置于相应设定温度（-10 ℃、-15 ℃或-20 ℃）的低温实验舱中进行冷暴露。观察并记录12 h内各组大鼠的生存状态，计算冷暴露12 h内各组大鼠的死亡率。50只雄性Wistar大鼠，按体质量分为对照组和ACE/R组，根据复温时间分为6/0、6/6、6/12和6/24 h组，每组10只。ACE/R组大鼠单笼放置于低温实验舱（温度：-15 ℃±1 ℃）内进行冷暴露6 h；对照组大鼠置于室温环境（温度：24 ℃±1 ℃）。实验期间所有大鼠均禁食禁水。冷暴露6 h结束后，将ACE/R组大鼠转移至室温环境进行复温，分别于复温后相应时间（0、6、12和24 h）采集大鼠血样及心脏组织，用于后续相关指标检测。

1.3　各组大鼠核心体温测定

采用BL-420I信息化集成化信号采集与处理系统，配合直肠温度探头（插入深度距肛门约2 cm），测定各组大鼠的核心体温。测量时间点：冷暴露前、冷暴露结束时和复温结束时。所有体温测量均在恒定的环境温度（24±1）℃下进行。

1.4　彩色多普勒超声评估各组大鼠心脏功能

腹腔注射3%戊巴比妥钠30 mg·kg^-1麻醉大鼠后，胸部剃毛。采用彩色多普勒超声成像系统评估心脏功能，将超声探头置于大鼠左心室长轴切面，稳定后测定以下参数：左室射血分数（left ventricular ejection fractions，LVEF）、左室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左心室舒张末期内径（left ventricular internal diameter in diastole，LVIDd）和左心室收缩末期内径（left ventricular internal diameter in systole，LVIDs）。每个参数连续测量3个心动周期，取平均值。

1.5　生化试剂盒检测各组大鼠血清中cTnI水平和AST及LDH活性

腹腔注射3%戊巴比妥钠30 mg·kg^-1麻醉大鼠后，腹主动脉取血1 mL。室温静置2 h后，2 500 g离心10 min，分离血清，分装于EP管，-80 ℃保存备用。严格按照生化试剂盒说明书操作，检测血清中cTnI水平和AST及LDH活性。

1.6　HE染色观察各组大鼠心肌组织病理形态表现

腹腔注射3%戊巴比妥钠30 mg·kg^-1麻醉大鼠，迅速剖开胸腔，自主动脉根部离断并取出心脏。心脏立即置于预冷的生理盐水中漂洗去除残留血液，随后转移至4%多聚甲醛溶液中固定24 h。取心肌组织块，常规石蜡包埋、切片。切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，进行HE染色。染色后的切片经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。于光学显微镜下观察心肌组织病理形态表现并拍照。

1.7　ELISA法检测各组大鼠心肌组织中IL-1β、IL-18和IL-6水平

称取大鼠心肌组织50 mg置于5 mL EP管中，按质量体积比1∶9（W/V）加入预冷的生理盐水，制备10%（W/V）心肌组织匀浆。使用手持式电动匀质仪，在冰水浴条件下，以12 000 r·min^-1匀浆至组织完全裂解。匀浆液于4 ℃、3 500 g离心10 min，小心吸取上清液，分装于EP管中，-80 ℃保存备用。严格按照ELISA检测试剂盒说明书操作，检测各组大鼠心肌组织中IL-1β、IL-18和IL-6水平。

1.8　RT-qPCR法检测各组大鼠心肌组织中IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α mRNA表达水平

取大鼠心肌组织，加入TRIzol试剂。在冰浴条件下，充分匀浆裂解组织。匀浆液于4 ℃、12 000 g离心10 min，提取总RNA。使用紫外分光光度计测定总RNA浓度和纯度。配制逆转录反应体系，合成cDNA，进行PCR反应。PCR反应条件：预变性，94 ℃，30 s扩增，94 ℃，5 s变性；55 ℃，30 s退火；72 ℃，10 s延伸，共40个循环。以GAPDH作为内参基因，采用2^-△△Ct法计算目的基因表达水平。所有引物均由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。引物序列见表1。

1.9　统计学分析

采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析。各组大鼠核心体温，心功能指标，血清中cTnI水平和AST及LDH活性，心肌组织中IL-1β、IL-18和IL-6水平以及IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α mRNA表达水平均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用Tukey’s检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　ACE最适温度和时间

冷 暴 露 6 h 后，-10 ℃组大鼠无死亡，-15 ℃组大鼠死亡率为10%，-20 ℃组大鼠死亡率达到30%。冷暴露7 h后，-10 ℃组大鼠仍无死亡，-15 ℃组大鼠死亡率上升至30%，-20 ℃组大鼠死亡率为80%。当冷暴露延长至12 h时，-10 ℃组大鼠死亡率为40%，而-15 ℃组和-20 ℃组大鼠死亡率均达到100%。见图1。在-15 ℃下冷暴露6 h时的条件既能诱导明显的生理应激和组织损伤风险，又能确保大鼠存活以进行后续指标的检测。因此，本研究选定-15 ℃冷暴露6 h后作为建立大鼠ACE/R心肌损伤模型的关键参数，并基于此条件进行复温时间点的优化确定。

2.2　各组大鼠冷暴露前后及复温结束时的核心体温

与对照组比较，-15 ℃冷暴露6 h结束时，不同时间点ACE/R组大鼠核心体温均明显降低（P<0.05或P<0.01）。复温结束时，各组大鼠核心体温均恢复至基线水平。见表2。

2.3　各组大鼠心脏功能参数

彩色多普勒超声检查结果显示：与对照组比较，6/6、6/12和6/24组大鼠LVEF和LVFS均明显降低（P<0.05或P<0.01）， 6/12组大鼠LVIDd和LVIDs明显升高 （P<0.05）。见图2和3。

2.4　各组大鼠血清中cTnI水平和AST及LDH活性

生化试剂盒检测结果显示：与对照组比较，6/6组大鼠血清中AST和LDH明显升高（P<0.01），6/12组大鼠血清中cTnI水平和AST及LDH活性均明显升高（P<0.01），6/24组大鼠血清中LDH活性明显升高（P<0.01）。见图4。

2.5　各组大鼠心肌组织病理形态表现

HE染色结果显示：对照组大鼠心肌细胞结构完整、排列整齐，胞质染色均匀，心肌间质无水肿及炎症细胞浸润。ACE/R组大鼠在各复温时间点均呈现不同程度的心肌损伤，主要表现为心肌细胞肿胀、排列紊乱，胞浆皱缩、着色深浅不均，部分胞浆呈不规则粗颗粒状，细胞核浓集，局部心肌纤维及间质变性、水肿，心肌纤维间隙增宽及炎症细胞浸润，其中复温后12和24 h时大鼠的心肌组织病理损伤较为严重。见图5。

2.6　各组大鼠心肌组织中IL-1β、IL-18和IL-6水平

ELISA法检测结果显示：与对照组比较，6/0组和6/6组大鼠心肌组织中IL-1β水平明显升高（P<0.01），6/12组大鼠心肌组织中IL-1β、IL-18和IL-6水平均明显升高（P<0.01），6/24组大鼠心肌组织IL-1β和IL-6水平明显升高（P<0.01）。见图6。

2.7　各组大鼠心肌组织中IL - 1β、IL - 18、IL - 6和TNF - α mRNA表达水平

RT-qPCR法检测结果显示：与对照组比较，6/0组大鼠心肌组织中IL-1β mRNA表达水平明显升高（P<0.05），6/6组大鼠心肌组织中IL-18和IL-1β mRNA表达水平均明显升高（P<0.01），6/12组大鼠心肌组织中IL-18、IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01），6/24组大鼠心肌组织中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01）。见图7。

3 讨 论

ACE的病理生理学表现始于局部热力学失衡，可导致皮肤和皮下组织缺血及细胞代谢障碍等损伤。若冷暴露持续，大量体热通过传导和对流丧失，最终压倒机体的产热代偿机制，从而导致核心体温下降，发展为全身性低体温。当核心体温低于35 ℃时，患者可出现血压下降、意识模糊等症状，随着循环障碍加重，可引发心脏、肾脏、肺脏和肝脏等敏感器官的多器官衰竭^［3-6］。严重ACE可诱发冠状动脉痉挛和血液黏稠度增加，进而导致心肌缺血甚至心肌梗死，其机制涉及交感神经过度兴奋、内皮功能障碍和炎症反应暴发^［11］。流行病学研究^［12］显示：与冷暴露相关的心血管事件发病率呈现逐年上升趋势。研究^［13-14］发现：寒冷环境暴露与心血管疾病死亡率的显著增加存在相关性。长期冷暴露可诱导小鼠发生病理性心脏重塑，其特征表现为心肌肥厚和心肌细胞凋亡或坏死，并最终进展为心力衰竭。

然而，现有冷暴露研究主要集中于慢性损伤模型（造模周期通常为1~4周，温度范围0 ℃~10 ℃），难以准确模拟临床极端寒冷环境诱发的急性心血管事件的病理特征。为建立更贴近临床急性事件特征的模型，本研究通过温度和暴露时间的系统筛选，确立了ACE心肌损伤模型的最佳建立条件：雄性大鼠于-15 ℃环境中冷暴露6 h。临床上，复温是冷暴露损伤系统性治疗的关键步骤^［7］，其最大优点在于其将一个强烈的生理应激事件转化为一个可控制的、包含“启动-响应-恢复”全过程的精密研究模型。但ACE/R过程中的血流再通可引发心肌缺血再灌注损伤^［8-9］，表现为心肌纤维断裂、细胞水肿和炎性细胞浸润及充血等组织学改变，伴随炎症反应暴发和心肌细胞凋亡，形成恶性循环，最终加重心肌损伤。本研究结果显示：复温12 h为大鼠心肌损伤的峰值期，这一发现为临床ACE心肌损伤的时效性干预提供了重要的实验依据。

血清心肌损伤标志物水平是评估心肌细胞损伤程度的关键指标。心肌组织损伤导致细胞膜完整性破坏，胞内特异性物质释放入血，进而引起血清标志物水平升高^［15］。AST作为一种胞质酶，其血清水平升高可反映心肌膜损伤程度^［16］。LDH作为能量代谢的关键酶，在急性心肌梗死和心力衰竭等疾病中其血清中水平明显升高^［17-18］。cTnI作为一种心肌特异性结构蛋白，是诊断心肌细胞损伤的金标准^［19-20］。本研究结果显示：复温12 h大鼠血清中cTnI水平以及AST和LDH活性均明显升高，提示此时心肌细胞损伤程度最为严重；同时，该组大鼠LVIDd和LVIDs明显升高，而LVEF和LVFS明显降低，表明心脏泵血功能发生障碍，左心室收缩和舒张功能均受到显著损伤。

心肌缺血后的损伤修复过程主要包括急性炎症期、修复期和重构期3个阶段^［21-22］。其中，急性炎症期是调控修复的关键起始阶段。适度的炎症反应有利于及时清除坏死心肌细胞并启动修复程序，而过度或持续的炎症反应则可诱发心肌细胞凋亡和细胞外基质降解，进而阻碍组织修复进程^［23-24］。炎症因子（IL-1β、TNF-α和IL-6）在免疫调节、炎症反应和细胞凋亡中均发挥核心作用^［25］。本研究结果显示：-15 ℃冷暴露6 h可显著激活大鼠心肌组织炎症反应，表现为IL-1β、IL-18和IL-6水平及其mRNA表达水平均明显升高，其中复温12 h时大鼠炎症反应达到峰值。

综上所述，本研究采用雄性大鼠于-15 ℃环境中进行6 h冷暴露后复温12 h的方法，成功建立并系统评价了ACE/R心肌损伤模型，该模型克服了传统慢性模型难以模拟急性病理进程的局限性，为深入探索冷暴露致心肌损伤的分子机制提供了关键且可靠的研究工具。

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基金资助

吉林省科技厅自然科学基金项目(YDZJ202201ZYTS246)

吉林大学实验技术项目(SYXM2025a012)