NGFR基因表达差异对PD-1抑制剂活化的T淋巴细胞促进鳞癌细胞和腺癌细胞凋亡的影响

Effect of NGFR gene expression differences on promotion of apoptosis of squamous cell carcinoma and adenocarcinoma cells by PD-1 inhibitor-activated T lymphocytes

摘要

目的 基于癌症基因组图谱（TCGA）数据库筛选鳞状细胞癌（简称鳞癌）与腺癌差异表达基因（DEGs），通过体外细胞实验探讨神经生长因子受体（NGFR）基因在程序性死亡受体1（PD-1）抑制剂活化的T淋巴细胞促进鳞癌和腺癌细胞凋亡中的作用。 方法 从TCGA数据库中下载人食管、肺和宫颈不同癌症鳞癌和腺癌组织的核糖核酸测序（RNA-Seq）数据，采用R软件DESeq2软件包分析DEGs，通过基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析筛选与磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）和Janus激酶（JAK）/信号转导及转录激活因子（STAT）信号通路相关的基因，并进行生存预后分析确定NGFR基因为结果基因。体外细胞实验选择肺腺癌（LUAD）A549细胞株、宫颈腺癌（CEAD）HeLa细胞株、肺鳞癌（LUSC）SK-MES-1细胞株和宫颈鳞癌（CESC）SiHa细胞株，将细胞分为对照组（未经处理的肿瘤细胞）、OE-NC组（空载体质粒转染48 h后的肿瘤细胞）、si-NC组（阴性siRNA转染48 h后的肿瘤细胞）和OE-NGFR组（NGFR基因过表达质粒转染48 h后的肿瘤细胞）、si-NGFR组（NGFR基因siRNA转染48 h后的肿瘤细胞）。构建肿瘤细胞与T淋巴细胞共培养体系，分为对照组、Control+ T lymophocytes组、 Control+T lymophocytes+anti-PD-1组、 OE-NC/si-NC组、 OE-NC/si-NC+ T lymophocytes组、OE-NC/si-NC+T lymophocytes+anti-PD-1组、OE-NGFR/si-NGFR组、OE-NGFR/ si-NGFR+T lymophocytes组和OE-NGFR/si-NGFR+T lymophocytes+anti-PD-1组。以过表达质粒转染提高腺癌细胞中NGFR基因的表达，并采用siRNA敲低鳞癌细胞中NGFR基因的表达。采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组肿瘤细胞中NGFR mRNA表达水平，Western blotting法检测各组肿瘤细胞中NGFR蛋白表达水平，流式细胞术检测各组肿瘤细胞凋亡率，并计算凋亡率的相对增加倍数。 结果 TCGA数据库分析结果显示NGFR基因在鳞癌组织中表达水平明显高于腺癌组织（P<0.05）。体外细胞实验，A549细胞株和HeLa细胞株经NGFR基因过表达质粒转染后，NGFR mRNA和蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）；与Control+T lymphocytes+anti-PD-1组和OE-NC+T lymphocytes+anti-PD-1组比较，OE-NGFR+T lymphocytes+anti-PD-1组腺癌细胞凋亡率的相对增加倍数明显升高（P<0.05）。SK-MES-1细胞株和Siha细胞株经NGFR基因siRNA转染后，NGFR mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.001）；与Control+T lymophocytes+anti-PD-1组和si-NC+T lymophocytes+anti-PD-1组比较，si-NGFR+T lymophocytes+anti-PD-1组鳞癌细胞凋亡率的相对增加倍数明显降低（P<0.001）。 结论 NGFR基因表达水平能够正向调控PD-1抑制剂活化的T淋巴细胞对鳞癌和腺癌细胞的促凋亡作用，NGFR基因高表达能够增强鳞癌和腺癌细胞对PD-1抑制剂的敏感性，其可能成为预测PD-1抑制剂疗效的潜在生物标志物。

Abstract

Objective To screen for differentially expressed genes （DEGs） between squamous cell carcinoma （abbreviated as squamous carcinoma） and adenocarcinoma based on The Cancer Genome Atlas （TCGA） database， and to investigate the role of nerve growth factor receptor （NGFR） gene in promoting apoptosis of squamous carcinoma and adenocarcinoma cells by T lymphocytes activated by programmed death receptor 1 （PD-1） inhibitor through in vitro cell experiments. Methods RNA sequencing （RNA-Seq） data of squamous carcinoma and adenocarcinoma tissues from human esophagus， lung and cervix were downloaded from TCGA database. R software DESeq2 package was used to analyze DEGs. Gene Ontology （GO） functional enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） signaling pathway enrichment analysis were used to screen for genes related to phosphatidylinositol 3‑kinase （PI3K）/protein kinase B （AKT） and Janus kinase （JAK）/signal transducer and activator of transcription （STAT） signaling pathways， and survival prognosis analysis was performed to determine NGFR gene as the outcome gene. For in vitro cell experiments， lung adenocarcinoma （LUAD） A549 cell line， cervical adenocarcinoma （CEAD） HeLa cell line， lung squamous carcinoma （LUSC） SK-MES-1 cell line and cervical squamous carcinoma （CESC） SiHa cell line were selected. The cells were divided into control group （untreated tumor cells）， OE-NC group （tumor cells 48 h after empty vector plasmid transfection）， si-NC group （tumor cells 48 h after negative siRNA transfection）， OE-NGFR group （tumor cells 48 h after NGFR gene overexpression plasmid transfection）， and si-NGFR group （tumor cells 48 h after NGFR gene siRNA transfection）. The co-culture system of tumor cells and T lymphocytes was established and divided into control group， Control+T lymphocytes group， Control+T lymphocytes+anti-PD-1 group， OE-NC/si-NC group， OE-NC/si-NC+T lymophocytes group， OE-NC/si‑NC+T lymophocytes+anti-PD-1 group， OE-NGFR/si-NGFR group， OE-NGFR/si-NGFR+T lymophocytes group， and OE-NGFR/si-NGFR+T lymophocytes+anti-PD-1 group. Overexpression plasmid was used to increase the expression of NGFR gene in adenocarcinoma cells， and siRNA was used to knock down the expression of NGFR gene in squamous carcinoma cells. Real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） was used to detect the NGFR mRNA expression level in tumor cells in various groups； Western blotting method was used to detect the NGFR protein expression level in tumor cells in various groups； flow cytometry was used to detect the apoptotic rates of tumor cells in various groups， and the relative increase folds of apoptie rates were calculated. Results The TCGA database analysis results showed that the expression level of NGFR gene in squamous carcinoma tissue was significantly higher than that in adenocarcinoma tissue （P<0.05）. The in vitro cell experiment results showed that after transfection with NGFR gene overexpression plasmid， the NGFR mRNA and protein expression levels in A549 cells and HeLa cells were significantly increased （P<0.05）； compared with Control+T lymophocytes+anti-PD-1 group and OE-NC+T lymophocytes+anti-PD-1 group， the relative increase fold in apoptotic rate of adenocarcinoma cells in OE-NGFR+T lymophocytes+anti-PD-1 group was significantly increased （P<0.05）. After transfection with NGFR gene siRNA， the NGFR mRNA and protein expression levels in SK-MES-1 cells and SiHa cells were significantly decreased （P<0.001）； compared with Control+T lymophocytes+anti-PD-1 group and si-NC+T lymophocytes+anti-PD-1 group， the relative increase fold in apoptotic rate of squamous carcinoma cells in si-NGFR+T lymophocytes+anti-PD-1 group was significantly decreased （P<0.001）. Conclusion The expression level of NGFR gene can positively regulate the pro-apoptotic effect of T lymphocytes activated by PD-1 inhibitor on the squamous carcinoma and adenocarcinoma cells. High expression of NGFR gene can enhance the sensitivity of squamous carcinoma and adenocarcinoma cells to PD-1 inhibitor， and it may serve as a potential biomarker for predicting the efficacy of PD‑1 inhibitor.

Graphical abstract

关键词

神经生长因子受体 / 鳞状细胞癌 / 腺癌 / 差异表达基因 / 细胞凋亡 / 程序性死亡受体1

Key words

Nerve growth factor receptor / Squamous cell carcinoma / Adenocarcinoma / Differentially expressed genes / Apoptosis / Programmed death receptor 1

以程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）和程序性死亡受体配体（programmed cell death ligand 1，PD-L1）抑制剂为代表的免疫检查点抑制剂（immunecheckpoint inhibitors，ICIs）的出现，改变了多种晚期癌症的治疗策略。然而在临床应用过程中，PD-1/PD-L1抑制剂的总体有效率仍然有限，多数患者未能从该治疗中获益^［1-4］。研究^［5-9］发现：在多种类型癌症（食管癌、肺癌和宫颈癌等）中，鳞状细胞癌（简称鳞癌）和腺癌等不同组织学亚型对PD-1/PD-L1抑制剂的应答存在显著差异，鳞癌通常表现出较腺癌更高的敏感性。这种差异可能与鳞癌较高的PD-L1表达水平和肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）等因素有关^［10-15］。其中，肿瘤细胞PD-L1的表达水平是影响其与T淋巴细胞PD-1结合和介导肿瘤免疫逃逸的关键因素，也是预测PD-1/PD-L1抑制剂疗效的重要生物标志物之一。研究^［16］显示：PD-L1的表达受到磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信号通路和Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信号转导及转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信号通路的精密调控：PI3K-AKT信号通路的激活可通过活化下游转录因子，如STAT3等诱导PD-L1的表达；肿瘤微环境中干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）等细胞因子可通过激活JAK/STAT通路，尤其是STAT1/STAT3信号轴显著上调PD-L1表达，是诱导PD-L1表达的核心分子机制。因此，从上述关键信号通路入手，在鳞癌与腺癌中筛选与之相关的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），对寻找具有预测价值的新靶点和新型生物标志物具有重要意义。

神经生长因子受体（nerve growth factor receptor，NGFR）是肿瘤坏死因子受体超家族的一员。NGFR在神经系统发育、细胞存活与凋亡等过程中发挥关键作用^［17-18］。研究^［19-20］发现：NGFR在多种实体肿瘤（黑色素瘤和头颈部鳞状细胞癌等）中也存在异常表达，并参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭及其干细胞特性的维持。除能直接调控肿瘤细胞的生物学行为外，NGFR在肿瘤微环境中的潜在免疫调节作用也逐渐受到关注^［21-22］。然而，NGFR的活性及其影响肿瘤对PD-1/PD-L1抑制剂治疗应答情况的核心机制目前尚不明确。本研究基于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库，并应用基因本体论（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析及生存预后分析，筛选出在鳞癌和腺癌中表达差异显著的NGFR基因。为验证其在鳞癌和腺癌中的普适性生物学功能，本研究选取发病率高且具有明确分型的食管癌、肺癌和宫颈癌3个解剖部位来源的癌症作为研究对象，并选取其代表性的细胞株进行NGFR基因的过表达和敲低，构建体外共培养体系模拟体内PD-1抑制剂活化T淋巴细胞对肿瘤细胞的免疫杀伤过程，阐明NGFR基因表达水平对PD-1抑制剂疗效的影响，为NGFR作为预测性生物标志物和潜在的治疗靶点提供实验依据。

1 材料与方法

1.1　细胞、主要试剂及仪器

人肺鳞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）SK-MES-1细胞株、人宫颈鳞癌（cervical squamous cell carcinoma，CESC）SiHa 细 胞 株、人 肺 腺 癌 （lung adenocarcinoma，LUAD）A549细胞株和人宫颈腺癌（cervical adeno carcinoma，CEAD）HeLa细胞株均购自美国模式培养物集存（American Type Culture Collection，ATCC）细胞库。帕博利珠单抗购自美国默沙东公司，NGFR特异性小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）及阴性对照siRNA、NGFR过表达质粒和空载体质粒由武汉金拓思生物科技公司构建，脂质体购自上海聚顶生物科技有限公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自浙江天杭生物科技有限公司，DMEM培养基、1%青-链霉素双抗、胰酶、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、人外周血淋巴细胞分离液、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）试剂盒、RIPA裂解液、二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid assay，BCA）蛋白浓度测定试剂盒、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate， SDS） - 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）凝胶配制试剂盒、Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液、快速转膜液、含Tween 20的Tris缓冲盐溶液（Tris buffered saline with Tween-20，TBST）、ECL化学发光试剂盒和Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒均购自北京兰杰柯科技有限公司，NGFR抗体、GAPDH抗体和HRP标记的二抗购自武汉ABclonal公司，人T淋巴细胞扩增培养基和人CD3/CD28 T淋巴细胞激活剂（ImmunoCult™）购自加拿大STEMCELL公司，NGFR和GAPDH引物由武汉金拓思生物科技公司合成。CO₂恒温培养箱 （型号：HERACELL 150i， 美国Thermo公司），台式高速大容量冷冻离心机（型号：Centrifuge 5810R，德国Eppendorf公司），倒置荧光显微镜（型号：IX73，日本Olympus公司），电热恒温水浴箱（型号：CS501，上海博讯实业有限公司），-70 ℃超低温冰箱 （型号：Forma-705， 美国Thermo公司），RT-qPCR仪（型号：C1000 Thermal Cycler）、电泳仪（型号：PowerPac Basic）和化学发光凝胶成像仪（型号：ChemiDoc XRS+System）（美国Bio-Rad公司），酶标仪（型号：Infinite 200 PRO，瑞士TECAN公司），流式细胞仪（型号：BD FACSLyric，美国BD公司）。

1.2　数据来源和处理

通过TCGA数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下载截至2025年3月人类食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma， ESSC）、 食 管 腺 癌（esophageal adenocarcinoma，ESAD）、LUSC、LUAD、CESC和CEAD的核糖核酸测序（RNA-Seq）Count数据，采用R软件（V4.3.0）及其附带的DEseq软件包对各种癌症数据分别进行鳞癌与腺癌基因的差异分析并取交集，获得差异倍数（fold change，FC），Log₂ FC≥1且P<0.05的DEGs被认为具有统计学意义。通过GO功能和KEGG信号通路富集分析DEGs在生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cell components， CC） 和分子功能（molecular function，MF）方面的作用，采用R软件对DEGs进行GO功能和KEGG信号通路富集分析，GO和KEGG分析均以P=0.05为筛选标准，并使用ggplot2软件包对富集结果进行可视化。筛选其中与PI3K/AKT信号通路和JAK/STAT信号通路相关的DEGs作为研究的核心基因，绘制生存曲线，进一步分析核心基因与患者总生存期（overall survival，OS）的关系，从中筛选出结果基因进行体外细胞实验验证。

1.3　细胞培养和传代

人LUSC细胞株SK-MES-1、CESC细胞株SiHa、LUAD细胞株A549和CEAD细胞株HeLa的培养严格遵循标准细胞培养方案^［23］。所有细胞均使用含10% FBS和1%青-链霉素双抗的DMEM完全培养基，于37 ℃、5% CO₂的恒温培养箱中常规培养，待细胞生长至细胞汇合度为80%~90%时胰酶消化传代。

1.4　细胞处理和分组

取处于对数生长期的肿瘤细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔5×10⁵个细胞，第2天进行转染。细胞随机分为对照组（未经处理的肿瘤细胞）、OE-NC组（空载体质粒转染48 h后的肿瘤细胞）、si-NC组（阴性siRNA转染48 h后的肿瘤细胞）、OE-NGFR组（NGFR基因过表达质粒转染48 h后的肿瘤细胞）和si-NGFR组（NGFR基因siRNA转染48 h后的肿瘤细胞）。

1.5　RT-qPCR法检测各组肿瘤细胞中NGFR mRNA表达水平

采用TRIzol法提取各组细胞中总RNA，按照反转录试剂盒合成cDNA。反转录条件：37 ℃、2 min，50 ℃、15 min，85 ℃、5 min。以cDNA为模板加入引物和SYBR Green进行RT-qPCR反应。扩增条件：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，60 ℃、60 s，共40个循环，遵循RT-qPCR实验准则^［24］。以GAPDH为内参基因，采用2^-△△Ct法计算NGFR mRNA表达水平。引物序列和产物长度见表1。

1.6　Western blotting法检测各组肿瘤细胞中NGFR蛋白表达水平

实验参照Western blotting法标准进行操作^［25］，以GAPDH作为内参蛋白，NGFR和GAPDH一抗以1∶1 000稀释，二抗以1∶2 000稀释。采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，计算NGFR蛋白表达水平。NGFR蛋白表达水平=NGFR蛋白条带灰度值/GAPDH蛋白条带灰度值。

1.7　构建肿瘤细胞与T淋巴细胞共培养体系和分组

使用淋巴分离液分离健康人外周血淋巴细胞，按照淋巴细胞中T淋巴细胞占比60%~80%^［26］计算T淋巴细胞数，本研究按70%换算。将密度为1.43×10⁶ mL^-1的淋巴细胞接种于ImmunoCult^TM-XF T淋巴细胞扩增培养基中，加入25 mL·L^-1的ImmunoCult^TM 人CD3/CD28 T淋巴细胞激活剂，并置于37 ℃、5% CO₂培养箱中孵育48 h。孵育完成后肿瘤细胞+T淋巴细胞相关组将肿瘤细胞与T淋巴细胞按照1∶2的比例混合共培养24 h；肿瘤细胞+T淋巴细胞+anti-PD-1相关组将肿瘤细胞与T淋巴细胞按照1∶2的比例混合共培养同时加入50 mg·L^-1帕博利珠单抗共同作用24 h。细胞分组：①对照组，未经处理的肿瘤细胞；②Control+T lymphocytes组，未经处理的肿瘤细胞与T淋巴细胞以1∶2比例共培养24 h；③Control+T lymphocytes+anti-PD-1组，未经处理的肿瘤细胞与T淋巴细胞以1∶2比例共培养并加入50 mg·L^-1帕博利珠单抗共同作用24 h；④OE-NC/si-NC组，空载体质粒/阴性siRNA转染48 h后的肿瘤细胞；⑤OE-NC/si-NC+T lymphocytes组，空载体质粒/阴性siRNA转染48 h后的肿瘤细胞与T淋巴细胞以1∶2比例共培养24 h；⑥OE-NC/si-NC+T lymphocytes+anti-PD-1组，空载体质粒转染48 h后的肿瘤细胞与T淋巴细胞以1∶2比例共培养并加入50 mg·L^-1帕博利珠单抗共同作用24 h；⑦OE-NGFR/si-NGFR组，肿瘤细胞转染NGFR基因过表达质粒/siRNA 48 h；⑧OE-NGFR/si-NGFR+T lymphocytes组，NGFR基因过表达质粒/siRNA转染48 h后的肿瘤细胞与T淋巴细胞以1∶2比例共培养24 h；⑨OE-NGFR/si-NGFR+T lymphocytes+anti-PD-1组，NGFR基因过表达质粒/siRNA转染48 h后的肿瘤细胞与T淋巴细胞以1∶2比例共培养并加入50 mg·L^-1帕博利珠单抗共同作用24 h。收集细胞进行流式细胞术检测。

1.8　流式细胞术检测各组细胞凋亡情况

具体流程参照细胞凋亡检测试剂盒说明书，并严格遵循流式细胞术标准化指南进行操作^［27］。使用Annexin Ⅴ- FITC/PI双染法，早期凋亡细胞为FITC⁺和PI^－，晚期凋亡细胞为FITC⁺和PI⁺，计算各组细胞凋亡率。细胞凋亡率=（早期凋亡的肿瘤细胞数+晚期凋亡的肿瘤细胞数）/肿瘤细胞总数×100%。肿瘤细胞+T淋巴细胞相关组肿瘤细胞凋亡率的相对增加倍数=（肿瘤细胞+T淋巴细胞相关组细胞凋亡率-肿瘤细胞相关组细胞凋亡率）/肿瘤细胞相关组细胞凋亡率；肿瘤细胞+T淋巴细胞+ anti-PD-1相关组肿瘤细胞凋亡率的相对增加倍数=（肿瘤细胞+T lymphocytes+anti-PD-1相关组细胞凋亡率-肿瘤细胞相关组细胞凋亡率）/肿瘤细胞相关组细胞凋亡率。

1.9　统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，GraphPad Prism 10.0软件对数据进行统计学分析和制图。各组肿瘤细胞中NGFR mRNA表达水平和蛋白表达水平，各组肿瘤细胞凋亡率的相对增加倍数采用Shapiro-Wilk法进行正态性检验，均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　鳞癌和腺癌组织中DEGs

利用R软件的DEseq软件包筛出ESSC组织与ESAD组织中1 825个DEGs，其中942个DEGs在ESSC组织中高表达，883个DEGs在ESAD组织中高表达；筛出LUSC组织与LUAD组织中1 193个DEGs，其中690个DEGs在LUSC组织中高表达，503个DEGs在LUAD组织中高表达；筛出CESC组织与CEAD组织中1 517个DEGs，其中733个DEGs在CESC组织中高表达，784个DEGs在CEAD组织中高表达，利用R软件包可视化绘制热图和火山图。见图1。对ESSC、LUSC和CESC组织中高表达的DEGs取交集得到243个DEGs，对ESAD、LUAD和CEAD组织中高表达的DEGs取交集得到154个DEGs，共397个DEGs。见图2。

2.2　 NGFR基因作为研究的结果基因

通过GO功能富集分析评估397个DEGs在CC、BP和MF的潜在生物学功能，通过KEGG信号通路富集分析检查DEGs涉及的潜在信号通路。见图3。筛选出与PI3K/AKT信号通路和JAK/STAT信号通路相关的DEGs作为研究的核心基因，分别为生长激素受体（growth hormone receptor，GHR）基因、NGFR基因、神经营养酪氨酸激酶受体2（neuro trophin receptor kinase 2，NTRK2）基因、Ⅳ型胶原蛋白α6链 （collagen type Ⅳ α6 chain， COL4A6）基因和白细胞介素20受体β（interleukin 20 receptor β，IL20RB）基因，绘制生存曲线，结果显示：NGFR基因高表达与患者生存预后呈正相关关系（P<0.05）。见图4。因此选择NGFR基因作为本研究的结果基因进行体外细胞实验加以验证。

2.3　各组肿瘤细胞转染效率

倒置荧光显微镜下观察结果显示：转染NGFR siRNA的SK-MES-1细胞和SiHa细胞生长状态良好，可见明亮绿色荧光，视野下荧光细胞占80%以上，转染效率高。见图5。

2.4　各组肿瘤细胞中NGFR mRNA表达水平

与对照组比较，OE-NC组和si-NC组各肿瘤细胞中NGFR mRNA表达水平差异均无统计学意义（P>0.05），表明空载体质粒和阴性siRNA未改变肿瘤细胞中NGFR基因的表达。与对照组比较，OE-NGFR组A549和HeLa细胞中NGFR mRNA表达水平明显升高（P<0.05），si-NGFR组SK-MES-1和SiHa细胞中NGFR mRNA表达水平明显降低（P<0.001）。见表2。

2.5　各组肿瘤细胞中NGFR蛋白表达水平

与对照组比较，OE-NGFR组A549和HeLa细胞中NGFR蛋白表达水平明显升高（P<0.01），si-NGFR组SK-MES-1和SiHa细胞中NGFR蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。见图6。

2.6　各组PD-1抑制剂活化T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞后细胞凋亡率

与Control+T lymphocytes组比较，OE-NC/si-NC+T lymphocytes组肿瘤细胞凋亡率的相对增加倍数差异无统计学意义（P>0.05）。与Control+T lymphocytes+anti-PD-1组比较，OE-NC/si-NC+T lymphocytes+anti-PD-1组肿瘤细胞凋亡率的相对增加倍数差异无统计学意义（P>0.05）。在A549细胞中，与Control+T lymphocytes组和OE-NC + T lymphocytes 组 比 较，OE-NGFR + T lymphocytes组A549细胞凋亡率的相对增加倍数 明 显 升 高（P<0.001）； 与 OE-NGFR + T lymphocytes组比较，OE-NGFR+T lymphocytes+anti-PD-1组A549细胞凋亡率的相对增加倍数明显升高（P<0.001）。见图7。在SK-MES-1细胞中，与Control+T lymphocytes组和si-NC+T cells组比较，si-NGFR+T lymphocytes组SK-MES-1细胞凋亡率的相对增加倍数明显降低（P<0.001）；与si-NGFR+T lymphocytes组比较，si-NGFR+T lymphocytes+anti-PD-1组SK-MES-1细胞凋亡率的相对增加倍数明显降低（P<0.001）。见图8。在HeLa细胞中，与Control+T lymphocytes组和OE-NC + T lymphocytes 组 比 较，OE-NGFR + T lymphocytes组HeLa细胞凋亡率的相对增加倍数明显升高（P<0.001）；与OE-NGFR+T lymphocytes组比 较，OE-NGFR + T lymphocytes + anti-PD-1 组HeLa细胞凋亡率的相对增加倍数明显升高（P<0.001）。见 图 9。在 SiHa 细 胞 中，与 Control+T lymphocytes组和si-NC+T lymphocytes组比较，si-NGFR+T lymphocytes组SiHa细胞凋亡率的相对增加倍数明显降低（P<0.001）；与si-NGFR+T lymphocytes组比较，si-NGFR+T lymphocytes+ anti-PD-1组SiHa细胞凋亡率的相对增加倍数明显降低（P<0.001）。见图10。

3 讨 论

近几十年来，癌症治疗领域发生了显著变革，手术、放射治疗和化学治疗等传统手段依然是癌症治疗的基础，但靶向治疗和免疫治疗等新策略已为该领域带来了革命性变化。以PD-1和PD-L1抑制剂为代表的ICIs的出现，改变了多种晚期癌症的治疗策略。然而在临床应用中，PD-1/PD-L1抑制剂的总体有效率仍然有限，且鳞癌与腺癌等不同组织学亚型对PD-1/PD-L1抑制剂的应答也存在显著差异，鳞癌通常表现出较腺癌更高的敏感性。这种差异可能与鳞癌较高的PD-L1表达水平和TMB等因素有关，但一些低PD-L1表达水平或低TMB水平的患者反而对ICIs表现出显著反应，而高PD-L1表达水平或高TMB水平的个体可能对ICIs治疗敏感性较低，提示PD-L1和TMB作为预测性生物标志物具有变异性和复杂性。面对这种情况，目前研究者更致力于寻找能够预测免疫治疗效果的替代生物标志物，包括可能反映整体免疫状态及对ICIs应答潜力的免疫特征基因。精准而多样的预测性生物标志物对深入理解每例癌症患者的独特特征，制定更个体化和精准的免疫治疗方案至关重要。

本研究通过TCGA数据库分析和体外细胞实验验证，揭示了NGFR基因表达水平对PD-1抑制剂活化的T淋巴细胞杀伤鳞癌和腺癌细胞的关键调控作用。NGFR基因在食管、肺和宫颈等多种癌症的鳞癌组织中表达水平显著高于腺癌组织。在腺癌细胞中过表达NGFR基因可显著增强PD-1抑制剂活化的T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤，而在鳞癌细胞中敲低NGFR基因则显著削弱了该效应。NGFR基因表达水平与PD-1抑制剂增强的T淋巴细胞免疫杀伤效果呈正相关关系。提示NGFR基因表达差异可能是一个重要的补充机制，对于理解临床观察到的鳞癌与腺癌对PD-1/PD-L1抑制剂存在应答差异提供了新的分子视角。NGFR基因在鳞癌中高表达与临床观察到的鳞癌对PD-1抑制剂有更高的敏感性相符^［5-9］。提示NGFR可能作为一种内在的免疫增敏因子，增强鳞癌细胞对免疫杀伤的易感性，腺癌对免疫治疗应答率相对较低，可能与其NGFR基因表达水平较低有关。

本研究筛选DEGs聚焦于与PI3K/AKT和JAK/STAT信号通路，PI3K/AKT信号通路是调控细胞存活和凋亡的核心信号轴，其异常激活是肿瘤细胞抵抗凋亡的重要机制；JAK/STAT信号通路则在免疫细胞的激活、分化和细胞因子信号传递中起枢纽作用^［16］。NGFR作为2个关键通路的关联分子，其高表达可能通过以下方式影响免疫杀伤：一方面，NGFR可能通过调节下游PI3K/AKT信号的活性，改变肿瘤细胞对T淋巴细胞介导的凋亡信号的阈值，使其更容易发生凋亡。另一方面，NGFR可能通过影响JAK/STAT相关免疫调节因子的表达，间接改变肿瘤细胞的免疫原性或对T淋巴细胞功能的调节能力^［28-30］。研究^［20-21］显示：NGFR可能通过调控肿瘤微环境中免疫细胞的相互作用来影响抗肿瘤免疫，与本研究结果一致。然而，NGFR具体是通过影响肿瘤细胞本身的凋亡通路，还是通过调节肿瘤与免疫细胞间的交互信号来发挥作用，仍需后续实验深入探究。

本研究也存在一定的局限性。首先，实验均在体外共培养体系中进行，尽管能模拟T淋巴细胞与肿瘤细胞的直接相互作用，但无法完全复制体内肿瘤微环境的复杂网络，包括其他免疫细胞、基质细胞和（或）细胞因子对微环境的影响。其次，NGFR调控T淋巴细胞杀伤功能的具体下游分子机制尚未完全阐明，未来需要利用转录组学和蛋白质组学等技术，并结合通路抑制剂进行验证，以明确其是否通过PI3K/AKT及JAK/STAT信号通路发挥核心作用。本研究结论主要基于食管、肺和宫颈来源的细胞系，在其他癌症中的普适性有待进一步验证。尽管存在上述局限，本研究结果仍具有明确的潜在临床意义。从临床转化的角度看，NGFR可能成为预测PD-1/PD-L1抑制剂疗效的潜在生物标志物，检测肿瘤组织中NGFR基因的表达，可能有助于更精准地筛选出能从免疫治疗中获益的患者。此外，针对低表达NGFR的肿瘤患者，探索上调NGFR基因表达或激活其下游信号以增敏免疫治疗的策略，可能为克服免疫治疗耐药提供新思路。

综上所述，本研究初步证实了NGFR是调控PD-1抑制剂免疫治疗效果的关键基因，其在鳞癌与腺癌中的不同表达水平可能是导致二者免疫治疗敏感性差异的原因之一，为深入理解肿瘤免疫应答的异质性提供了新证据，为开发基于NGFR的预测标志物和联合治疗策略提供参考。

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基金资助

吉林省财政厅卫生专项项目(2020SCZT074)