基于桃红四物汤治疗牙周炎作用机制的网络药理学分析及其体外实验验证

Network pharmacology analysis of mechanism of Taohong Siwu Decoction in treating periodontitis and its in vitro experimental validation

摘要

目的 采用网络药理学和分子对接技术，分析桃红四物汤（THSWD）活性成分-靶点-信号通路调控网络，并通过体外实验验证其在牙周炎治疗中的作用，阐明其作用靶点及相关调控机制。 方法 使用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）获取THSWD的活性成分及潜在靶点，通过人类在线孟德尔遗传数据库（OMIM）、人类基因数据库（GeneCards）和疗效药靶数据库（TTD）筛选牙周炎相关靶点，采用STRING平台将THSWD与牙周炎的交集靶点构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并筛选核心成分及靶点。通过Metascape数据库进行基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析，利用分子对接技术验证核心成分与靶点的结合能力。体外实验以牙龈卟啉单胞菌脂多糖（P.g-LPS）诱导RAW264.7细胞，建立牙周炎体外模型，通过细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测各组THSWD的细胞毒性，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组炎症因子mRNA表达水平，2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针法检测细胞中活性氧（ROS）水平，Western blotting 法检测各组细胞中信号通路相关蛋白表达水平。 结果 网络药理学共筛选出THSWD的45个潜在活性成分（槲皮素、山柰酚和木犀草素等），与牙周炎有81个交集基因，其中核心靶点包括前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、热休克蛋白90α家族A类成员1（HSP90AA1）、B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）、蛋白激酶B1（AKT1）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）和v-Rel网状内皮增生病毒癌基因同源物A（RELA）。KEGG信号通路富集分析，THSWD可能通过调控Janus激酶/信号转导及转录激活因子（JAK/STAT）等信号通路影响牙周炎的炎症及免疫过程。分子对接技术，THSWD核心成分与牙周炎关键靶点具有较强结合能力。体外实验选择0.2、0.4、0.8和1.6 g·L^-1 THSWD为给药浓度，药物的半数抑制浓度（IC₅₀）为41.72 g·L^-1。RT-qPCR法，与对照组比较，脂多糖（LPS）组细胞中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素10（IL-10） mRNA表达水平明显升高（P<0.01）；与LPS组比较，0.2、0.4、0.8和1.6 g·L^-1 THSWD组细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平明显降低（P<0.01），IL-10 mRNA表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）。DCFH-DA探针法，与对照组比较，LPS组细胞中ROS水平明显升高（P<0.01）；与LPS组比较，0.2、0.4和0.8 g·L^-1 THSWD组细胞中ROS水平明显降低（P<0.01）。Western blotting法，与对照组比较，LPS组细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和磷酸化Janus激酶1（p-JAK1）蛋白表达水平明显升高（P<0.01）；与LPS组比较，0.2、0.4和0.8 g·L^-1 THSWD组和芦可替尼组细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和p-JAK1蛋白表达水平均明显降低（P<0.05或P<0.01）。 结论 THSWD能够通过多成分、多靶点和多通路的方式治疗牙周炎，体外实验证实THSWD能够抑制JAK/STAT信号通路的激活，并且具有体外抗炎和抗氧化作用。

Abstract

Objective To analyze the active ingredient-target-signaling pathway regulatory network of Taohong Siwu Decoction （THSWD） by network pharmacology and molecular docking technology， and to verify its role in the treatment of periodontitis through in vitro experiments， and to clarify its action targets and related regulatory mechanisms. Methods The Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP） was used to obtain the active ingredients and potential targets of THSWD； the Online Mendelian Inheritance in Man （OMIM）， Human Gene Database （GeneCards）， and Therapeutic Target Database （TTD） were used to screen the periodontitis-related targets； the STRING platform was used to construct a protein-protein interaction （PPI） network of the intersecting targets of THSWD and periodontitis， and to screen the core components and targets； the Metascape database was used for Gene Ontology （GO） functional enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） signaling pathway enrichment analysis； molecular docking technology was used to verify the binding ability of the core components to the targets. In the in vitro experiments， the RAW264.7 cells were induced by Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide （P.g-LPS） to establish the in vitro model of periodontitis； cell counting kit-8 （CCK-8） method was used to detect the cytotoxicities of THSWD in various groups； real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） was used to detect the mRNA expression levels of inflammatory factors in various groups； 2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate （DCFH-DA） probe method was used to detect the levels of reactive oxygen species （ROS） in the cells； Western blotting method was used to detect the expression levels of pathway-related proteins in various groups. Results Network pharmacology screening identified 45 potential active ingredients （quercetin， kaempferol， luteolin， etc.） of THSWD， and 81 intersecting genes with periodontitis， among which the core targets included prostaglandin-endoperoxide synthase 2 （PTGS2）， heat shock protein 90 alpha family class A member 1 （HSP90AA1）， B-cell lymphoma 2 （Bcl-2）， protein kinase B1 （AKT1）， mitogen-activated protein kinase 1 （MAPK1）， and v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A （RELA）. The KEGG signaling pathway enrichment analysis results showed that THSWD might affect the inflammatory and immune processes of periodontitis by regulating signaling pathways such as the Janus kinase/signal transducer and activator of transcription （JAK/STAT） signaling pathway. The molecular docking technology results showed that the core components of THSWD had strong binding ability to the key targets of periodontitis. In the in vitro experiments， 0.2， 0.4， 0.8， and 1.6 g·L^-1 THSWD were selected as the administration concentrations， and the half-maximal inhibitory concentration （IC₅₀） of the drug was 41.72 g·L^-1. The RT-qPCR results showed that compared with control group， the expression levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6）， and interleukin-10 （IL-10） mRNA in the cells in lipopolysaccharide （LPS） group were significantly increased （P<0.01）； compared with LPS group， the expression levels of TNF-α， IL-1β， and IL-6 mRNA in the cells in 0.2， 0.4， 0.8， and 1.6 g·L^-1 THSWD groups were significantly decreased （P<0.01）， and the expression level of IL-10 mRNA was significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. The DCFH-DA probe method results showed that compared with control group， the ROS level in the cells in LPS group was significantly increased （P<0.01）； compared with LPS group， the ROS levels in the cells in 0.2， 0.4， and 0.8 g·L^-1 THSWD groups were significantly decreased （P<0.01）. The Western blotting method results showed that compared with control group， the expression levels of TNF-α， IL-1β， IL-6， and phosphorylated Janus kinase 1 （p-JAK1） proteins in the cells in LPS group were significantly increased （P<0.01）； compared with LPS group， the expression levels of TNF-α， IL-1β， IL-6， and p-JAK1 proteins in the cells in 0.2， 0.4， and 0.8 g·L^-1 THSWD group and ruxolitinib group were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion THSWD can treat periodontitis through multi-component， multi-target， and multi-pathway approaches.The in vitro experiments confirm that THSWD can inhibit the activation of JAK/STAT signaling pathway and has anti-inflammatory and antioxidant effects in vitro.

Graphical abstract

关键词

牙周炎 / 桃红四物汤 / 网络药理学 / 分子对接技术 / 抗炎机制

Key words

Periodontitis / Taohong Siwu Decoction / Network pharmacology / Molecular docking technology / Anti-inflammatory mechanism

牙周炎是一种慢性炎症性疾病，不仅会造成牙周附着丧失，还能通过循环炎性介质和全身低度炎症形成双向反馈，影响全身健康^［1］。菌斑微生物是牙周炎的首要病因，宿主免疫反应也对其产生重要影响^［2］。以机械方法去除菌斑是临床上针对牙周炎的主要治疗手段，但由于牙周病变存在一些器械不易触及的感染部位、需要调节宿主免疫功能等，因此，药物治疗成为一种重要的辅助治疗手段^［3］。然而目前临床上常用的抗生素、非甾体抗炎药和免疫调节剂等药物存在耐药性、胃肠道反应及肝肾毒性等不良反应^［4］，亟需寻找安全有效的牙周炎治疗药物。在此背景下，中药因其具有独特优势受到关注^［5］，在牙周疾病治疗中也获得了较多的研究成果^［6-8］，其有望成为一种具有重要应用前景的治疗手段。桃红四物汤（Taohong Siwu Decoction，THSWD）最早记载于《医宗金鉴》，由当归、熟地黄、川芎、白芍、桃仁和红花组成^［9］，其在骨科疾病和心血管疾病中展现出显著的辅助治疗和防治作用^［10-11］。现代研究^［10］显示：THSWD因其具有抗炎、抗氧化和免疫调节作用及辨证施治体现出的个体化治疗特点，在炎症相关疾病的治疗中展现出良好应用潜力，为牙周炎的治疗提供了新的可能。

目前中药研究仍存在如药物有效成分的作用机制尚未完全阐明、临床证据的规模不足和质量不高等局限性^［12-13］。此外，复方药物成分复杂、机制多元，传统研究方法难以全面揭示其靶点和作用机制^［14］。网络药理学可以系统地展现中药成分靶点间的相互联系，有效推动了中药复方的深入研究^［15］；分子对接技术能够将已知的小分子活性成分与相关靶蛋白进行对接，在分子水平阐明机制^［16］。小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7经牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Porphyromonasgingivalis lipopolysaccharide，P.g-LPS）诱导可建立稳定的体外牙周炎炎症模型，现已广泛应用于炎症机制、巨噬细胞极化及抗炎干预方面的研究^［17］。因此，本研究采用网络药理学方法和分子对接技术系统性地分析THSWD在治疗牙周炎时发挥作用的主要药物成分和涉及的靶点及信号通路，利用RAW264.7细胞进行体外实验，阐明THSWD具有治疗牙周炎的作用，并通过Western blotting法对关键通路进行验证，为THSWD治疗牙周炎的临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1　THSWD主要活性成分和作用靶点获取

在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis，TCMSP）（https：//tcmsp.91medicine.cn/）中以“桃仁”“红花”“熟地黄”“白芍”“当归”“川芎”为关键词逐一检索，根据药代动力学原理， 以药物口服生物利用度 （oral bioavailability， OB）≥30%且药物相似度（drug-likeness， DL）≥0.18筛选， 得到THSWD的主要活性成分及对应靶点。利用通用蛋白数据库（Universal Protein Resource，UniProt）（https：//www.uniprot.org/）标 准 化 靶 点， 经 Cytoscape 3.10.2软件， 构建“药物-成分-靶点”网络框架。

1.2　牙周炎靶点筛选和获取

分别在人类基因数据库（GeneCards）（https：//www.genecards.org/）、人类在线孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）数据库（https：//www.omim.org）和疗效药靶数据库（Therapeutic Target Database，TTD）（https：//db.idrblab.net/ttd/）中以“periodontitis”为关键词进行检索，并将结果以中位数进行筛选、取并集并删重，得到牙周炎相关基因靶点。

1.3　交集靶点的获取及蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建

采用Venny 2.1平台（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）对THSWD的基因靶点与牙周炎基因靶点取交集，并绘制韦恩图。在STRING平台（https：//cn.string-db.org/）输入交集基因，构建PPI网络，并通过Cytoscape 3.10.2软件进行处理。

1.4　基因本体论（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyotoencyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析

借助Metascape数据库（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1），进行GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析，应用微生信网（http：//www.bioinformatics.com.cn/）将分析结果构建可视化图。

1.5　药物-疾病网络框架的构建

对药物成分、交集基因及信号通路进行处理和编码，利用Cytoscape 3.10.2软件构建药物-疾病网络框架。

1.6　THSWD核心成分及牙周炎核心靶点的筛选

由Cytoscape 3.10.2软件输出药物-化合物-靶点网络框架中的数据，将药物成分按照degree值降序排列，将排名前9位的成分作为THSWD的核心成分。将药物-疾病网络框架中的基因靶点按照degree值降序排列，将排名前6位基因作为核心靶点。

1.7　分子对接分析

在蛋白质数据库（Protein Data Bank，PDB）（https：//www.rcsb.org/） 下载靶蛋白的pdb格式文件，经PyMol 3.0.3软件和Auto Dock Tools 1.5.6工具进行处理及格式转化。在Pub Chem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载THSWD核心成分的sdf格式文件，利用Chem 3D软件和Auto Dock Tools 1.5.6工具完成格式转化，随后将处理好的配体与受体进行分子对接，再用PyMol 3.0.3软件将对接结果可视化。

1.8　细胞、主要试剂和仪器

RAW264.7细胞购自中国科学院细胞库。DMEM高糖培养基购自北京亿奥邦公司，胎牛血清购自武汉普诺赛公司，细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8，CCK-8）购自苏州新赛美公司，P.g-LPS购自美国InvivoGen公司，RNA抽提试剂、逆转录试剂盒、PCR扩增预混液、增强型化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒和TBST溶液购自上海翌圣公司，2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2'，7'- dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）购自北京索莱宝公司，Hoechst 33342试剂、细胞裂解液和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天公司，芦可替尼（Ruxolitinib）购自美国MCE公司，兔抗小鼠一抗和β-肌动蛋白（β-actin）购自武汉赛维尔公司，Janus激酶1（Janus kinase 1， JAK1）和磷酸化JAK1（phosphorylated JAK1，p-JAK1）购自杭州荟丹生物科技有限公司，肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）购自武汉三鹰公司，白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）购自英国abcam公司和白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）购自沈阳万类公司，山羊抗兔二抗免疫球蛋白G购自湖北普美公司。酶标仪购自美国BioTek公司，PCR仪和蛋白电泳设备购自美国Bio-Rad公司，荧光显微镜购自日本OLYMPUS公司。

1.9　RAW264.7细胞培养、药物制备和细胞分组

本研究以RAW264.7细胞为研究对象，该细胞系为牙周炎体外机制研究和药物筛选的经典模型^［18］。采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基在37 ℃、5% CO₂条件下进行培养。THSWD参考文献［19-21］方法制备：取熟地黄、桃仁、红花、白芍、川芎和当归（质量比为1.5∶2.0∶1.5∶1.0∶1.0∶1.5）^［9］，加纯净水煮沸2 h后过滤，浓缩至含生药浓度为225 g·L^-1，0.22 μm孔径无菌滤膜过滤后备用。针对不同检测分别进行细胞接种，细胞贴壁24 h后分组处理并完成相应检测。实验设置空白对照组（加入不含药物的培养基）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）组（加入等量不含药物的培养基）、THSWD组（加入含有不同浓度的THSWD的培养基）和Ruxolitinib组（加入含1 μmol·L^-1 Ruxolitinib的培养基）。各组预处理18 h后，除空白对照组外，其余各组均加入0.1 mg·L^-1P.g-LPS继续刺激6 h，建立牙周炎模型^［22-23］。

1.10　CCK-8法检测各组细胞存活率

取处于对数生长期的RAW264.7细胞，以每孔3×10³个细胞的密度接种于96孔细胞培养板，培养24 h细胞贴壁后，分为空白对照组和THSWD组。空白对照组不作处理，THSWD组分别加入0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6和51.2 g·L^-1 THSWD作用24 h，加入CCK-8液后避光孵育，采用酶标仪测定450 nm波长处吸光度（A）值，并计算半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC₅₀）和细胞存活率。细胞存活率=（实验孔A值-空白孔A值）/（对照孔A值-空白孔A值）×100%。

1.11　实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法检测各组细胞中炎症因子mRNA表达水平

将RAW264.7细胞以每孔3×10⁵个细胞的密度接种于6孔细胞培养板，培养24 h后，分为对照组、LPS组和THSWD组，THSWD组分别加入0.2、0.4、0.8和1.6 g·L^-1 THSWD，P.g-LPS刺激细胞6 h后进行RT-qPCR实验，提取细胞总RNA，检测浓度及纯度，将RNA逆转录为cDNA，选择β-actin作为内参，进行定量PCR分析，使用2^-△△Ct法测定各组细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和白细胞介素10（interleukin-10，IL-10）mRNA表达水平。见表1。

1.12　DCFH-DA探针法检测各组细胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平

将RAW264.7细胞以每孔5×10⁴个细胞的密度接种于12孔细胞培养板，分为对照组、LPS组、THSWD组和Ruxolitinib组，对照组不进行处理，LPS组加入0.1 mg·L^-1P.g-LPS，THSWD组分别加入0.2、0.4和0.8 g·L^-1 THSWD，经预处理及P.g-LPS刺激后，使用DCFH-DA探针法检测ROS水平，每孔加入终浓度为6.67 μmol·L^-1的探针，孵箱内孵育30 min后，加入终浓度为2 mg·L^-1的Hoechst 33342试剂染核。再次孵育10 min后，无血清培养基冲洗3次， 荧光显微镜拍摄ROS染色和Hoechst 33342染色结果，采用Image J软件分析荧光强度，以DCFH-DA荧光强度/Hoechst 33342荧光强度的比值代表ROS水平。

1.13　Western blotting法检测各组细胞中炎症因子和通路相关蛋白表达水平

将RAW264.7细胞以每孔2×10⁵个细胞的密度接种于6孔细胞培养板，分为对照组、LPS组、THSWD组和Ruxolitinib组，THSWD 组 分 别 加 入 0.2、 0.4和0.8 g·L^-1 THSWD，Ruxolitinib与THSWD同一时间加入，P.g-LPS刺激细胞6 h后换液，再次培养细胞24 h后提取蛋白，经BCA法测定蛋白浓度后，进行电泳、转膜和封闭等操作。按照说明书以1∶1 000的比例稀释一抗，分别使用β-actin、JAK1、p-JAK1、TNF-α、IL-1β和IL-6一抗4℃孵育过夜。次日TBST溶液洗涤一抗3次，以1∶5 000稀释二抗后，室温摇床孵育1 h，再次洗涤3次后通过发光成像仪显影，采用Image J软件进行灰度值分析。炎症因子的蛋白表达水平以炎症因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值表示，JAK1通路的激活水平以磷酸化蛋白（p-JAK1）与总蛋白（JAK1）条带灰度值的比值表示。

1.14　统计学分析

采用GraphPad Prism 10.1.2软件进行统计学分析和数据可视化。各组RAW264.7细胞炎症因子mRNA和蛋白表达水平、p-JAK1/JAK1比值及ROS水平数据呈正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。所有数据均以相对于对照组的相对倍数（fold change，FC）表示，所有实验独立重复3次。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　数据库检索和THSWD主要活性成分及作用靶点的获取

在TCMSP数据库检索并筛选得到共45个THSWD活性成分。对有效成分信息进行编码：A1代表白芍、当归、红花和桃仁的共有成分，B1代表白芍、川芎和熟地黄的共有成分，C1代表白芍和红花的共有成分，D1代表当归、红花和熟地黄的共有成分。BS、CX、HH和TR分别为白芍、川芎、红花和桃仁的缩写。见表2。

经过UniProt数据库转化得到的标准基因靶点筛

重后得到潜在靶点216个，在Cytoscape 3.10.2软件中构建药物-成分-靶点网络框架。周围节点代表药物成分，中间部分的橙色椭圆形节点代表药物作用的基因靶点，边代表节点之间的作用关系。该网络共涉及THSWD中当归、川芎、白芍、熟地黄、桃仁和红花等6味中药的45个活性成分，对应216个药物作用靶点。网络分析结果显示：THSWD的活性成分与靶点之间存在复杂的相互作用关系，体现了中药“多成分、多靶点”协同作用的特征。见图1。

2.2　数据库检索、牙周炎靶点筛选和获取

以“periodontitis”作为关键词，在GeneCards数据库中检索到按照Relevance score的中位数进行筛选得到811个基因，在OMIM和TTD数据库中分别检索到8个和1个牙周炎基因，将3个数据库中检索结果取并集并删除重复项，共得到817个牙周炎相关基因。

2.3　交集靶点的获取及PPI网络的构建

对THSWD基因靶点和牙周炎的交集基因，817个牙周炎相关基因与216个THSWD的交集基因为81个。见图2。

将交集基因输入STRING平台，设置信度阈值为0.900，并经Cytoscape 3.10.2软件进行处理，构建PPI网络。节点表示蛋白质靶点，degree值越大颜色越深、形状越大。每条边则表示PPI关系。图中共有74个节点和270条边。该网络共包含74个节点和270条边，表明上述靶点之间存在较为复杂的PPI关系，THWSD可能通过多个靶点的协同调控来干预牙周炎。见图3。

2.4　GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析

GO功能富集分析结果可视化P<0.05的前10个条目，结果显示：THSWD可能显著影响与炎症反应和免疫调节相关的生物过程（biological process，BP），如对LPS响应、对炎症反应和细胞凋亡等的调控。且THSWD可能作用于多种细胞组分（cellular component，CC），包括脂筏、囊泡腔和转录调节复合体等。另外，THSWD可能影响信号传导和酶活性调节及细胞因子活性等分子功能（molecular function，MF）。见图4。

KEGG结果选取P<0.05的前20个条目进行可视化。THSWD可能通过调控Janus激酶-信号转导及转录激活因子（Janus kinase- signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT）信号通路、白细胞介素17（interleukin-1，IL-17）信号通路和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等信号通路对牙周炎产生作用。见图5。

2.5　药物-疾病网络框架的构建

利用Cytoscape 3.10.2软件，构建药物-疾病网络框架，结果显示：THSWD可能通过多成分、多靶点和多途径的方式对牙周炎发挥作用。粉色节点代表基因通路（序号同图5），绿色节点代表THSWD的活性成分，橙色节点代表药物与疾病的交集基因，连线代表节点之间相互作用。该网络共包含148个节点和746条边，由45个活性成分、81个共同靶点和20条富集通路构成，直观展示了THSWD治疗牙周炎的多层次调控网络。见图6。

2.6　THSWD核心成分及牙周炎核心靶点的筛选

将药物-成分-靶点网络框架中的药物成分按照degree值降序排列，得到前9位成分，即槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、黄芩素、菜油甾醇、杨梅酮、常春藤素和β-胡萝卜素作为THSWD的核心成分。将药物-疾病网络框架中的基因靶点按照degree值降序排列，将排名前6位的基因，即前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、热休克蛋白90α家族A类成员1（heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90AA1）、B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma 2，BCL2）、蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）和v-Rel网状内皮增生病毒癌基因同源物A（v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A，RELA）作为核心靶点。核心成分与核心靶点的作用关系见图7。中间的橙色节点代表核心靶点，周围绿色节点代表核心成分。

2.7　分子对接技术分析

在分子对接中，结合能的数值越小，表示THSWD核心成分与靶点之间的相互作用越强，结合能<-5.0 kcal·mol^-1表示有一定的结合活性，而<-7.0 kcal·mol^-1则表示较强的结合活性。根据分子对接结果，THSWD核心成分与牙周炎相关靶点蛋白的结合能大部分均<-5.0 kcal·mol^-1，表明上述成分与靶点之间均存在一定的结合活性。其中转化为热图，红色越深代表结合能越强（数值越小），结合越稳定。见图8。木犀草素与PTGS2和黄芩素与RELA的结合能最低，分别为-9.4 kcal·mol^-1和-9.3 kcal·mol^-1。采用PyMol 3.0.3软件将分子对接模式进行可视化处理。见图9。

2.8　各组细胞存活率

与对照组比较，0.2~25.6 g·L^-1 THSWD组细胞存活率比较差异无统计学意义（P>0.05），即无细胞毒性。根据此结果选择0.2、0.4、0.8和1.6 g·L^-1 THSWD为体外实验给药浓度。药物的IC₅₀为41.72 g·L^-1。见图10。

2.9　各组细胞炎症因子mRNA表达水平

当细胞只经过P.g-LPS刺激后，与对照组比较，LPS组细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10 mRNA表达水平明显升高（P<0.01）；与LPS组比较，0.2、0.4、0.8和1.6 g·L^-1 THSWD组细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平明显降低（P<0.01），IL-10 mRNA表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）。见图11。

2.10　各组细胞中ROS水平

经P.g-LPS刺激后，与对照组比较，LPS组细胞中ROS水平明显升高（P<0.01）；与LPS组比较，0.2、0.4和0.8 g·L^-1 THSWD组细胞中ROS水平明显降低（P<0.01）。见图12和13。

2.11　各组细胞中炎症因子和通路相关蛋白表达水平

与对照组比较，LPS组细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和p-JAK1蛋白表达水平明显升高（P<0.01）；与LPS组比较，0.2、 0.4和0.8 g·L^-1 THSWD组和 Ruxolitinib 组 细 胞 中 TNF-α、 IL-1β、 IL-6和p-JAK1蛋白表达水平均明显降低（P<0.05或P<0.01）。见图14。

3 讨 论

牙周炎是成年人失牙的最主要原因^［24-25］，其导致的慢性炎症和细菌感染还可能通过血液循环和免疫反应等途径影响全身健康^［26］。因此，有效控制牙周炎症对于维护口腔乃至全身健康至关重要。目前，临床治疗牙周炎以机械方法去除菌斑（龈上洁治和龈下刮治）为核心，对于深牙周袋及顽固性炎症，可以辅助药物治疗以增强疗效^［27］。目前临床常用的牙周炎治疗药物，存在耐药性和不良反应等问题^［4］。中药来源于天然产物，具有代谢调节、免疫平衡和整体调理等优势，能够通过多靶点、多通路调节免疫炎症反应^［28］。THSWD作为一种经典中药方剂，具有抗菌、抗炎、抗氧化和免疫调节等作用^［29］，具备成为牙周炎治疗药物的潜力。本研究利用网络药理学方法和分子对接技术整合多个数据库资源，系统性地分析THSWD对牙周炎的潜在通路和靶点，并结合体外实验，为后续的研究提供科学依据。

本研究网络药理学分析结果显示：THSWD含有45种活性成分，包括黄酮类、萜类和甾体类等多样化的化合物，其中多种成分具有抗炎或抗氧化作用，如槲皮素能够预防氧化应激诱导的牙周韧带细胞损伤和小鼠牙槽骨丢失^［30］。山柰酚具有抗炎、抗癌、抗氧化、抗菌和抗病毒的作用，能够促进牙周膜干细胞的活性及其成骨分化^［31］。木犀草素可抑制实验性小鼠牙周炎中牙龈卟啉单胞菌的生长并减轻牙槽骨破坏^［32］。本研究筛选的核心靶点在牙周炎进展中发挥关键调控作用，共同介导炎症反应和氧化应激平衡。其中，PTGS2催化前列腺素等促炎介质合成，是牙周炎炎症级联反应的重要推动因子^［33］；RELA核转位可启动TNF-α和IL-6等多种促炎因子表达，是炎症信号放大的关键开关^［34-35］。在炎症环境下，MAPK1和AKT1作为信号枢纽被激活， 上调促炎因子， 加剧牙周组织炎症反应^［36-37］。Bcl-2表达下调与牙周炎组织破坏加重有关^［38］，HSP90AA1促进牙周炎症反应，其抑制可减轻炎症损伤^［39］。

KEGG信号通路富集分析结果显示THSWD能够通过JAK-STAT信号通路对牙周炎产生影响。JAK-STAT信号通路在炎症反应中广泛参与细胞因子的信号转导，尤其是促炎因子（TNF-α和IL-6）的释放^［40］，是牙周炎骨破坏的核心调控通路，其抑制剂在动物实验研究和部分临床试验研究中显示出抗炎和骨保护作用^［41］。JAK1是JAK-STAT通路的核心成员，其磷酸化会触发下游STAT蛋白的激活，进而调控炎症相关基因的转录^［42-43］。分子对接技术分析结果显示：THSWD核心成分与牙周炎靶点蛋白的结合能普遍<-5.0 kcal·mol^-1，表明均有一定结合活性。其中，槲皮素、木犀草素和黄芩素对核心靶点的结合能均<-7.0 kcal·mol^-1，显示出强相互作用。因此，THSWD的核心成分可能通过与上述靶点发挥对牙周炎的治疗作用。

有许多研究^［19-21］使用中药复方水提物直接应用于细胞实验，因此本研究按照文献中的配比制作THSWD水煎液，无菌处理后用于后续实验。巨噬细胞RAW264.7在体外可表现出与体内类似的炎症反应和抗炎功能^［44］，作为牙周炎微环境中的关键免疫细胞，巨噬细胞通过M1/M2极化平衡调控牙周组织的炎症损伤与修复进程，其M1型极化可产生大量的促炎因子，M2型极化可产生抗炎因子^［45-46］。同时，过量的ROS会破坏牙周组织，可使RAW264.7细胞向M1型极化，增强炎症，而降低氧化应激可以减少细胞的氧化损伤反应^［47-48］。本研究利用P.g-LPS诱导的RAW264.7细胞模拟炎症环境，结果显示：THSWD在表现出良好生物相容性的同时，能够显著降低促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA及蛋白表达，提高抗炎因子IL-10 mRNA表达，并且能够减少细胞内ROS的产生，具有显著的抗炎和抗氧化作用。

为验证THSWD是否对JAK/STAT信号通路产生影响，本研究进行了Western blotting实验，结果显示：THSWD能够下调p-JAK1蛋白表达，并且与经典JAK1/2抑制剂Ruxolitinib^［43］比较，THSWD表现出相似的抗炎效果。其对p-JAK1的抑制可能是其下调炎症因子的直接机制，但其为复方药物不同于现有JAK抑制剂，提示其可能具有独特的作用机制。

综上所述，THSWD具有良好的生物相容性和体外抗炎和抗氧化作用，其作用机制涉及抗炎、免疫调节、细胞死亡调控和信号通路干预及抗氧化等多途径。JAK/STAT信号通路可能是THSWD抗炎作用的关键靶点。本研究为THSWD在牙周炎治疗领域的研究和应用提供了科学依据，未来的研究将在细胞和动物层面对药物的作用及其机制进行进一步的探索。

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基金资助

吉林省教育厅科学研究重点项目(JJKH20250205KJ)