人参健智片对认知障碍模型大鼠学习记忆能力的改善作用和海马神经元的保护作用及其机制

Improvement effect of Renshen Jianzhi Tablets on learning and memory ability in cognitive impairment model rats and its protective effect on hippocampal neurons and its mechanism

摘要

目的 探讨人参健智片对认知障碍模型大鼠认知功能的改善作用和海马神经元的保护作用，阐明其潜在的作用机制。 方法 42只SD大鼠随机分为对照组、模型组、盐酸多奈哌齐组（0.45 mg·kg^-1盐酸多奈哌齐）、开心散组（1.35 g·kg^-1开心散）、低和高剂量人参健智片组（2.17和10.85 g·kg^-1人参健智片），每组7只。除对照组外，其余各组大鼠每日皮下注射500 mg·kg^-1 D-半乳糖建立认知障碍模型，将连续10周。采用Morris水迷宫实验评估各组大鼠学习记忆能力，HE染色观察各组大鼠海马组织病理形态表现。在体外实验中，将人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞分为对照组、过氧化氢（H₂O₂）组、脂多糖（LPS）组、62.500 0、125.000 0和250.000 0 mg·L^-1人参健智片组。利用H₂O₂和LPS分别处理SH-SY5Y细胞构建氧化应激和炎症模型。采用噻唑蓝（MTT）法检测各组细胞存活率，2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光法检测各组细胞内活性氧（ROS）水平，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测细胞上清液中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）水平及超氧化物歧化酶（SOD）活性。利用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）技术，结合化学结构特征、二级质谱碎片离子信息及文献比对，鉴定人参健智片中的化合物成分。 结果 Morris水迷宫实验，与对照组比较，模型组大鼠平台穿越次数明显减少（P<0.01），有效区域滞留时间明显缩短（P<0.01）；与模型组比较，盐酸多奈哌齐组大鼠平台穿越次数明显增加（P<0.01），低剂量人参健智片组大鼠平台穿越次数明显增加（P<0.01），有效区域滞留时间明显延长（P<0.01）。HE染色，与对照组比较，模型组大鼠海马神经元数量减少，排列紊乱，细胞间隙增大；与模型组比较，盐酸多奈哌齐组、开心散组、低和高剂量人参健智片组大鼠海马神经元数量增加，形态相对规整，排列较整齐。MTT法，与对照组比较，0.625 mmol·L^-1 H₂O₂组和500 mg·L^-1 LPS组细胞存活率明显降低（P<0.01），最接近50%；与对照组比较，500.000 0 mg·L^-1人参健智片组细胞存活率明显降低（P<0.01）。ROS荧光探针法，与对照组比较，H₂O₂组细胞中ROS水平明显升高（P<0.01）；与H₂O₂组比较，62.500 0、125.000 0和250.000 0 mg·L^-1人参健智片组细胞中ROS水平均明显降低（P<0.01），125.000 0 mg·L^-1人参健智片组效果最明显。ELISA法，与对照组比较，H₂O₂组细胞上清液中MDA水平明显升高（P<0.01），GSH水平和SOD活性明显降低（P<0.01）；与H₂O₂组比较，62.500 0、125.000 0和250.000 0 mg·L^-1人参健智片组细胞上清液中MDA水平明显降低（P<0.05或P<0.01），GSH水平和SOD活性明显升高（P<0.05或P<0.01）。与对照组比较，LPS组细胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β水平明显升高（P<0.01），与LPS组比较，62.500 0、125.000 0和250.000 0 mg·L^-1人参健智片组细胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β水平明显降低（P<0.01）。UHPLC-MS/MS技术分析在人参健智片中共鉴定出73种化合物成分。 结论 人参健智片能有效改善认知障碍模型大鼠的学习记忆能力，保护海马神经元结构完整性；其作用机制可能与抑制神经细胞氧化应激损伤和减轻炎症反应有关。

Abstract

Objective To discuss the improvement effect of Renshen Jianzhi Tablets on cognitive function and protective effect of Penshen Jiouzhi Tablets on hippocampal neurons in cognitive impairment model rats， and to clarify its potential mechanism. Methods Forty-two SD rats were randomly divided into control group， model group， donepezil hydrochloride group （0.45 mg·kg^-1 donepezil hydrochloride）， Kaixin San group （1.35 g·kg^-1 Kaixin San）， low and high dose of Renshen Jianzhi Tablets groups （2.17 and 10.85 g·kg^-1 Renshen Jianzhi Tablets）， with 7 rats in each group. Except for control group， the rats in the other groups were subcutaneously injected with 500 mg·kg^-1 D-galactose daily to establish cognitive impairment model for 10 consecutive weeks. Morris water maze test was used to evaluate the learning and memory abilities of the rats in various groups； HE staining was used to observe the pathol morphology of hippocampus tissue of the rats in various groups. In in vitro experiments， human neuroblastoma SH-SY5Y cells were divided into control group， hydrogen peroxide （H₂O₂） group， lipopolysaccharide （LPS） group， 62.500 0， 125.000 0 and 250.000 0 mg·L^-1 Renshen Jianzhi Tablets groups. H₂O₂ and LPS were used to treat the SH-SY5Y cells to establish oxidative stress and inflammatory models， respectively. Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide （MTT） method was used to detect the survival rate of the cells in various groups； 2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate （DCFH-DA） fluorescence method was used to detect the level of reactive oxygen species （ROS） in the cells in various groups； enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） method was used to detect the levels of malondialdehyde （MDA）， glutathione （GSH）， tumor necrosis factor α （TNF-α）， interleukin-6 （IL-6）， interleukin-1β （IL-1β） and the activity of superoxide dismutase （SOD） in the cell supernatant in various groups. Ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UHPLC-MS/MS） technology combined with chemical structure characteristics， secondary mass spectrometry fragment ion information and literature comparison was used to identify the compound components in Renshen Jianzhi Tablets. Results The Morris water maze test results showed that compared with control group， the number of platform crossings of the rats in model group was significantly decreased （P<0.01）， and the retention time in the target quadrant was significantly shortened （P<0.01）； compared with model group， the number of platform corssings of rats in Donepezil HCl group was significantly increased（P<0.01）， the number of platform crossings of the rats in low dose of Renshen Jianzhi Tablets groups was significantly increased （P<0.01）， and the retention time in the target quadrant was significantly prolonged （P<0.01）. The HE staining results showed that compared with control group， the number of hippocampal neurons of the rats in model group was decreased， the arrangement was disordered， and the intercellular space was enlarged； compared with model group， the number of hippocampal neurons of the rats in donepezil hydrochloride group， Kaixinsan group， low and high doses of Renshen Jianzhi Tablets groups was increased， the morphology was relatively regular， and the arrangement was relatively neat. The MTT assay results showed that compared with control group （P<0.01）， the survival rates of the cells in 0.625 mmol·L^-1 H₂O₂ group and 500 mg·L^-1 LPS were decreased and closest to 50%； compared with control group， reached， the cell survival rate of the cells in 500 mg·L^-1 Renshen Jianzhi Tablets group was significantly decreased （P<0.01）. The ROS fluorescence probe assay results showed that compared with control group， the ROS level in the cells in H₂O₂ group was significantly increased （P<0.01）； compared with H₂O₂ group， the ROS levels in the cells in 62.500 0， 125.000 0 and 250.000 0 mg·L^-1 Renshen Jianzhi Tablets groups were significantly decreased （P<0.01）， and the effect was most obvious in 125.000 0 mg·L^-1 Renshen Jianzhi Tablets group. The ELISA results showed that compared with control group， the MDA level in the cell supernatant in H₂O₂ group was significantly increased （P<0.01）， while the GSH level and SOD activity were significantly decreased （P<0.01）； compared with H₂O₂ group， the MDA levels in the cell supernatant in 62.500 0， 125.000 0 and 250.000 0 mg·L^-1 Renshen Jianzhi Tablets groups were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）， and the GSH levels and SOD activities were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. Compared with control group， the levels of TNF-α， IL-6 and IL-1β in the cell supernatant in LPS group were significantly increased （P<0.01）； compared with LPS group， the levels of TNF-α， IL-6 and IL-1β in the cell supernatant in 62.500 0， 125.000 0 and 250.000 0 mg·L^-1 Renshen Jianzhi Tablets groups were significantly decreased （P<0.01）. The UHPLC-MS/MS analysis results showed that a total of 73 compounds were identified in Renshen Jianzhi Tablets. Conclusion Renshen Jianzhi Tablets can effectively improve the learning and memory abilities of cognitive impairment model rats and protect the structural integrity of hippocampal neurons. Its mechanism may be related to inhibiting oxidative stress damage of nerve cells and reducing inflammatory response.

Graphical abstract

关键词

人参健智片 / 认知障碍 / D-半乳糖 / SH-SY5Y细胞 / 氧化应激 / 炎症

Key words

Renshen Jianzhi tablets / Cognitive impairment / D-galactose / SH-SY5Y cells / Oxidative stress / Inflammation

随着全球人口老龄化进程加速，年龄相关性认知衰退和神经退行性疾病已成为重大公共卫生挑战^［1-2］，其 中 轻 度 认 知 障 碍（mild cognitive impairment，MCI）作为认知衰退的关键阶段^［3］，我国55岁以上人群MCI患病率达12.2%，65岁以上人群其患病率升至20.8%，亟需高效干预手段^［4］。目前，神经退行性疾病治疗领域存在显著局限，主流药物虽能减少脑淀粉样斑块，延缓早期疾病进展，但存在脑水肿风险，且仅适用于轻度阶段，无法逆转神经退行进程；有研究^［5］聚焦β淀粉样蛋白（β-amyloid peptide，Aβ）/Tau蛋白病理机制，但难以解释约30%患者仍出现认知衰退的现象，提示单一靶点干预存在局限性。近年来研究^［6-7］证实：衰老大脑微环境中活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高和抗氧化防御功能减弱，与小胶质细胞持续活化释放促炎细胞因子形成恶性循环，这一“氧化应激-炎症”协同损伤机制为认知障碍干预提供了新的靶点方向，但针对该机制的有效干预药物仍较为缺乏。

中药复方凭借多“成分-多靶点”的协同效应，在认知障碍治疗领域展现出独特优势。开心散源自唐代《备急千金要方》的经典古方，其由人参、远志、茯苓和石菖蒲组成，具有益智开窍及安神定志的功效，在认知功能障碍治疗中积累了丰富的临床经验^［8-9］。基于此古方改良而成的人参健智片，通过现代制药工艺和质控标准提升了药效物质稳定性及生物利用度，为认知障碍治疗提供了新型中药复方制剂选择，但目前关于人参健智片改善认知障碍的具体作用机制，尤其是否靶向“氧化应激-炎症”协同损伤通路以及其发挥神经保护作用的物质基础国内外尚未见相关报道，极大限制了其临床应用和深入开发。

既往针对开心散及相关改良制剂的研究^［10］，多集中于整体药效观察或单一病理机制探索，缺乏对“动物-细胞”双模型的系统验证，且未结合现代分离分析技术明确药效物质组成。本研究通过D-半乳糖皮下注射建立大鼠认知障碍模型，同时利用过氧化氢（hydrogen peroxide，H₂O₂）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）分别诱导SH-SY5Y细胞构建氧化应激及炎症模型，实现“整体-细胞”层面同步探讨人参健智片对认知障碍模型动物学习记忆能力的影响及神经保护作用；此外，运用超高效液相色谱-串联质谱（ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）技术系统分析人参健智片的化学成分组成，明确其发挥作用的物质基础，为阐释中药复方多靶点协同改善认知障碍的科学内涵提供新视角，也为同类中药复方的现代化研究提供可参考的技术路径。

1 材料与方法

1.1　细胞、实验动物、主要试剂和仪器

人源神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y购自武汉普诺赛生命科技有限公司。42只SPF级SD大鼠，雄性，12周龄，体质量400~450 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物使用许可证号：SYXK（吉）2018-0014，实验动物生产许可证号：SCXK（辽）2020-0001。D-半乳糖购自山东科源生化有限公司，盐酸多奈哌齐片购自重庆锐恩医药有限公司，人参健智片由长春中医药大学附属医院中医药研究中心提供，噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自北京兰杰柯科技有限公司，苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）高清恒染试剂盒购自武汉赛维尔生物科技有限公司，DMEM/F-12（1∶1）培养基购自赛默飞世尔（苏州）仪器有限公司，酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒购自江苏酶免实业有限公司，肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）、 白细胞介素6 （interleukin-6，IL-6）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、人超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和人还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）检测试剂盒及2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯（2'，7'- dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）荧光检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。Nikon ECLIPSE E100正置显微镜和Nikon IX-73型倒置显微镜（配备DS-U3数码成像系统）均购自日本尼康株式会社，BioTek Lionheart FX型荧光显微镜购自美国伯腾仪器有限公司，WMT-100S型Morris水迷宫购自成都泰盟软件有限公司，Thermo Scientific^TM Vanquish^TM UHPLC超高效液相色谱仪和Thermo Scientific^TM Q Exactive^TM HF高分辨质谱仪均购自美国赛默飞世尔科技公司，AMR-100型酶标仪购自杭州奥盛仪器有限公司，JXFSTPRP-48型全自动样品快速研磨仪购自上海净信实业发展有限公司。其他实验相关试剂及耗材由长春中医药大学附属医院中医药研究中心提供。

1.2　实验动物分组、造模和处理

42只大鼠适应性喂养5 d后，随机分为对照组、模型组、盐酸多奈哌齐组（0.45 mg·kg^-1盐酸多奈哌齐）、开心散组（1.35 g·kg^-1开心散）、低剂量人参健智片组（2.17 g·kg^-1人参健智片）和高剂量人参健智片组（10.85 g·kg^-1人参健智片），每组7只。从实验开始第1天起，除对照组外，其余5组大鼠每日皮下注射500 mg·kg^-1 D-半乳糖；对照组大鼠每日皮下注射等体积生理盐水，造模持续10周。从实验开始第1天起，除对照组和模型组外，其余5组大鼠根据分组剂量每日灌胃给药1次；对照组和模型组大鼠每日灌胃给予等体积生理盐水，给药干预持续10周。

1.3　Morris水迷宫实验评估各组大鼠空间学习和记忆能力

在完成10周的D-半乳糖造模及药物干预后（即实验开始第11周），采用Morris水迷宫系统评估大鼠的空间学习和记忆能力。测试在1个直径160 cm的圆形水池中进行，水温维持在（23±1）℃。水池被划分为4个虚拟象限，1个圆形隐藏平台（直径约10 cm，平台表面低于水面约1~2 cm）固定放置于其中1个象限（目标象限）的中央，水池周围覆盖遮光布以减少环境干扰。每只大鼠背对平台放入池中，每天训练4次，每次随机选择不同象限，2次训练时间间隔15~20 min，连续训练4 d，记录大鼠寻找平台时间，时间超过120 s，则引导大鼠在平台停留10 s。第5天移除平台，开始进行空间探索。将大鼠由第3象限置入水中，记录大鼠平台穿越次数和有效区域滞留时间，用于评价大鼠的空间记忆和空间辨别能力。

1.4　HE染色观察各组大鼠海马组织病理形态表现

大鼠经全身麻醉后，通过腹主动脉穿刺取血处死，取完整脑部固定于4%多聚甲醛中，24 h后将固定脑组织取出进行石蜡包埋，根据大鼠海马组织位置结构进行石蜡切片，HE染色，脱水封片后，采用光学显微镜观察各组大鼠海马组织病理形态表现。

1.5　细胞分组和处理

基础培养基中加入10% FBS和1%青-链霉素配制完全培养基，使用完全培养基复苏SH-SY5Y细胞，置于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中培养。当细胞数量达到90%时，进行传代操作，将处于对数生长期的细胞从皿壁上吹打下来，进行细胞计数，并接种于细胞培养板。将细胞分为对照组、模型组和低、中及高剂量人参健智片组，模型组建立2种细胞模型，分别为细胞炎症模型（LPS处理）和氧化应激模型（H₂O₂处理）。对照组：加完全培养基处理细胞；炎症模型组（LPS组）：加完全培养基和500 µg·L^-1 LPS处理细胞；氧化应激模型组（H₂O₂组）：加完全培养液和0.625 mmol·L^-1 H₂O₂处理细胞，给药组在模型组的基础上，分别加入62.500 0、125.000 0和250.000 0 mg·L^-1人参健智片溶液。

1.6　MTT法检测各组细胞存活率

H₂O₂设置3个浓度：0.312 5、0.625 0和1.250 0 mmol·L^-1；LPS设置3个浓度：125、250和500 mg·L^-1；人参健智片复方设置7个浓度：7.812 5、15.625 0、31.250 0、62.500 0、125.000 0、250.000 0和500.000 0 mg·L^-1。将处于对数生长期的细胞从培养皿壁上吹打下来，计数后以每孔7×10³个细胞的密度接种至96孔细胞培养板，贴壁培养24 h后弃培养基，对照组和各药物组每组设置3个复孔。培养24 h后，加入10 μL，0.5 g·L^-1 MTT溶液，避光孵育4 h，加入终止液后过夜，采用酶标仪于波长570 nm处测定吸光度（A）值，计算各组细胞存活率。细胞存活率=（实验组A值-空白组A值）/（对照组A值-空白组A值）×100%。

1.7　DCFH-DA荧光法检测各组细胞中ROS水平

各组细胞进行对应处理后培养24 h，吸出细胞培养基，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2次，并向每个孔中加入1 mL终浓度为10 μmol·L^-1的DCFH-DA；37 ℃细胞培养箱孵育20 min，用PBS缓冲液清洗每个孔，重复3次；随后于荧光显微镜下观察各组ROS荧光强度。使用Image J软件进行图像分析，以对照组的荧光强度值作为阈值，分析实验组荧光强度的细胞百分率，以细胞百分率代表ROS水平。

1.8　ELISA法检测各组细胞上清液中氧化应激和炎性标志物水平

收集各组细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书操作，根据要求设置酶标仪波长检测A值，根据说明书绘制标准曲线，计算各组细胞上清液中MDA、GSH、TNF-α、IL-6和IL-1β水平及SOD活性。

1.9　UHPLC-MS/MS法分析人参健智片化学组成成分

取适量混合均匀的样品置于2 mL离心管中，并加入1 mL 70%甲醇和3 mm规格的钢珠。使用全自动样品快速研磨仪（振动频率为70 Hz）进行振荡破碎，持续3 min。取出，涡旋10 min混匀。4 ℃、12 000 r·min^-1离心10 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，加入100 mg·L^-1内标溶液（2-氯苯丙氨酸），使其浓度为1 mg·L^-1，上机检测。

液相条件：色谱柱，C18色谱柱（Zorbax Eclipse C18，1.8 μm×2.1 mm×100 mm），柱温为30 ℃。流动相A为乙腈，B为甲酸，流速0.3 mL·min^-1，梯度洗脱程序：0~2 min，0%~5% A，100%~95% B；2~6 min，5%~30% A，95%~70% B；6~7 min，30%~30% A，70%~70% B；7~12 min，30~78% A，70%~22% B；12~14 min，78%~78% A，22%~22% B；14%~17 min，78%~95% A，22%~5% B；17%~20 min，95%~95% A，5%~5% B；20%~21 min，95%~5% A，5%~95% B；21%~25 min，5%~5% A，95%~95% B，进样量为2 μL，自动进样器温度4 ℃。

质谱条件：加热器温度325 ℃，鞘气流速45 arb，辅助气流速15 arb，吹扫气流速1 arb，电喷雾电压3.5 kV，毛细管温度330 ℃，离子透镜射频水平55%。扫描模式为一级全扫描模式（FullScan），质荷比（mass charge ratio，m/z）100~1 500；与数据依赖性二级质谱扫描（dd-MS²），Top N=5；分辨率120 000（一级质谱）和60 000（二级质谱）；碰撞模式为高能量碰撞解离（high-energy collision dissociation，HCD）。

通过UHP LC-MS/MS技术结合Compound Discoverer 3.3软件进行保留时间矫正、色谱峰识别和提取，并基于二级质谱碎片离子信息，经高分辨质谱（high resolution mass spectrum，HRMS）数据匹配（质量误差<5 ppm，1 ppm=1×10^-6）及二级质谱库（NIST 2020/MassBank）比对鉴定人参健智片中化学组成成分。

1.10　统计学分析

采用 GraphPad Prism 9.5软件进行统计学分析。各组大鼠平台穿越次数和有效区域滞留时间，各组细胞存活率，细胞中ROS水平，细胞培养上清液中MDA、GSH、TNF-α、IL-6和IL-1β水平及SOD活性均符合正态分布且方差齐，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　各组大鼠平台穿越次数和有效区域滞留时间

与对照组比较，模型组大鼠平台穿越次数明显减少（P<0.01），有效区域滞留时间明显缩短（P<0.01）。与模型组比较，盐酸多奈哌齐组大鼠平台穿越次数明显增加（P<0.01），低剂量人参健智片组大鼠平台穿越次数明显增加（P<0.01），有效区域滞留时间明显延长（P<0.01）；与模型组比较，开心散组和高剂量人参健智片组大鼠平台穿越次数和有效区域滞留时间有所增加，但差异均无统计学意义（P>0.05），盐酸多奈哌齐组大鼠有效区域滞留时间差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2　各组大鼠海马组织病理形态表现

对照组大鼠海马神经元形态规则，排列整齐且密集。与对照组比较，模型组大鼠海马细胞数量明显减少，细胞间隙增宽，并可见较多锥体细胞及颗粒细胞皱缩，排列紊乱、稀疏。与模型组比较，盐酸多奈哌齐组、开心散组、低和高剂量人参健智片组大鼠海马组织均显示出不同程度的改善，细胞数量增加，细胞形态相对规整，排列相对整齐，可见锥体细胞皱缩，但整体情况明显改善，表现为细胞间隙相对较小，排列情况有所改善。见图1。

2.3　各组SH-SY5Y细胞存活率

与对照组比较，0.312 5、0.625 0和1.250 0 mmol·L^-1 H₂O₂组SH-SY5Y细胞存活率均明显降低（P<0.01），125、250和500 mg·L^-1 LPS组SH-SY5Y细胞存活率均 明 显 降 低（P<0.01）。当 H₂O₂ 浓 度 达 到0.625 0 mmol·L^-1，LPS浓度达到500 mg·L^-1 时，细胞存活率最接近50%，故选用0.625 0 mmol·L^-1 H₂O₂和500 mg·L^-1 LPS分别处理细胞进行后续实验。与对照组比较，7.812 5、15.625 0、31.250 0、62.500 0、125.000 0和250.000 0 mg·L^-1人参健智片组细胞存活率无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）；500.000 0 mg·L^-1人参健智片组细胞存活率明显降低（P<0.01）。基于MTT实验结果，最终选定62.500 0、125.000 0和250.000 0 mg·L^-1人参健智片进行后续实验。见图2。

2.4　各组细胞中ROS水平

与对照组（46.04%± 0.80%） 比较， H₂O₂组细胞中ROS水平 （99.65%± 4.35%）明显升高（P<0.01），表明氧化应激模型成功建立。与H₂O₂组比较，62.500 0、125.000 0和250.000 0 mg·L^-1人参健智片组细胞中ROS水平（82.94%±2.38%、 48.44%±3.58%和60.66%± 4.59%）均明显降低（P<0.01）。125.000 0 mg·L^-1人参健智片组细胞中ROS水平最低，提示在此浓度下其对H₂O₂诱导的ROS生成抑制最为明显。见图3。

2.5　各组细胞上清液中和MDA和GSH水平及SOD活性

与对照组比较，H₂O₂组细胞上清液中MDA水平明显升高（P<0.01），GSH水平和SOD活性明显降低（P<0.01），表明氧化应激损伤模型成功建立。与H₂O₂组比较，62.500 0、125.000 0和250.000 0 mg·L^-1人参健智片组细胞上清液中MDA水平明显降低（P<0.05或P<0.01），SOD活性和GSH水平明显升高（P<0.05或P<0.01）。其中，125.000 0 mg·L^-1人参健智片组细胞上清液中MDA水平降低和SOD活性及GSH水平升高效果最为明显，其各项指标恢复程度最佳。见表2。

2.6　各组细胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β水平

与对照组比较，LPS组细胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β水平均明显升高（P<0.01），表明炎症模型成功建立。经人参健智片干预后，与LPS组比较，62.500 0、125.000 0和250.000 0 mg·L^-1人参健智片组细胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β水平均明显降低（P<0.01），均表现出明显的抗炎作用。见表3。

2.7　人参健智片的化学组成成分鉴定

UHPLC-MS/MS技术分析共鉴定出73个化合物。人参健智片来源与化学类别分布：人参来源的化合物以三萜皂苷类为主（15个）；远志来源成分主要为寡糖酯类和酮类（10个）；茯苓中主要含有孕烯醇酮脂类化合物（5个）；葛根来源的化合物以黄酮类为主（28个）；川芎中的成分主要为酚酸类和内酯（苯酞）类（19个）；姜黄中鉴定出的化合物主要为二芳基庚类（5个）；冰片中主要含有孕烯醇酮脂类（2个）（化合物归属依据药材主要来源，部分成分可能存在交叉）。见图4。

3 讨 论

随着年龄增长，大脑细胞的更新和清除能力下降，导致衰老细胞在海马体和前额叶皮层等关键脑区积累，进而引发慢性神经炎症和氧化应激损伤，最终造成突触可塑性降低和认知功能损害^［11-12］。在细胞水平上，衰老过程常伴随线粒体功能障碍、蛋白质稳态失衡和DNA损伤积累，上述病理变化共同构成了神经退行性变的重要分子基础^［13-14］。过度活跃的氧化应激反应和持续的炎症反应，被认为是连接衰老与神经退行性疾病的关键病理环节^［15］。本研究基于D-半乳糖诱导的认知障碍大鼠模型，系统评估了人参健智片改善认知功能的疗效及潜在机制。本研究结果显示：在Morris水迷宫实验中人参健智片组大鼠空间记忆能力明显增强，表现为平台穿越次数增加和有效区域滞留时间延长。HE染色结果显示：模型组大鼠海马神经元数量减少、排列紊乱、细胞间隙增大，人参健智片治疗后能有效增加海马神经元数量，改善海马CA1区神经元排列紊乱和核固缩现象。提示人参健智片可能通过维持海马神经元结构的完整性，保护神经环路功能，从而逆转认知损伤。

氧化应激和炎症级联反应是认知障碍进程中导致神经细胞死亡的核心病理环节^［16-17］。氧化应激发生时，大量积累的ROS会攻击神经细胞内的生物大分子，诱导神经细胞凋亡或坏死^［18］；而炎症反应过程中释放的IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性细胞因子，不仅会直接损伤神经细胞，还会形成炎症级联反应，加重神经损伤^［19］。本研究通过SH-SY5Y细胞模型进一步揭示人参健智片的神经保护机制，在抗氧化防御层面上，人参健智片可提升H₂O₂损伤细胞的活性，明显降低脂质过氧化标志物MDA水平、提高SOD活性和内源性抗氧化系统GSH水平，并有效抑制ROS过量生成；在抗炎调控层面上，人参健智片明显抑制LPS诱导的促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的释放。细胞实验明确了人参健智片的抗氧化和抗炎作用，通过MTT实验确定了药物本身的安全浓度范围，为后续机制研究提供了可靠的剂量依据。值得注意的是，125.000 0 mg·L^-1人参健智片在ROS抑制和氧化标志物调节中均呈现最优效果，表明该剂量可能为关键药效阈值。上述结果表明：人参健智片通过同步增强抗氧化防御能力和阻断炎症级联反应，构建双维度的神经保护网络。

本研究通过复方物质基础解析为机制阐释提供分子依据。UHPLC-MS/MS技术鉴定结果显示：人参健智片中共含73种活性成分，其中人参皂苷类（Rb3和Rg1）作为核心组分，可显著提高SOD活性并清除ROS积累，从而减轻氧化应激对神经细胞的损伤^［20-21］；葛根黄酮类（葛根素）具有较强的自由基清除能力，协同减轻脂质过氧化损伤，降低氧化应激标志物水平^［22-23］；远志寡糖酯^［24-25］和川芎苯酞内酯^［26-27］等成分可能通过调节神经递质或改善微循环，间接促进认知功能恢复。不同成分群可能分别作用于神经炎症通路、氧化应激通路形成“多成分-多靶点-多通路”的综合作用模式，这种多组分协同作用揭示了人参健智片在动物与细胞模型中的多通路调控优势——人参皂苷与葛根黄酮主导抗氧化/抗炎核心机制，其余成分则通过靶向突触可塑性和线粒体功能等辅助通路，共同构成复方整体疗效的物质基础^［28］，这可能是中药复方治疗复杂性疾病（衰老相关认知障碍）的优势。

综上所述，本研究初步构建了“行为改善-细胞保护-成分解析”证据链，并证实人参健智片对海马神经元具有保护作用，其作用与调控氧化应激和神经炎症存在关联。但人参健智片中活性成分的体内代谢途径，如血脑屏障穿透率和入脑成分动态变化仍需通过药代动力学深入研究，本课题组未来将建立“入血成分谱-关键靶点-药效标志物”的定量关联模型，以推动复方精准优化与临床转化。

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基金资助

吉林省科技厅科技发展计划项目(20230204045YY)

吉林省教育厅科学技术研究项目(JJKH20250661KJ)

吉林省教育厅科学技术研究项目(JJKH20241351KJ)