基于子宫内膜异位症患者异位子宫内膜组织代谢特征的非靶向代谢组学分析

Non-targeted metabolomics analysis based on metabolic characteristics of ectopic endometrium tissue of patients with endometriosis

摘要

目的 采用非靶向代谢组学技术探索子宫内膜异位症（EMs）患者异位子宫内膜组织的特征性代谢物，阐明疾病发生发展中的关键代谢调控网络。 方法 收集2024年1月—2025年1月行手术治疗的91例EMs患者（EMs组）配对的异位和在位子宫内膜组织及63例非EMs患者（非EMs组）的正常子宫内膜组织，采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS/MS）进行非靶向代谢组学检测分析。通过R（v4.3.0）软件进行数据统计分析，结合主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）等多元统计分析方法筛选疾病特征性代谢产物，并采用京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库进行代谢通路富集分析。 结果 共收集245例子宫内膜组织，其中EMs患者配对的异位和在位子宫内膜组织各91例，正常子宫内膜组织63例，EMs组患者平均年龄为（37.10±3.26）岁，非EMs组患者平均年龄为（38.85±4.67）岁。所有样本共鉴定出2 116种代谢物，其中EMs患者中，与在位子宫内膜比较，异位子宫内膜共有247种代谢物上调，161种代谢物下调；与同期非EMs患者正常子宫内膜比较，EMs患者异位子宫内膜共有412种代谢物上调，97种代谢物下调；与非EMs患者正常子宫内膜比较，EMs患者在位子宫内膜共有94种代谢物上调，65种代谢物下调。与EMs患者在位子宫内膜和非EMs患者正常子宫内膜比较，EMs患者异位子宫内膜共有以6-乙酰氨基-3-氧代己酸酯为代表的163种代谢物上调，以阿洛沙敏为代表的39种代谢物下调。KEGG代谢通路分析，组胺、酪胺、多巴胺和棕榈酰乙醇胺等上调的代谢物显著富集于神经活性配体-受体相互作用通路（P<0.05）。 结论 EMs患者异位子宫内膜存在显著代谢重编程，其中以6-乙酰氨基-3-氧代己酸酯为代表的代谢物在异位子宫内膜中明显升高，上调代谢物显著富集于神经活性配体-受体相互作用通路。

Abstract

Objective To explore the characteristic metabolites in ectopic endometrium tissue of the patients with endometriosis （EMs） based on non-targeted metabolomics technology， and to clarify the key metabolic regulatory networks in the occurrence and development of the disease. Methods Paired ectopic and eutopic endometrium tissues from 91 EMs patients who（EMs group） underwent surgical treatment from January 2024 to January 2025， and normal endometrium tissue from 63 non-EMs patients（non-EMs group） were collected. Ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） was used for non-targeted metabolomics detection and analysis. R （v4.3.0） software was used for statistical analysis of the data； principal component analysis （PCA） and orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA） were used to screen the characteristic metabolites of the disease； and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） database was used for metabolic pathway enrichment analysis. Results A total of 245 endometrium tissue samples were collected， including 91 paired ectopic and eutopic endometrium tissue samples from the EMs patients and 63 normal endometrium tissue samples. The average age of patients in EMs group was （37.10±3.26） years old， and that of non-EMs group was （38.85±4.67） years old. A total of 2 116 metabolites were identified in all samples. Among the EMs patients， compared with eutopic endometrium tissue， 247 metabolites were up-regulated and 161 metabolites were down-regulated in ectopic endometrium tissue； compared with normal endometrium tissue of non-EMs patients， 412 metabolites were up-regulated and 97 metabolites were down-regulated in ectopic endometrium tissue of EMs patients； compared with normal endometrium tissue of non-EMs patients， 94 metabolites were up-regulated and 65 metabolites were down-regulated in eutopic endometrium tissue of EMs patients. Compared with both eutopic endometrium tissue of EMs patients and normal endometrium tissue of non-EMs patients， 163 metabolites represented by 6-acetamido-3-oxohexanoate were up-regulated， and 39 metabolites represented by alloxamine were down-regulated in ectopic endometrium tissue of EMs patients. KEGG metabolic pathway analysis showed that the up-regulated metabolites such as histamine， tyramine， dopamine and palmitoylethanolamide were significantly enriched in the neuroactive ligand-receptor interaction pathway （P<0.05）. Conclusion There is significant metabolic reprogramming in the ectopic endometrium tissue of EMs patients. Among them， metabolites represented by 6-acetamido-3-oxohexanoate are significantly increased in ectopic endometrium tissue， and the up-regulated metabolites are significantly enriched in the neuroactive ligand-receptor interaction pathway.

Graphical abstract

关键词

子宫内膜异位症 / 非靶向代谢组学 / 代谢物 / 代谢通路 / 京都基因与基因组百科全书 / 富集分析

Key words

Endometriosis / Non-targeted metabolomics / Metabolite / Metabolic pathway / Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes / Enrichment analysis

子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）是一种常见的激素依赖性的慢性妇科疾病，其特征是子宫内膜样组织在子宫腔被覆内膜以外的部位生长。EMs在育龄期女性中的发病率高达5%~10%，是引发慢性盆腔痛、痛经和不孕的主要原因之一，严重影响患者的生活质量及身心健康^［1］。目前关于EMs的发生机制尚未完全阐明，其中子宫内膜种植学说占主要地位，然而原位及异位子宫内膜的转录组学、基因组学、蛋白组学和代谢组学特征尚缺乏深入研究。

研究^［2-4］显示：EMs的发生发展与代谢异常密切相关，异位的子宫内膜细胞通过代谢重编程重塑其生物学特性，增强其迁移和侵袭的能力，从而导致疾病的进展。目前非靶代谢组学测序方式主要包括核磁共振光谱（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）、 气 相 色 谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）和液相色谱（liquid chromatography-mass spectrometer，LC-MS）等，尤其是超高效液相色谱-质谱联用技术（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrum in series，UPLC-MS/MS）能同时满足高速度、高灵敏度和高分辨率的需求。既往研究^［5-6］通过GC-MS和LC-MS技术探索异位子宫内膜的代谢特征，揭示了其在脂肪酸代谢、氨基酸代谢和能量代谢等方面可能存在紊乱。然而，现有研究样本量普遍偏小，且不同研究间发现的差异代谢物重叠度不高，除此之外，目前对于中国人群EMs患者异位子宫内膜的代谢特征尚缺乏大样本的研究。为此，本研究对EMs患者的在位和异位子宫内膜组织及非EMs患者的正常子宫内膜组织进行UPLC-MS/MS非靶向代谢组学分析，筛选与疾病密切相关的特征性代谢产物，并进一步探讨EMs发生发展过程中涉及的代谢途径，为寻找潜在的治疗靶点提供理论依据。

1 资料与方法

1.1　研究对象

收集2024年1月—2025年1月于安徽医科大学第二附属医院经腹腔镜及病理确诊的91例EMs患者（EMs组）在位和异位子宫内膜组织样本。诊断标准：腹腔镜手术发现子宫、卵巢和盆腔腹膜等部位存在蓝紫色结节，并进一步通过活检病理检查，检出子宫内膜腺体和（或）间质细胞；同时获取63例因妇科良性疾病行腹腔镜手术且经组织病理检查排除EMs患者（非EMs组）的正常子宫内膜组织。本研究通过安徽医科大学第二附属医院伦理委员会批准 （伦理批号：SL-YX2024-180），所有受试者均知情同意。

1.2　纳入标准和排除标准

EMs组纳入标准：①经组织病理证实为EMs的患者；②非月经期；③体质量指数（body mass index，BMI）正常；④月经周期正常；⑤体格检查和实验室检查无其他疾病；⑥术前未使用任何激素类药物治疗者。非EMs组纳入标准：①因妇科良性疾病行腹腔镜手术且经组织病理检查排除EMs的患者；②术前未使用任何激素类药物治疗者；③非月经期；④BMI正常；⑤月经周期正常；⑥体格检查和实验室检查无其他疾病。

排除标准：①并发乙型病毒性肝炎等感染性疾病；②并发多囊卵巢综合征、糖尿病、甲状腺功能异常、血脂异常等内分泌疾病；③并发心血管疾病；④并发全身性红斑狼疮等风湿性疾病和自身免疫性相关疾病；⑤并发激素依赖性妇科疾病；⑥既往并发恶性肿瘤者；⑦无法取得知情同意者。

1.3　主要试剂和仪器

LC-MS级甲醇和乙腈购自德国CNW Technologies公司，LC-MS级甲酸铵购自美国Sigma-Aldrich公司，LC-MS级氨水购自美国Fisher Chemical公司。冷冻离心机（型号：H1850-R）购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司， Thermo Vanquish型超高效液相系统和Thermo Orbitrap Exploris 120型质谱检测器均购自美国Thermo Fisher Scientific公司，ACQUITY UPLC^® HSS T3 1.8 µm（2.1 mm×100 mm）色谱柱购自美国Waters公司。

1.4　样品采集

手术中剥离并取出子宫内膜异位囊肿壁组织，在送检快速病理检查前用剪刀剪取约0.5 cm×0.5 cm样本组织，同时刮取少量子宫内膜组织，经生理盐水冲洗干净后将标本放入标本袋中，立即放入-80 ℃冰箱冷冻备用。同期收集妇科良性附件囊肿或肌瘤患者的少量子宫内膜组织，于生理盐水冲洗干净后放入标本袋中，立即放入-80 ℃冰箱冷冻备用。

1.5　代谢组学样本处理

精确称量适量样品于2 mL离心管中，准确加入1 000 µL组织提取液，为75%甲醇氯仿混合液［甲醇∶氯仿（9∶1）］：25% H₂O，-20 ℃保存，放入组织研磨器，50 Hz研磨60 s，室温超声30 min，冰上放置30 min后12 000 r·min^-1、4 ℃离心10 min，取全部上清液放入离心管中，浓缩干燥，准确加入200 μL 50%乙腈溶液配制2-氯- L-苯丙氨酸溶液（4 mg·L^-1），4 ℃保存。复溶样品，过滤液加入到检测瓶中，然后自每个待测样品中各取20 µL混合成质量控制（quality control，QC）样品，剩余待测样品进行液相色谱质谱/质谱联用仪（liquid chromatography mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS）检测。

1.6　LC-MS法检测代谢物

色谱条件：柱温40 ℃，流速0.30 mL·min^-1；流动相为正离子0.1%甲酸乙腈（B2）和0.1%甲酸水（A2）；负离子乙腈（B3）和5 mmol·L^-1甲酸铵水（A3）；2 µL进样量。流动相梯度洗脱程序：正离子模式，0~1.0 min，10% B2；1.0~5.0 min，10%~98% B2；5.0~6.5 min，98% B2；6.5~6.6 min，98%~10% B2；6.6~8.0 min，10% B2；负离子模式，0~1.0 min，10% B3；1.0~5.0 min，10%~98% B3；5.0~6.5 min，98% B3；6.5~6.6 min，98%~10% B3；6.6~8.0 min，10% B3。质谱条件：电喷雾离子源（electro-spray ionization，ESI），正负离子模式分别采集数据。正离子喷雾电压为3.50 kV，负离子喷雾电压为-2.50 kV，鞘气40 arb，辅助气10 arb。 毛细管温度325 ℃， 以分辨率60 000进行一级全扫描，一级离子扫描范围质核比（mass to charge ratio，m/z）100~1 000，并采用高能碰撞解离（higher-energy colltsional dissociation，HCD）进行二级裂解，碰撞能量为30%，二级分辨率为15 000，采集信号前4位的离子进行碎裂，同时采用动态排除技术去除无必要的MS/MS信息。

1.7　子宫内膜组织代谢物的生物信息学分析

通过Proteowizard软件包（v3.0.8789）中MSConvert工具将质谱下机原始文件转换为mzXML文件格式，利用R软件XCMS包进行峰识别、峰过滤和峰对齐，得到包括m/z、保留时间（retention time，rt）及峰面积等信息的数据矩阵，并采用总峰面积归一化进行定量值校正。 使用R软件MetaboAnalystR包进行无监督主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（rthogonal partial least squares discriminant analysis， OPLS-DA）， 以变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）>1且P<0.05为标准筛选组间差异代谢产物作为潜在生物标志物，绘制韦恩图并获取不同分组间差异代谢物的交集。代谢物的鉴定首先确认代谢物精确相对分子质量（相对分子质量误差<30 ppm，1 ppm=1×10^-6），后续根据MS/MS碎片模式对人类代谢组数据库（Human Metabolome Database，HMDB）（http：//www.hmdb.ca）、质谱数据库［（massbank（http：//www.massbank.jp/）］、 LipidMaps （http：//www.lipidmaps.org）、mzcloud（https：//www.mzcloud.org） 及自建标准品数据库确认注释获得代谢物。采用MetPA基于京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库分析2组样本差异代谢物的相关代谢通路，通过路径拓扑分析计算的影响值阈值设置为0.1，高于0.1的影响值阈值被认为是潜在的代谢途径。

1.8　统计学分析

采用R（v4.3.0）软件进行统计学分析。患者年龄和BMI符合正态分布，以x±s表示，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　研究对象的基线资料

本研究纳入154例患者，共245份样本进行非靶代谢组学测序，其中EMs组共91例配对的异位和在位子宫内膜组织，非EMs组共63例正常子宫内膜组织。纳入研究对象的基线资料如表1所示，EMs组与非EMs组患者的年龄和BMI等临床资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2　样本多元统计分析

代谢组学质控分析结果显示：QC样本在正、负离子模式下的PCA分析中呈高度聚集，表明样本数据稳定性良好。OPLS-DA分析结果表明：该模型能够对EMs患者的异位子宫内膜组织和在位子宫内膜组织及同期非EMT患者的在位正常子宫内膜组织3组样本进行有效区分。置换验证显示：正离子模式下模型对Y变量（分组信息）的累积解释率［cumulative variance explained of Y， R²Y（cum）］=0.27、累积预测能力［cumulative predictive ability，Q² （cum）］=-0.21，负离子模式下R²Y（cum）=0.24、Q²（cum）=-0.20，模型累积解释率>90%且无过拟合风险。见图1。

2.3　差异代谢物筛选

本研究纳入的245份子宫内膜组织，共鉴定到2 116个二级代谢物。以P<0.05且VIP>1为阈值，对代谢物进行筛选，寻找差异代谢物，结果见表2。EMs患者中，与在位子宫内膜组织比较，异位子宫内膜组织有247种代谢物上调，161种代谢物下调（图2A）。与同期非EMs患者的正常子宫内膜组织比较，EMs患者的异位子宫内膜组织有412种代谢产物上调，97种代谢物下调（图2B）。与同期非EMs患者的正常子宫内膜组织比较，EMs患者的在位子宫内膜组织显示有94种代谢物上调，65种代谢物下调（图2C）。相关差异上调或下调的代谢物主要归属于线粒体自噬、酪氨酸代谢、咖啡因代谢、组氨酸代谢、醛固酮调控的钠离子重吸收和流体剪切力等通路中（通路影响值Impact>0.1）。

2.4　多组间差异代谢物交集分析

多组间差异代谢物交集分析结果显示：与EMs患者的在位子宫内膜组织及非EMs患者的正常子宫内膜组织比较，EMs患者的异位子宫内膜组织共同上调的代谢物有163种，共同下调的代谢物有39种。见图3。其中VIP值最高的10种代谢物信息见表3。其中丙二酸半醛、乙醛酸、2-甲基丁酰甘氨酸、咪唑-4-甲醛和6-乙酰氨基-3-氧代己酸酯等为上调差异代谢物，阿洛沙敏和3-氧代辛酰基辅酶A为下调差异代谢物。

2.5　差异代谢物KEGG代谢通路富集分析

将3组间差异代谢物交集的202种代谢物进行KEGG代谢通路富集分析，结果显示：相关差异代谢物参与了可卡因成瘾、乙醛酸和二羧酸代谢、安非他明成瘾、酒精依赖、催乳素信号通路、突触囊泡循环及多巴胺能突触等80条代谢途径，代谢物升高为主要差异。与EMs患者的在位内膜组织和非EMs患者的正常内膜组织比较，EMs患者的异位内膜组织在多个代谢通路中呈现明显异常，如在可卡因成瘾、安非他明成瘾、酒精依赖、催乳素信号通路、多巴胺能突触和神经活性配体-受体相互作用等代谢通路中，代谢物L-酪氨酸和多巴胺水平明显升高；在突触囊泡循环代谢通路中，异位内膜组织中组胺和多巴胺水平明显升高；在乙醛酸和二羧酸代谢通路中，异位内膜组织中乙醛酸、磷酸二羟丙酮、D-甘油酸-3-磷酸、磷酸甘油酸和丙二酸半醛水平明显升高；在脂肪酸降解代谢通路中，异位内膜组织中3-氧代辛酰基辅酶A水平明显降低。差异代谢物在部分通路中的富集情况见图4和表4。

3 讨 论

EMs是一种慢性炎症性疾病，具有侵袭性生长的特点，常见临床症状为痛经和慢性盆腔痛，严重危害女性的身心健康^［7］。激素治疗包括孕激素、雌激素-孕激素、促性腺激素释放激素类似物（gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRH-a）或口服拮抗剂，可抑制月经并缓解疼痛^［8］。提示激素及代谢异常在EMs发生发展过程中发挥重要作用。研究^［9-11］显示：在子宫外异位的内膜组织中，缺氧微环境和雌二醇（estradiol，E2）及孕酮（progesterone，P4）水平发生显著变化，其可通过调节代谢途径来改变细胞代谢。体外实验^［12-13］表明：EMs的代谢途径从氧化代谢转变为糖酵解代谢，这种转变类似于瓦伯格效应，是癌细胞为支持快速分裂而积极采取的一种机制，在相关机制中，细胞通过有氧糖酵解来分裂并产生生物量和能量，其速率更高，表明代谢异常对异位子宫内膜获得侵袭潜能至关重要^［14-15］。

本研究建立基于UPLC-MS/MS的非靶向代谢组学的检测方法，对91例EMs患者异位子宫内膜组织和在位子宫内膜组织及同期63例非EMs患者的正常子宫内膜组织进行分析，共鉴定出2 116种二级代谢物，对代谢物进行筛选，并进行多组间差异代谢物交集分析显示：EMs患者的异位子宫内膜中特异性上调的代谢物有163种，特异性下调的代谢物有39种，其中丙二酸半醛、乙醛酸、2-甲基丁酰甘氨酸、咪唑-4-甲醛和6-乙酰氨基-3-氧代己酸酯等为上调差异代谢物，阿洛沙敏和3-氧代辛酰基辅酶A为下调差异代谢物。此类上调代谢物以醛类化合物、有机酸和有机碱为主。如丙二酸半醛是一种半醛化合物，在多种有机化合物合成过程中发挥重要作用，可被进一步氧化成为酸或还原成为醇^［16］。乙醛酸又称甲酰甲酸，是最简单的醛酸，发挥T淋巴细胞介导的接触增敏剂的作用，能够使辅酶Ⅰ/还原型辅酶Ⅰ的比值维持稳定，防止相关酶活性丧失。乙醛酸作为一种营养素，可导致分化标志物（肌球蛋白重链Ⅱ和肌原调节因子）的表达增加、线粒体生物合成和氨基酸（甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸）及其代谢物（柠檬酸和琥珀酸）的细胞内水平升高^［17］。相关研究^［18］发现：一些黄酮类化合物和紫杉醇与乙醛酸偶联物对中性粒细胞氧化爆发的抑制作用，在这些反应中，一小部分类黄酮及其多酚衍生物对细胞功能的影响可能会发生变化。2-甲基丁酰甘氨酸是一种酰胺类化合物，具有酸性和碱性。研究^［19］显示：2-甲基丁酰甘氨酸的积累会诱导脂质过氧化损伤并降低大鼠大脑中的抗氧化防御能力，参与短链/支链酰基辅酶A脱氢酶（short/branched chain acyl-CoA dehydrogenase，SBCAD）缺陷脑损伤的病理生理学。而具有分解代谢功能的3-氧代辛酰基辅酶A等则产生减少^［20］。由此可见，EMs的发生可能与醛类和酸类化合物增加有关，抑制机体暴发性免疫反应，形成缓慢持续氧化应激和低炎症反应，生长因子和促血管生成物质增加，而无法有效清除异位内膜，造成疾病缓慢进展。

对异位子宫内膜特异性代谢物进行KEGG代谢通路富集分析结果显示：相关代谢物参与了神经活性配体-受体相互作用通路、可卡因成瘾、乙醛酸和二羧酸代谢、安非他明成瘾、酒精依赖、催乳素信号通路、突触囊泡循环和多巴胺能突触等80条代谢途径，代谢物升高为主要差异，其中酪氨酸和多巴胺在多种通路中同步升高。酪氨酸是一种重要的营养必需氨基酸，对人和动物的新陈代谢和生长发育过程中发挥重要作用，是单胺能神经递质（多巴胺、肾上腺素和去甲肾上腺素）等激素生物合成的前体^［21］，L-酪氨酸水平降低与不良神经系统结局有关^［22］。多巴胺是儿茶酚胺类的一种，作为一种神经递质，在中枢神经系统中发挥关键的调节作用，在基因表达、内在电流、突触连接和神经递质共释放方面可能会导致功能多样化，不同的神经调节机制可以在不同的时间尺度上调节多巴胺的释放^［23-24］。本研究结果显示：EMs病灶中多种通路存在酪氨酸和多巴胺的同步显著升高，表明病灶局部处于高代谢和高反应状态，相关神经递质的增加可能与痛经有关。其中可卡因成瘾、多巴胺能突触、神经活性配体-受体相互作用和突触囊泡循环等关键代谢通路均与神经兴奋传导有关，相关通路的改变反映了神经营养因子增加、新生神经纤维和血管形成。神经纤维周围环境的炎症性改变，可诱发神经炎症级联反应，进而导致周围神经兴奋性和敏感性增加，疼痛阈值下降、疼痛反应加剧，最终形成外周敏化^［25-26］。

综上所述，EMs患者的异位子宫内膜与非EMs患者的正常子宫内膜比较，存在显著特异性代谢物，同时上述特异性代谢物主要富集于多巴胺能突触、神经活性配体-受体相互作用和突触囊泡循环等神经兴奋传导，相关差异代谢通路可能与异位病灶生长和痛经有关。

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基金资助

国家自然科学基金青年基金项目(82301896)

安徽省科技厅自然科学基金项目(2008085MH283)