DEB-TACE与c-TACE治疗中晚期肝细胞癌的免疫微环境差异及TRADD介导Th17分化的机制

Differences in immune microenvironment between DEB-TACE and c-TACE in treatment of hepatocellular carcinoma and mechanism of TRADD-mediated Th17 differentiation

摘要

目的 探讨药物洗脱微球经动脉化疗栓塞（DEB-TACE）与传统经动脉化疗栓塞（c-TACE）治疗中晚期肝细胞癌（HCC）后局部免疫微环境的差异，阐明肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域蛋白（TRADD）介导CD4⁺T淋巴细胞向17型辅助性T淋巴细胞（Th17）分化的可能机制。 方法 回顾性收集56例接受TACE治疗的中晚期HCC患者临床样本，分为DEB-TACE组和c-TACE组，每组28例。采用高通量RNA测序技术比较2组患者术前和术后HCC组织的基因表达谱及免疫细胞浸润丰度，流式细胞术分选2组患者HCC组织中的CD4⁺T淋巴细胞和Th17细胞，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法、Western blotting法和免疫荧光法检测细胞中TRADD及白细胞介素（IL）-23A等相关分子表达情况。体外分离活化原代CD4⁺T淋巴细胞，构建TRADD过表达（TRADD-OE）和敲低（TRADD-KD）模型，采用噻唑蓝（MTT）法检测各组CD4⁺ T淋巴细胞增殖活性，流式细胞术检测各组CD161⁺CCR6⁺ Th17细胞百分率，酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定各组细胞上清液中IL-17水平，Western blotting法和RT-qPCR法检测各组细胞中Janus激酶（JAK）/信号转导与转录激活因子（STAT）信号通路关键蛋白磷酸化JAK-2（p-JAK2）、磷酸化STAT3（p-STAT3）蛋白表达水平以及下游转录因子芳香烃受体（AHR）和RAR相关孤儿受体γt（RORγt）mRNA及蛋白表达水平。联合使用JAK抑制剂（Ruxolitinib）干预TRADD-OE细胞，再次检测上述Th17细胞分化和信号通路指标。 结果 与c-TACE组比较，DEB-TACE组术后HCC组织中TRADD和IL-23A mRNA表达水平明显升高（P<0.05），且中央记忆CD4⁺T淋巴细胞和Th17细胞的浸润丰度明显升高。与c-TACE组比较，DEB-TACE组HCC组织中CD4⁺T淋巴细胞百分率明显升高（P<0.05），且分选出的CD4⁺T淋巴细胞和Th17细胞中TRADD和IL-23A mRNA及蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）。与Con-OE组比较，TRADD-OE组CD4⁺T淋巴细胞增殖活性明显升高（P<0.01），CD161⁺CCR6⁺ Th17细胞百分率和上清中IL-17水平均明显升高（P<0.01），细胞中p-JAK2、p-STAT3、AHR和RORγt mRNA及蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）；与Con-KD组比较，TRADD-KD组上述各项指标均明显降低（P<0.01）。JAK抑制剂干预后，与TRADD-OE组比较，TRADD-OE+JAK inhibitor组CD161⁺CCR6⁺ Th17细胞百分率和上清中IL-17水平均明显降低（P<0.01），细胞中CD161和CCR6蛋白荧光强度以及AHR和RORγt mRNA及蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）。 结论 DEB-TACE相较于c-TACE能更显著地重塑HCC局部免疫微环境并增加Th17细胞浸润，其作用机制可能与TRADD高表达并激活JAK/STAT信号通路，进而上调AHR和RORγt表达，促进CD4⁺T淋巴细胞向Th17细胞分化有关。

Abstract

Objective To investigate the differences in the local immune microenvironment after drug-eluting bead transarterial chemoembolization （DEB-TACE） and conventional transarterial chemoembolization （c-TACE） for intermediate-advanced hepatocellular carcinoma （HCC）， and to clarify the possible mechanism by which tumor necrosis factor receptor-associated death domain （TRADD） mediates the differentiation of CD4⁺T lymphocytes into T helper 17 （Th17） lymphocytes. Methods The clinical samples from 56 patients with intermediate-advanced HCC who received TACE treatment were retrospectively collected and divided into DEB-TACE group and c-TACE group， with 28 cases in each group. High-throughput RNA sequencing was used to compare the changes in gene expression profiles and infiltration abundance of immune cells in HCC tissue before and after treatment in two groups. Flow cytometry was applied to sort CD4⁺T lymphocytes and Th17 cells from HCC tissues in two groups. The expressions of TRADD， interleukin （IL）-23A， and other related molecules in the cells were detected by real-time quantitative PCR （RT-qPCR） method， Western blotting method， and immunofluorescence method. The primary CD4⁺T lymphocytes were isolated and activated in vitro， and TRADD overexpression （TRADD-OE） and knockdown （TRADD-KD） models were constructed. The proliferation viability of CD4⁺T lymphocytes was detected by methytthiazolyl diphenyl-tetra zolilim（MTT） assay； the percentages of CD161⁺CCR6⁺ in Th17 cells in various group were detected by flow cytometry； the levels of IL-17 in the cell supernatant in various groups were measured by ELISA. The expression levels of key proteins of Janus kinase/signal transducer pathway and activator of transcription（STAT） signal phosphorylated-JAK2 （p-JAK2） and phosphorylated-STAT3 （p-STAT3） proteins and its downstream transcription factors aryl hydrocarbon receptor （AHR） and RAR-related orphan receptor gamma t （RORγt） mRNA and proteins were detected by Western blotting and RT-qPCR methods. The JAK inhibitor （Ruxolitinib） was used to intervene in TRADD-OE cells， and the aforementioned Th17 differentiation and signaling pathway indicators were detected again. Results Compared with c-TACE group， the expression levels of TRADD and IL-23A in post-operation HCC tissue in DEB-TACE group were significantly increased （P<0.05）， and the infiltration abundance of central memory CD4⁺T lymphocytes and Th17 cells was significantly increased. Compared with c-TACE group， the percentage of CD4⁺ T lymphocytes in HCC tissue in DEB-TACE group was significantly increased （P<0.05）， and the expression levels of TRADD and IL-23A mRNA and protein in the sorted CD4⁺T lymphocytes and Th17 cells were significantly increased （P<0.01）. Compared with Con-OE group， the proliferation activity of CD4⁺T lymphocytes in TRADD-OE group was significantly increased （P<0.01）； the of CD161⁺CCR6⁺ Th17 cells and the level of IL-17 in the supernatant were significantly increased （P<0.01）； the expression levels of p-JAK2， p-STAT3， AHR， and RORγt mRNA and proteins in the cells were all significantly increased （P<0.01）. Compared with Con-KD group， the above indicators in TRADD-KD group were all significantly decreased （P<0.01）. After intervention with JAK inhibitor， compared with TRADD-OE group， the percentage of CD161⁺CCR6⁺ Th17 cells and the level of IL-17 in the supernatant in TRADD-OE+JAK inhibitor group were significantly decreased （P<0.01）， and the fluorescence intensities of CD161 and CCR6， as well as the expression levels of AHR and RORγt mRNA and proteins in the cells， were significantly decreased （P<0.01）. Conclusion Compared with c-TACE， DEB-TACE can more significantly remodel the local immune microenvironment of HCC and increase Th17 cell infiltration. Its mechanism may be related to the high expression of TRADD and activating the JAK/STAT signaling pathway， thereby upregulating AHR and RORγt expressions and promoting the differentiation of CD4⁺T lymphocytes into Th17 cells.

Graphical abstract

关键词

肝细胞癌 / 药物洗脱微球经动脉化疗栓塞 / 免疫微环境 / 肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域蛋白 / 17型辅助性T淋巴细胞 / Janus激酶 / 信号转导与转录激活因子

Key words

Hepatocellular Carcinoma / Drug-eluting bead transarterial chemoembolization / Immune microenvironment / Tumor necrosis factor receptor-associated death domain / T helper 17 lymphocyte / Janus Kinase / Signal transducer and activator of transcription

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，尤其在亚太地区和非洲，其发病率和死亡率仍处于较高水平^［1］。尽管肝脏手术切除、肝移植和局部消融等治疗手段取得了一定的疗效，但对于中晚期HCC患者，尤其是不可切除或存在复发转移的患者，预后仍不理想^［2］。因此，寻找更有效的治疗方法一直是临床研 究 的 重 点。经 动 脉 化 疗 栓 塞（transarterial chemoembolization，TACE）作为中晚期HCC的标准治疗方法之一，已经被广泛应用^［3-4］。传统的TACE（conventional TACE，c-TACE）使用碘化油和化疗药物混合栓塞，虽然能够局部控制肿瘤生长，但其疗效受到药物释放速度和栓塞精度等因素的限制，而药物洗脱微球TACE（drug-eluting bead TACE，DEB-TACE）通过使用载药微球实现药物的缓慢释放及精准栓塞，从而提高了药物在肿瘤局部的浓度，改善了治疗效果^［5-6］。临床研究^［7-8］发现：DEB-TACE在客观缓解率（objective response rate，ORR）方面优于c-TACE，显示出更好的临床疗效。尽管DEB-TACE的临床疗效已被证实，但其具体的分子机制仍未完全阐明，尤其其对肝细胞癌免疫微环境的调控作用尚不清楚。肿瘤免疫微环境主要反映肿瘤组织中免疫细胞浸润、免疫相关分子表达及炎症因子的变化。免疫微环境特别是免疫细胞的浸润及其功能状态，对HCC的发生发展及治疗反应具有重要影响^［9-10］。在多种免疫细胞亚群中，CD4⁺ T淋巴细胞向17型辅助性T淋巴细胞（T helper lymphocyte 17，Th17）的分化尤为关键。Th17细胞在肿瘤免疫中扮演着复杂的角色：一方面通过分泌白细胞介素（interleukin，IL）-17等因子促进炎症和血管生成，另一方面又能招募免疫细胞增强抗肿瘤效应^［11-12］。研究^［13］显示：TACE治疗诱导的缺血缺氧环境可显著改变免疫微环境中的免疫细胞组成，如影响程序性死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）阳性T淋巴细胞（PD⁺T淋巴细胞）的浸润。然而，关于DEB-TACE和c-TACE不同栓塞模式如何差异化地调控CD4⁺ T淋巴细胞向Th17分化，以及这一过程是否与DEB-TACE较优的临床疗效有关，目前国内外尚缺乏有关报道。在TACE治疗中，药物微球的释放和栓塞作用不仅直接影响肿瘤血流和药物浓度，也可能通过改变免疫微环境中的免疫细胞浸润及功能状态，进而影响疗效^［14］。本研究通过高通量测序技术，比较DEB-TACE与c-TACE治疗中晚期HCC后基因表达模式及免疫微环境的变化。在筛选差异基因时发现，DEB-TACE术后肿瘤组织中肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域蛋白（tumor necrosis factor receptor associated death domain protein，TRADD）基 因 表 达 显 著 上 调。TRADD作为肿瘤坏死因子受体1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）信号通路的关键蛋白，主要调控细胞凋亡和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路^［15］，但近年来研究^［16］提示：TRADD可能具有经典通路之外的免疫调节作用，包括影响T淋巴细胞的活化和分化。因此，本研究重点关注TRADD是否通过非经典途径，如Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信号转导与转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信号通路介导CD4⁺T淋巴细胞向Th17细胞分化，以此作为切入点揭示DEB-TACE疗效优于c-TACE的新机制，为进一步阐明DEB-TACE的疗效优势提供实验依据，并为HCC的个体化治疗方案提供理论支持。

1 资料与方法

1.1　临床样本和分组

本研究回顾性分析了2016年9月—2021年7月本院介入放射科收治的HCC患者资料。参照中华人民共和国国家卫生健康委员会发布的《原发性肝癌诊疗规范（2019年版）》^［17］进行诊断。诊断标准：①具有乙型肝炎-丙型肝炎或各种原因引起的肝硬化背景；②符合典型的HCC影 像 学 特 征： 多 排 螺 旋 计 算 机 断 层 扫 描（computed tomography，CT）或动态增强磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）显示结节在动脉期明显强化，门脉期或延迟期强化减退，即呈“快进快出”表现；③对于影像学表现不典型者，经肝穿刺活检病理证实为HCC。经过严格的纳入与排除标准筛选，并进行倾向性评分匹配（propensity score matching，PSM）以平衡基线特征后，最终纳入56例患者作为研究对象。其中，DEB-TACE组28例，c-TACE组28例。纳入标准：①经病理或影像学诊断为不可切除的中晚期HCC；②肝功能Child-Pugh分级为A或B级；③东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）体力状态（ECOS Performance Status，ECOG PS）评分为0~1分；④靶病灶未接受过手术、消融或TACE治疗。排除标准：①肝功能Child-Pugh C级；②弥漫性肝癌或远处广泛转移，预期生存期<3个月；③存在无法评估疗效的病灶；④临床资料或随访记录不完整。收集DEB-TACE和c-TACE治疗前后（通过穿刺活检或手术获取）的HCC组织样本。测序研究共涉及48例患者，每组12例。采用混合样本策略，将每4例患者的组织标本混合作为一个独立的测序样本单元。因此，最终用于高通量测序分析的样本量为每组3个生物学重复（n=3）。每4例患者标本混合作为一个样本单元。收集治疗后的临床样本用于细胞分选实验。本研究获得新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准（No.211129-04），所有患者均签署知情同意书。

1.2　实验样本、细胞、主要试剂和仪器

HCC组织样本来源于新疆医科大学第一附属医院。通过穿刺活检或手术获取治疗前后的HCC组织样本，并采用流式细胞术分选出样本中的CD4⁺ T淋巴细胞和Th17细胞用于体外实验。RPMI-1640培养基、IMDM培养基、胰蛋白酶和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco公司或苏州依科赛生物科技股份有限公司，GMP级IL-6蛋白和潜伏转化生长因子β3（Latent transforming growth factor-β3， Latent TGF-β3） 蛋 白 购 自 美 国MedChemExpress公司，抗人CD4、CD28和CD3抗体购自英国Abcam公司，CD25抗体购自美国Thermo Fisher公司，TRADD过表达TRADD-OE和TRADD敲低（TRADD-KD）慢病毒载体及其阴性对照（NC）由汉恒生物科技（上海）有限公司合成，总RNA提取试剂盒、HiScript Ⅲ第1链cDNA合成试剂盒和Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix购自南京诺唯赞公司，BCA蛋白含量测定试剂盒和ECL发光液购自苏州新赛美生物科技有限公司，抗TRADD、IL-23A、淋巴细胞特异性蛋白1（lymphocyte specific protein 1，LSP1）、整合素β1（integrin beta 1，ITGB1）和α-Tubulin抗体 购 自 英 国 Abcam 公 司 ，磷 酸 化 JAK（phosphorylated-JAK， p-JAK）、磷 酸 化 STAT（phosphorylated-STAT，p-STAT）及芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AHR）购自美国Cell Signaling Technology公司，RAR相关孤儿受体γt（RAR-related orphan receptor gamma t， RORγt） 抗体购自北京博奥森公司，人IL-17酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒和噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium，MTT）细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自上海碧云天公司。CFX96实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）仪和Western blotting系统购自美国Bio-Rad公司，EVOS M5000型荧光显微镜和Attune NxT流式细胞仪购自美国Thermo Fisher公司，JP-K6000化学发光成像仪购自上海嘉鹏科技有限公司，RT-6000酶标分析仪购自深圳雷杜生命科学股份有限公司，光学显微镜购自上海光学仪器一厂。

1.3　高通量测序和生物信息学分析

采用QIAGEN RNeasy Mini试剂盒，按照试剂盒说明书操作，提取肝癌组织总RNA。RNA提取后，使用NanoDrop 分光光度计检测RNA纯度，以吸光度（A）260/A280比值评估蛋白污染情况。同时使用Agilent 2100 Bioanalyzer检测RNA完整性。仅将RNA纯度和完整性符合测序要求的样本用于后续文库构建。合格RNA样本经mRNA富集或rRNA去除后进行片段化处理，随后进行反转录合成cDNA、末端修复、接头连接、PCR扩增及文库纯化，构建转录组测序文库。采用Illumina HiSeq 2500平台进行高通量测序，获取目的基因表达矩阵。在测序分组与差异表达分析方面，本研究共设立4个测序亚组：DEB-TACE术前组（DF组）、DEB-TACE术后组（DB组）、c-TACE术前组（CF组）和c-TACE术后组（CB组）。每个亚组均包含12例患者组织，采用等量混合策略（每4例患者标本混合为1个独立的测序样本单元），最终每组形成3个生物学重复（n=3）。获得的数据使用R软件DESeq2R包进行差异表达基因（differentially experessed genes，DEGs）分析，计算差异倍数（fold chang，FC） 设定筛选标准为|log₂（FC）|>1且P<0.05。为探究不同治疗模式及其前后的基因表达模式变化，本研究设置了3个具体的差异比较组：C1组（DB组vs DF组，即DEB-TACE术后与术前比较）、C2组（CB组vs CF组，即c-TACE术后与术前比较）和C3组（DB组vs CB组，即DEB-TACE术后与c-TACE术后比较）。在功能富集和免疫浸润分析方面，本研究使用ClusterProfiler R包对筛选出的DEGs进行基因本体论（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路功能富集分析，选取P<0.05的通路进行分析。随后，将差异表达基因与已知的免疫相关基因集取交集，筛选出具有显著差异的免疫相关基因。最后，从已知免疫相关基因集中筛选交集，分析差异表达的免疫相关基因，并使用CIBERSORT算法及其LM22参考矩阵评估22种免疫细胞的相对浸润百分率。运算参数设定：排列检验perm=1 000且启用分位数归一化（QN=TRUE）。最终筛选P<0.05的可靠样本纳入分析，重点评估C1、C2和C3组间关键免疫细胞（CD8⁺T淋巴细胞、M1/M2型巨噬细胞及调节性T淋巴细胞等）的浸润差异，以明确不同TACE方案对肝癌免疫微环境的影响。

1.4　细胞分选和培养

临床样本经单细胞悬液处理或密度梯度离心获取外周血单个核细胞（peripheral blood manonuclear cell，PBMC）。利用BDFACSAriaⅢ分选CD4⁺CD25^－初始T淋巴细胞（纯度>95%）。细胞置于含10%FBS的RPMI-1640培养基中，加入抗CD3/CD28抗体活化。Th17诱导体系：补充IL-6（20 μg·L^-1）、转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）（5 μg·L^-1）、 IL-1β（10 μg·L^-1）、 IL-23（20 μg·L^-1）及中和抗体，37 ℃培养5 d。

1.5　慢病毒载体构建和细胞转染

基于pLVX-IRES-ZsGreen1载体构建TRADD-OE。采用PCR法从HEK293T细胞cDNA中扩增人TRADD基因全长cDNA（GenBank：NM_003789）。本研究构建TRADD-OE和TRADD-KD的T淋巴细胞专用逆转录病毒hTRv-绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）载体。收集活化后的CD4⁺T淋巴细胞，按照感染复数（multiplicity of infection，MOI）=100进行病毒感染，并加入终浓度为6 mg·L^-1聚凝胺（polybrene），1 000 g离心1.5 h后培养。TRADD-KD慢病毒载体构建基于pLKO.1-puro载体。设计3对靶向TRADD的短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）序列：shTRADD-1，5'- CCGGCCTGAGATCTACAAGGATGAACTCGA-GTTCATCCTGTAGATCTCAGGTTTTTG-3'；shTRADD-2，5'-CCGGGCAAGGTTTACACTG-ATCTTACTCGAGTAAGATCAGTGTAAACC-TTGCTTTTTG-3'；shTRADD-3，5'-CCGGCGC-TTCCGAGATGAAGAATATCTCGAGATATT-CTTCATCTCGGAAGCGTTTTTG-3'。

实验分为4组：①对照过表达组（Con-OE组）：转染携带GFP但不含TRADD基因的OE-NC慢病毒空载体，作为TRADD-OE的严格对照，以排除病毒感染及载体负荷的影响；②TRADD-OE组：转染构建好的TRADD-OE慢病毒载体；③对照敲低组（Con-KD组）：转染携带无同源性乱序shRNA序列（5'-CACCGTTCTCCGAACGTGT-CACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGG-AGAATTTTTTG-3'）的KD-NC慢病毒载体，用于排除shRNA系统的脱靶效应及非特异性干扰；④TRADD-KD组：转染特异性靶向TRADD的shRNA慢病毒载体。

在10 cm培养皿中采用Lipofectamine 3000将5 μg表达载体、3.75 μg psPAX2和1.25 μg pMD2.G共转染HEK293T细胞。转染24 h后更换新鲜培养基，转染48和72 h后分别收集病毒上清，0.45 μm滤器过滤，4 ℃短期保存或-80 ℃长期保存。最后将激活的CD4⁺T淋巴细胞（2×10⁶ mL^-1）置于含6 mg·L^-1聚布伦（Polybrene）的病毒悬液中，37 ℃孵育6 h，随后1 000 g离心90 min促进感染，更换新鲜完全培养基继续培养。转染72 h后，通过荧光显微镜和流式细胞术评估转染效率，即GFP阳性率，或通过嘌呤霉素（puromycin）筛选3 d获得稳定转染细胞系。通过Western blotting法和RT-qPCR法验证TRADD mRNA及蛋白表达水平变化。

1.6　JAK抑制剂Ruxolitinib干预实验和样本收集

本研究采用JAK抑制剂Ruxolitinib对转染后的CD4⁺ T淋巴细胞进行干预。Ruxolitinib溶于二甲基 亚 砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 配 制 为10 mmol·L^-1储备液，－20℃避光保存。实验时使用完全培养基将其稀释至终工作浓度1 μmol·L^-1。实验共设置6组：①Con-OE组：CD4⁺ T淋巴细胞转染空载过表达慢病毒载体，不加入Ruxolitinib，仅加入等体积DMSO；②TRADD-OE组：CD4⁺ T淋巴细胞转染TRADD过表达慢病毒载体，不加入Ruxolitinib，仅加入等体积DMSO；③Con-KD组：CD4⁺ T淋巴细胞转染阴性对照shRNA慢病毒载体，不加入Ruxolitinib，仅加入等体积DMSO；④TRADD-KD组：CD4⁺ T淋巴细胞转染TRADD敲低慢病毒载体，不加入Ruxolitinib，仅加入等体积 DMSO； ⑤ Con-OE+JAKinhibitor 组：CD4⁺ T淋巴细胞转染空载过表达慢病毒载体后，加入Ruxolitinib，使其终浓度为1 μmol·L^-1；⑥TRADD-OE+JAKinhibitor组：CD4⁺ T淋巴细胞转染TRADD过表达慢病毒载体后，加入Ruxolitinib，使其终浓度为1 μmol·L^-1。各组细胞均在Th17细胞诱导培养条件下继续培养。处理结束后，收集各组细胞及培养上清，用于后续的流式细胞术、Westernblotting法、RT-qPCR法和ELISA法检测。

1.7　RT-qPCR法检测各组细胞中TRADD、IL-23A、LSP1、ITGB1、AHR和RORγt mRNA表达水平

使用TRIzol试剂提取细胞总RNA，加入氯仿抽提并用异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤后溶于焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水中。使用NanoDrop2000测定RNA浓度和纯度。采用反转录试剂盒合成cDNA，并使用SYBR qPCR Master Mix进行扩增。每个样本设置3个技术重复，使用RT-qPCR仪进行检测。采用2^-△△Ct法计算目的基因mRNA表达水平。引物序列：TRADD F 5'-GC-TGTTTGAGTTGCATCCTAGC-3'，TRADD R 5'-CCGCACTTCAGATTTCGCA-3'；IL-23A F 5'- CTCAGGGACAACAGTCAGTTC-3'，IL-23A R 5'-ACAGGGCTATCAGGGAGCA-3'；LSP1 F 5'- GGAGCACCAGAAATGTCAGCA-3'，LSP1 R 5'- TCGGTCCTGTCGATGAGTTTG-3'；ITGB1 F 5'- CCTACTTCTGCACGATGTGATG-3'，ITGB1 R 5'-CCTTTGCTACGGTTGGTTACATT-3'；AHR F 5'-ACATCACCTACGCCAGTCG-3'，AHR R 5'-CGCTTGGAAGGATTTGACTTGA-3'；RORγt F 5'-GTGGGGACAAGTCGTCTGG-3'， RORγt R 5'-AGTGCTGGCATCGGTTTCG-3'；GAPDH F 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，GAPDH R 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。

1.8　Western blotting法检测各组细胞中TRADD、IL-23A、LSP1、ITGB1、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、AHR和RORγt蛋白表达水平

使用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液提取细胞总蛋白。冰上裂解30 min后，4 ℃、14 000 g离心15 min收集上清。采用BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白样品加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate，SDS）上样缓冲液并煮沸变性。进行SDS（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），分离胶浓度8%~12%，随后恒流转至0.45 μm PVDF膜。使用快速封闭液室温封闭1 h，加入对应的一抗（TRADD、IL-23A、LSP1、ITGB1、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、AHR、RORγt和α-Tubulin，按说明书推荐比例稀释）4 ℃孵育过夜。TBST溶液洗涤后，孵育二抗，最后滴加ECL发光液，使用化学发光成像仪曝光。使用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以α-Tubulin蛋白为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.9　免疫荧光法检测各组细胞中TRADD、IL-23A、LSP1、ITGB1、CD161和CCR6蛋白荧光强度

细胞经4%多聚甲醛固定20 min，0.25%TritonX-100透明10 min，5%山羊血清室温封闭60 min。加入一抗稀释液（1∶200）4 ℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤后，加入相应的AlexaFluor荧光标记二抗室温避光孵育1 h。最后使用DAPI染核5 min并封片。每个实验设置3个生物学重复，每个样本随机选择5个视野。使用Image J软件测量各组细胞中蛋白荧光强度。

1.10　MTT法检测各组细胞增殖活性

将不同处理组的细胞以每孔1×10⁴个细胞的密度接种于96孔细胞培养板，每组设置5个技术重复。培养24、48和72 h后，每孔加入10 μL MTT溶液（终浓度为0.5 g·L^-1）。37 ℃孵育4 h；弃上清，每孔加入100 μL DMSO，使用酶标仪于波长570 nm处测定吸光度（A）值，以A值代表细胞增殖活性。

1.11　ELISA法检测各组细胞上清液中IL-17水平

收集各组细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书操作，检测各组细胞上清液中IL-17水平。

1.12　流式细胞术检测各组细胞中CD161⁺CCR6⁺和IL-17A⁺RORγt⁺ T淋巴细胞百分率

收集各组处理后的细胞，调整细胞数量至每管1×10⁶个。采用PBS缓冲液洗涤2次后，将细胞重悬于100 μL含2% FBS和0.1% 氨化钠（NaN₃）PBS流式染色缓冲液中。加入抗人CD16/CD32抗体（1∶100）于4 ℃孵育15 min以封闭Fc受体。随后加入PE标记的抗人CD161抗体（1∶100）和APC标记的抗人CCR6抗体（1∶50），于4 ℃避光孵育30 min，进行细胞表面抗原标记。采用PBS缓冲液洗涤2次后，使用Foxp3/转录因子固定/破膜缓冲液套装对细胞进行固定及透明处理；随后加入PE-Cy7标记的抗人IL-17A抗体（1∶50）和PerCP-Cy5.5标记的抗人RORγt抗体（1∶50），于4 ℃避光孵育45 min，进行细胞内抗原标记。通透缓冲液洗涤2次后，将细胞重悬于300 μL流式染色缓冲液中。采用Attune NxT流式细胞仪进行检测，每个样本至少收集20 000个活细胞。采用FlowJo软件进行数据分析，计算并输出CD161⁺CCR6⁺和IL-17A⁺ RORγt⁺ T淋巴细胞占亲代CD4⁺T淋巴细胞亚群的百分率。

1.13　统计学分析

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 9.0软件进行数据分析和作图。各组细胞中TRADD、IL-23A、LSP1、ITGB1、AHR和RORγt mRNA 及 蛋 白 表 达 水 平，p-JAK2 和p-STAT3蛋白表达水平，细胞中TRADD、IL-23A、LSP1、ITGB1、CD161和CCR6蛋白荧光强度，细胞增殖活性，细胞上清液中IL-17水平和细胞中CD161⁺CCR6⁺和IL-17A⁺RORγt⁺ T淋巴细胞百分率。符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析和Tukey’s事后检验，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验。计数资料以例数和百分率表示，组间比较采用χ² 检验。等级资料采用Wilcoxon秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　DEB-TACE和c-TACE术后HCC组织中DEGs及免疫细胞浸润丰度

C1组、C2组和C3组组间比较均存在显著的基因表达模式改变。在C1组中，筛选出黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）、程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PDCD1）和锚蛋白重复结构域22（ankyrin repeat domain 22，ANKRD22）等DEGs。见表1。在C3组中，与c-TACE术后组比较，DEB-TACE术后组中SFXN3、TRADD、IL-23A、IL-17RA、CD40、IFT80、ANKRD22、ELMO2、LSP1和ITGB1等免疫相关基因表达水平明显升高（P<0.05，|log₂（FC）|>1）。见表2。2种栓塞治疗对HCC局部的免疫微环境产生了差异化重塑。在C3组中，与CB组比较，DB组中央记忆CD4⁺T淋巴细胞和Th17细胞的浸润丰度呈现极其显著的优势富集。见图1。DB组高表达基因主要富集于中央CD4⁺T淋巴细胞激活及Th17细胞相关信号通路。

2.2　各组患者HCC组织中CD4⁺ T淋巴细胞和Th17细胞百分率

流式细胞术分选获得DEB-TACE和c-TACE治疗后临床样本中的CD4⁺T淋巴细胞和Th17细胞。与c-TACE组（5.90%± 0.19%）比较，DEB-TACE组患者HCC组织中CD4⁺T淋巴细胞百分率（9.17%±2.65%）明显升高（P<0.05）。与c-TACE组（27.77%±0.40%）比较，DEB-TACE组患者HCC组织中Th17细胞百分率（28.83%±1.07%）差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。

2.3　各组细胞中TRADD、IL-23A、LSP1、ITGB1、CD161和CCR6蛋白荧光强度

与c-TACE组比较，DEB-TACE组中CD4⁺T淋巴细胞和Th17细胞中TRADD和IL-23A蛋白荧光强度明显升高（P<0.01），LSP1和ITGB1蛋白荧光强度差异无统计学意义（P>0.05）。见图3和4。与TRADD-OE组比较，TRADD-OE+JAK inhibitor组CD4⁺ T淋巴细胞和Th17细胞中CD161和CCR6蛋白荧光强度明显降低（P<0.01）。见图5和6。

2.4　各组细胞中TRADD、IL-23A、LSP1和ITGB1蛋白表达水平

与c-TACE组比较，DEB-TACE组中CD4⁺T淋巴细胞和Th17细胞中TRADD及IL-23A蛋白表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01），LSP1和ITGB1蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。见图7。

2.5　各组CD4⁺T淋巴细胞和Th17细胞中TRADD、IL-23A、LSP1和ITGB1 mRNA表达水平

与c-TACE组比较，DEB-TACE组CD4⁺ T淋巴细胞和Th17细胞中TRADD和IL-23A mRNA表达水平明显升高（P<0.01），LSP1和ITGB1 mRNA表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.6　各组CD4⁺ T淋巴细胞增殖活性和Th17细胞百分率

与Con-OE组（1.03±0.04）比较，TRADD-OE组CD4⁺T淋巴细胞增殖活性（1.28±0.06）明显升高（P<0.01）。与Con-KD组（1.06±0.02）比较，TRADD-KD组CD4⁺T淋巴细胞增殖活性（0.75±0.05）明显降低（P<0.01）。流式细胞术检测结果显示：与Con-OE组（18.4%±2.1%）比较，TRADD-OE组CD161⁺ CCR6⁺ Th17细胞百分率（32.6%±3.2%）明显升高（P<0.01）。与Con-KD组比较，TRADD-KD组CD161⁺CCR6⁺ Th17细胞百分率（8.7%±1.5%）明显降低（P<0.01）。见图8。与TRADD-OE组（31.8%±3.5%）比较，TRADD-OE+JAK inhibitor组CD161⁺CCR6⁺ Th17细胞百分率（14.6%± 2.2%）明显降低（P<0.01）。见图9。

2.7　各组细胞中p-JAK2、p-STAT3、AHR和RORγt蛋白表达水平

与Con-OE组比较，TRADD-OE组细胞中p-JAK2和p-STAT3蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。与Con-KD组比较，TRADD-KD组细胞中p-JAK2和p-STAT3表达水平明显降低（P<0.01）。与Con-OE组比较，TRADD-OE组细胞中AHR和RORγt蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。与Con-KD组比较，TRADD-KD组细胞中AHR和RORγt蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。见图10和11。与TRADD-OE组比较，TRADD-OE+JAK inhibitor组细胞中AHR和RORγt蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。见图12。

2.8　各组细胞中AHR和RORγt mRNA表达水平

与Con-OE组比较，TRADD-OE组细胞中AHR和RORγt mRNA表达水平明显升高（P<0.01）。与Con-KD组比较，TRADD-KD组细胞中AHR和RORγt mRNA表达水平明显降低（P<0.01）。见表4。与TRADD-OE组比较，TRADD-OE+JAK inhibitor组细胞中AHR和RORγt mRNA表达水平明显降低（P<0.01）。见表5。

2.9　各组细胞上清液中IL-17水平

与Con-OE组（78.5 ng·L^-1±8.6 ng·L^-1）比较，TRADD-OE组细胞上清液中IL-17水平（168.3 ng·L^-1±15.7 ng·L^-1）明显升高（P<0.01）； 与Con-KD组比较，TRADD-KD组细胞上清液中IL-17水平（32.4 ng·L^-1± 5.2 ng·L^-1）明显降低（P<0.01）；与TRADD-OE组（172.6 ng·L^-1±16.3 ng·L^-1）比较，TRADD-OE+JAK inhibitor组细胞上清液中IL-17水平（62.8 ng·L^-1±7.9 ng·L^-1） 明显降低（P<0.01）。

3 讨 论

本研究比较DEB-TACE与c-TACE治疗对HCC患者免疫微环境的影响，并分析TRADD在调控CD4⁺T淋巴细胞分化为Th17细胞过程中的作用及其分子机制。本研究结果显示：相较于c-TACE，DEB-TACE治疗后HCC组织中的免疫相关基因表达谱发生了显著变化，尤其是TRADD和IL-23A在DEB-TACE术后患者的CD4⁺T淋巴细胞和Th17细胞中表达显著上调；且TRADD通过激活JAK/STAT信号通路促进CD4⁺T淋巴细胞向Th17细胞分化，从而可能参与DEB-TACE的抗肿瘤免疫调节过程。

高通量测序分析结果显示：DEB-TACE治疗后，患者HCC组织中与免疫应答相关的基因表达发生显著变化，特别是与c-TACE组比较，DEB-TACE组术后HCC组织中TRADD、IL-23A和CD40等基因表达显著上调。上述基因的改变提示DEB-TACE可能通过更有效的方式激活肿瘤局部的免疫应答通路。IL-23是维持和扩增Th17细胞的关键细胞因子^［18］，其受体IL-17RA也在DEB-TACE后上调，这与后续发现的Th17细胞浸润增加相符。CD40是重要的共刺激分子，其上调可能增强抗原呈递细胞（antigen-presenting cell，APC）的功能，促进T淋巴细胞的活化^［19］。TRADD作为TNFR1信号通路的关键接头蛋白，与细胞凋亡和NF-κB激活相关^［20］。本研究揭示了其在T淋巴细胞分化调控中的新功能。DUAN等^［21］研究显示：载药微球能够在肿瘤局部持续释放化疗药物，同时诱导免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD），促进树突状细胞成熟和T淋巴细胞活化。LANZA等^［22］研究显示：DEB-TACE相较于c-TACE能更有效地调节TME中的免疫细胞组成，提高肿瘤免疫监视功能。

免疫细胞浸润分析进一步证实了DEB-TACE对免疫微环境的重塑作用。DEB-TACE组术后样本中，CD4⁺T淋巴细胞和Th17细胞的浸润丰度显著高于c-TACE组。Th17细胞在肿瘤免疫中扮演着复杂的双重角色^［23-24］。一方面，其可以通过分泌IL-17等细胞因子招募中性粒细胞和巨噬细胞，增强细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）的抗肿瘤活性^［25］；另一方面，持续的炎症反应和IL-17也可能促进血管生成和肿瘤生长^［26］。DEB-TACE诱导的Th17细胞浸润增加，可能放大了这种双重效应。结合DEB-TACE更高的客观应答率（objective response rase，ORR），推测在更持久的药物释放等特定的作用模式下，Th17细胞的抗肿瘤效应可能占据主导地位，或者与其他免疫效应机制协同增强了肿瘤清除能力^［27-28］。提示DEB-TACE可能创造了一个更有利于诱导有效抗肿瘤免疫应答的微环境。

本研究结果显示：TRADD在DEB-TACE诱导的缺氧微环境中并未主要触发经典的细胞凋亡途径，而是通过激活JAK/STAT信号通路促进Th17细胞的分化。这一发现挑战了TRADD仅作为“死亡结构域”接头蛋白的传统认知。深入的机制分析表明：TRADD作为多功能的信号平台，其功能的发挥高度依赖于细胞微环境及共结合蛋白。从结构生物学角度看，TRADD的N端含有1个TRAF2结合结构域，而C端含有死亡结构域（death domain，DD），这种独特的结构使其能够作为一个分子枢纽，根据上游信号动态招募不同的下游效应分子^［29］。在肝脏疾病的复杂病理进程中，TRADD已被证实具有“双重角色”，其不仅能介导细胞死亡，还能通过重塑炎症微环境来决定肝细胞的命运^［30］。DEB-TACE术后造成的高强度代谢应激可能改变了TRADD的构象或其复合物的组装方式，使其偏向于非经典信号转导。研究^［31］显示：TNFR1可被JAK2和c-Src酪氨酸磷酸化，这种磷酸化修饰是触发下游非经典“生存与增殖”信号的关键。提示TNFR1信号复合物与JAK激酶家族存在直接的物理偶联。由于TRADD是TNFR1信号复合物形成所必需的核心适配蛋白，本研究结果显示：高表达的TRADD可能作为关键支架，稳定了TNFR1与JAK2的相互作用，在不依赖经典配体的情况下促进JAK2的磷酸化激活。一旦JAK2/STAT3轴被激活，其下游效应直接指向Th17细胞的特异性转录调控。STAT3的磷酸化入核不仅直接启动Rorc转录，还可能通过与其他核受体（如AHR）的协同作用增强此过程。AHR作为一种环境传感器，在自身免疫性疾病模型中已被证实能通过调节Rorc表达驱动Th17细胞分化并加剧炎症反应^［32-33］。本研究结果显示：AHR与RORγt的同步上调，进一步印证了TRADD/JAK/STAT轴可能通过整合微环境中的代谢信号（AHR配体），最终锁定CD4⁺T淋巴细胞向Th17亚群的分化命运。这种机制可能是机体应对TACE术后急性损伤的一种代偿性免疫反应，同时也为干预HCC术后免疫微环境提供了新的分子靶点。

然而，本研究也存在一定局限性。首先，高通量测序和细胞实验所用的临床样本量相对较小，且测序样本采用了混合策略，可能影响结果的精确性。其次，机制验证主要基于体外实验，未来需要通过动物模型进行体内验证。此外，本研究在机制验证层面主要依赖于临床样本分选的原代CD4⁺T淋巴细胞，未在体外细胞系（Jurkat或Hut-78细胞）中完全复现TACE的处理过程，其原因主要由于TACE治疗的特殊性，其疗效依赖于栓塞引起的缺血缺氧与局部高浓度化疗药物缓释的双重作用^［34］。这种复杂的体内TME涉及异常血管网络、间质流体压力升高及代谢重编程，在常规的体外二维细胞培养体系中难以被精确模拟^［35］。尽管直接采用临床原代细胞能够最真实地反映TACE治疗后的免疫重塑状态，但这在一定程度上限制了对药物作用单一因素的解析。未来的研究若能结合微流控芯片或类器官技术构建模拟TACE缺氧-栓塞微环境的体外模型，将有助于更精细地解析TRADD通路上游的触发机制。

综上所述，本研究通过结合高通量测序和体外实验，证实了DEB-TACE相较于c-TACE能够更显著地改变HCC的肿瘤免疫微环境，表现为TRADD和IL-23A等免疫相关基因的上调及CD4⁺T淋巴细胞和Th17细胞浸润的增加。TRADD通过激活JAK/STAT信号通路，调控AHR和RORγt表达，进而促进CD4⁺T淋巴细胞向Th17细胞分化的关键机制。这一发现不仅为理解DEB-TACE的疗效优势提供了新的分子基础，也提示TRADD/JAK-STAT/Th17轴可能成为未来HCC治疗干预的新靶点，为优化TACE联合免疫治疗策略提供了重要的理论支持。

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基金资助

国家自然科学基金地区科学基金项目(32360189)