PAQR3在肝细胞癌中的表达及其与T淋巴细胞免疫浸润、免疫检查点基因及患者生存期关系的生物信息学分析

Bioinformatic analysis on PAQR3 expression in hepatocellular carcinoma and its correlations with T lymphocyte infiltration, immune checkpoint genes, and patient survival

摘要

目的 探讨孕酮和脂联素受体3（PAQR3）在肝细胞癌（HCC）中的表达及其与免疫浸润和免疫治疗反应及患者生存之间的关联，阐明PAQR3在HCC免疫微环境中的作用及其临床意义。 方法 收集2023年1—12月在天津医科大学总医院行肝切除术的3例HCC患者HCC组织及癌旁组织样本。采用Western blotting法和免疫组织化学染色法检测各例HCC患者HCC组织及癌旁组织中PAQR3蛋白表达情况。收集癌症基因组图谱（TCGA）数据库中接受肝切除术的HCC患者的基因表达和临床数据。采用CIBERSORT和TIMER2.0等多种算法分析PAQR3表达与免疫细胞浸润的相关性；采用Spearman相关性分析评估PAQR3表达水平与免疫检查点基因［程序性细胞死亡蛋白1（PDCD1）、分化抗原274（CD274）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 （CTLA4）］表达水平的相关性，采用Cox比例风险回归模型和Kaplan-Meier法分析PAQR3蛋白表达与患者生存的关系。 结果 Western blotting和免疫组织化学染色法，与癌旁组织比较，HCC组织中PAQR3蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。TCGA数据库分析，与癌旁组织比较，PAQR3基因在HCC组织中表达上调（P<0.05）。相关性分析，PAQR3表达水平与HCC组织中调节性T淋巴细胞（Treqs）（rho=0.349，P<0.001）、CD8⁺T淋巴细胞（rho=0.268，P<0.001）、M2巨噬细胞（rho=0.435，P<0.001）和中性粒细胞（rho=0.399，P<0.001）浸润呈正相关关系。PAQR3蛋白高表达与HCC患者总生存期缩短有关联（P=0.019），而免疫浸润对HCC患者生存无关联（P>0.05）。PAQR3表达与免疫检查点相关基因PDCD1、CD274和CTLA4的表达呈正相关关系（P<0.05）。 结论 PAQR3在HCC组织中表达上调，其表达水平与T淋巴细胞和巨噬细胞等多种免疫细胞浸润程度、免疫检查点基因表达及患者不良预后有关，提示PAQR3可能作为HCC预后的潜在生物标志物。

Abstract

Objective To discuss the expression of progestin and adipoQ receptor 3 （PAQR3） in hepatocellular carcinoma （HCC） and its association with immune infiltration， immunotherapy response， and patient survival， and to clarify its role in the HCC immune microenvironment and its clinical significance. Methods The HCC tissue and adjacent tissue samples were collected from 3 cases of HCC patients who underwent hepatectomy in General Hospital of Tianjin Medical University from January to December 2023. Western blotting method and immunohistochemical staining were used to detect the expression level of PAQR3 protein in HCC tissue and adjacent tissue of each HCC patient. The gene expression and clinical data of HCC patients who underwent hepatectomy were collected from The Cancer Genome Atlas （TCGA） database. Various algorithms such as CIBERSORT and TIMER2.0 were used to analyze the correlation between PAQR3 expression and immune cell infiltration； Spearman correlation analysis was used to evaluate the correlation between PAQR3 expression level and the expression levels of immune checkpoint genes ［programmed cell death protein 1 （PDCD1）， cluster of differentiation 274 （CD274）， and cytotoxic T-lymphocyte‑associated protein 4 （CTLA4）］； Cox proportional hazards regression model and Kaplan-Meier method were used to analyze the relationship between PAQR3 protein expression and patient survival. Results The Western blotting and immunohistochemical staining results showed that compared with adjacent tissue， the expression level of PAQR3 protein in HCC tissue was significantly increased （P<0.05）. The TCGA database analysis results showed that compared with adjacent tissue， the expression of PAQR3 gene in HCC tissue was up‑regulated （P<0.05）. The correlation analysis results showed that PAQR3 expression level was positively correlated with regulatory T cells （Tregs） （rho=0.349， P<0.001）， CD8⁺ T lymphocytes （rho=0.268， P<0.001）， M2 macrophages （rho=0.435， P<0.001）， and neutrophils （rho=0.399， P<0.001） in HCC tissue. High expression of PAQR3 protein was associated with shortened overall survival of HCC patients （P=0.019）， while immune infiltration was not associated with the survival of HCC patients （P>0.05）. The expression of PAQR3 was positively correlated with the expressions of immune checkpoint-related genes PDCD1， CD274， and CTLA4 （P<0.05）. Conclusion The expression of PAQR3 is up-regulated in HCC tissue. Its expression level is associated with the infiltration degree of various immune cells such as T lymphocytes and macrophages， the expression of immune checkpoint genes， and poor prognosis of patients， suggesting that PAQR3 may serve as a potential prognostic biomarker for HCC.

Graphical abstract

关键词

孕酮和脂联素受体3 / 肝细胞癌 / 免疫细胞浸润 / 免疫检查点基因 / 生物信息学分析

Key words

Progestin and adipoQ receptor 3 / Hepatocellular carcinoma / Immune cell infiltration / Immune checkpoint genes / Bioinformatics analysis

孕酮和脂联素受体3（progestin and adipoQ receptor 3，PAQR3）是一种进化保守的膜蛋白，因其在肿瘤发病机制中的潜在作用而受到关注^［1］。尽管PAQR3在细胞增殖过程中的功能已在不同癌症类型中阐明，但其在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中的作用及其在免疫浸润、免疫治疗反应和患者生存方面的意义尚未阐明^［2-3］。因此，分析PAQR3在HCC中的作用及其与肿瘤免疫微环境的相互作用，以识别潜在的预后标志物和治疗靶点意义重大。本研究探讨PAQR3表达与HCC微环境中的免疫浸润、免疫治疗反应和患者生存之间的相关性，利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库的数据，并采用先进的生物信息学和统计学分析，揭示PAQR3表达对HCC患者免疫细胞浸润、免疫治疗结局和总生存期的潜在影响。

1 资料与方法

1.1　样本收集

收集2023年1—12月在天津医科大学总医院行肝切除术的3例HCC患者作为研究对象，所有患者在术前未接受化疗或放疗。收集样本包含3份HCC组织和3份癌旁正常组织（距离HCC组织距离>2 cm）。HCC的诊断经组织病理学确认。手术切除的新鲜组织立即冷冻在-80 ℃中。本研究通过天津医科大学总医院伦理委员会审批，伦理审批号：IRB2025-YX-535-01，所有患者均签署知情同意书。

1.2　主要试剂和仪器

PAQR3抗体（美国Santa Cruz公司），β-actin抗体（福州迈新生物有限公司），二抗和显色试剂盒（北京中杉金桥有限公司），聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（德国Millipore公司），增强化学发光试剂（enhanced chemiluminescence，ECL）（美国Cell Signaling公司）。光学显微镜（德国Leica公司），电泳仪（型号：DYCZ-5D）和电转槽（型号：DYCZ-40A）（北京六一仪器厂），摇床（型号：TS-000A，南通市其林贝尔仪器制造有限公司），凝胶成像仪（型号：GelDoc Go，美国Bio-Rad公司）。

1.3　Western blotting法检测HCC患者HCC和癌旁组织中PAQR3蛋白表达水平

使用RIPA裂解缓冲液裂解HCC患者HCC组织和癌旁组织，4 ℃、12 000 r·min^-1离心20 min，分离上清液中的蛋白。将蛋白样品于12%SDS-PAGE凝胶上电泳分离，随后转移至PVDF膜。采用5%脱脂牛奶封闭非特异性结合位点45 min后，分别于4 ℃下使用鼠抗PAQR3抗体（1∶300）和β-actin抗体（1∶1 000）孵育过夜。含Tween 20的Tris缓冲盐（Tris-buffered saline with Tween 20，TBST）洗膜3次，每次15 min，室温下辣根过氧化物酶（horseradish pero xidase，HRP）偶联的抗鼠二抗（1∶10 000）孵育45 min，TBST溶液洗膜3次，每次15 min。ECL显影，采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.4　免疫组织化学染色法检测HCC患者HCC和癌旁组织中PAQR3蛋白表达情况

HCC组织使用甲醛固定，经梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡，石蜡包埋后常规切片，厚度为4 μm。经烤片后进行二甲苯脱蜡和梯度酒精水化，滴加抗原修复液修复抗原，使用封闭液室温封闭1 h，加入浓度为1∶100的PAQR3抗体稀释液，37 ℃恒温孵育2 h。使用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗并加入二抗稀释液，37 ℃恒温培养箱中孵育1 h。PBS缓冲液冲洗后使用DAB显色，苏木精复染，显微镜下观察。结果采用盲法测定，由2名病理医生独立阅片，对切片进行评分。按染色强度评分：无色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；按阳性细胞百分率评分：1%~25%计1分，26%~50%计2分，51%~75%计3分，76%~100%计4分。染色强度评分与阳性细胞百分率评分的乘积作为免疫反应评分（immunoreactive score，IRS）。

1.5　生物信息学分析

1.5.1　数据来源和处理

从TCGA数据库下载泛癌数据集。该数据集已经过标准化处理，去除了测序深度以及基因长度等混杂因素导致的潜在技术偏差，包含374例HCC组织样本和50例癌旁组织样本。从TCGA数据库中提取PAQR3和免疫检查点相关基因在各个样本中的表达数据和相关预后数据。

1.5.2　免疫细胞浸润分析

为全面评估HCC肿瘤微环境中的免疫细胞浸润状态，本研究综合利用了4种计算方法：①CIBERSORT及其绝对模式CIBERSORT-ASB，采用反卷积算法CIBERSORT，估算22种免疫细胞亚型在样本中的细胞百分率；②TIMER，通过TIMER 2.0工具中的反卷积模块，获取关键免疫细胞（调节性T淋巴细胞和CD8⁺ T淋巴细胞等）的绝对分数，该分数基于线性模型解卷积计算，反映细胞的绝对丰度；③QuantTSeq，使用QuantTSeq反卷积算法，计算多种免疫细胞和基质细胞的绝对分数，该分数基于线性模型解卷积计算；④XCELL，应用基于基因集富集分析的XCELL算法，计算免疫和基质细胞的富集分数，该分数通过评估细胞类型特征基因集的表达富集程度得出；⑤MCPCOUNTER，采用基于免疫特征基因集的富集算法，计算各类免疫细胞的相对浸润评分；⑥EPIC，采用线性回归反卷积算法，计算免疫细胞、肿瘤细胞及其基质细胞的绝对丰度；⑦TIDE，基于免疫特征表达模式，计算肿瘤免疫功能障碍和排斥评分，用于评估肿瘤免疫逃逸状态。

1.5.3　免疫检查点基因相关性分析

结合HCC免疫治疗领域的经典研究及最新综述文献^［4］，筛选出HCC中关键的免疫检查点基因，包括程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PDCD1）、分化抗原274（cluster of differentiation 274，CD274）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA4）。基于TCGA队列的HCC基因表达数据，采用Spearman秩相关分析检验PAQR3表达与上述免疫检查点基因表达水平之间的相关性，并计算相关系数（rho）及统计学P值。

1.6　统计学分析

采用SPSS 29.0软件和R软件（4.2.0）进行统计学分析及生物信息学分析。患者HCC和癌旁组织中PAQR3蛋白表达水平呈正态性分布，以x±s表示，组间比较采用非配对t检验。患者HCC和癌旁组织IRS评分呈非正态分布，以中位数（四分位数）M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。PAQR3表达与免疫细胞浸润水平的相关性采用经肿瘤纯度校正后的Spearman’s rho值和矫正P值进行评估。PAQR3蛋白表达水平和免疫浸润对HCC患者总生存期的影响采用单因素Cox回归分析，通过矫正多变量Cox比例风险回归模型分析患者年龄、性别、种族、肿瘤分期和基因表达等影响因素。使用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并进行Log-Rank检验以评估生存差异。基因相关性分析采用Spearman相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　HCC患者HCC和癌旁组织中PAQR3蛋白表达水平

与癌旁组织比较，HCC患者HCC组织中PAQR3蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。见图1。癌旁组织中PAQR3染色较弱或呈阴性，HCC组织中PAQR3阳性信号明显增强。患者癌旁组织IRS评分中位数为2（1~3）分，与癌旁组织比较，患者HCC组织IRS评分［中位数为8（6~9）分］明显升高（U=0，P<0.05）。见图2。

2.2　 PAQR3基因在不同肿瘤组织中表达情况

使用TCGA数据库进行PAQR3的泛癌分析，结果显示：PAQR3基因在乳腺癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、前列腺癌、直肠腺癌、皮肤恶性黑色素瘤、甲状腺癌和子宫内膜癌中表达明显下调，在胆管癌、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、HCC、肺腺癌和肺鳞癌中表达明显上调。见图3。提示PAQR3基因在不同类型癌组织中的表达存在差异。

2.3　 PAQR3表达与HCC组织中T淋巴细胞免疫浸润相关性

PAQR3表达与多种 T淋巴细胞的浸润程度存在显著相关性（表1）。PAQR3与CD4⁺ Th1细胞浸润呈负相关关系，在XCELL算法中相关系数rho=-0.418（P<0.001）。PAQR3与调节性T淋巴细胞（regulatory T lymphocytes，Tregs）浸润呈 正 相 关 关 系，在 QUANTISEQ 算 法 中 rho=0.349（P<0.001），在 XCELL 算 法 中rho=0.234（P<0.001）；PAQR3 与 CD8⁺ T淋巴细胞（非初始型）浸润呈负相关关系，在XCELL 算法中rho=-0.234（P<0.001）。PAQR3与CD4⁺ 初始T淋巴细胞浸润呈负相关关系，在多种算法中得到一致结果（XCELL：rho=-0.130，P=0.016；CIBERSORT：rho=-0.129，P=0.016；CIBERSORT-ABS： rho=-0.129， P=0.016）；PAQR3与记忆T淋巴细胞浸润呈正相关关系，在 XCELL 算 法 中 rho = 0.265（P<0.001），在 CIBERSORT-ABS 算 法 中 rho=0.128（P=0.018）。

PAQR3表达与多个单核/巨噬细胞相关亚群的浸润水平存在显著相关性（表2）。PAQR3与M2型巨噬细胞浸润呈正相关关系，在CIBERSORT-ABS算法中rho=0.435（P<0.001），在TIDE算法中呈负相关关系（rho=-0.422，P<0.001）。

PAQR3与M1型巨噬细胞浸润呈正相关关系，在CIBERSORT-ABS算法中呈正相关关系（rho=0.339，P<0.001），在EPIC算法中呈负相关关系（rho=-0.327，P<0.001）。PAQR3与总巨噬细胞浸润呈正相关关系，在QUANTISEQ算法中rho=0.345（P<0.001），在TIMER算法中rho=0.264（P<0.001）。PAQR3与单核细胞浸润呈正相关关系，在MCPCOUNTER算法中呈正相关关系（rho=0.320，P<0.001）；在CIBERSORT算法中呈负相关关系（rho=-0.164，P=0.002）。PAQR3与巨噬细胞/单核细胞整体标记（Macrophage/Monocyte）呈正相关关系，在MCPCOUNTER算法中rho=0.320 （P<0.001）。

PAQR3表达与HCC微环境中多种免疫细胞浸润水平存在显著相关性（表3）。PAQR3表达与中性粒细胞浸润呈正相关关系，在MCPCOUNTER、TIMER和QUANTISEQ算法中rho值分别为0.399、0.370和0.342（P<0.001）。PAQR3表达与髓样树突状细胞浸润呈正相关关系，在TIMER和MCPCOUNTER算法中rho值分别为0.261和0.252（P<0.001）。PAQR3表达与B淋巴细胞浸润呈正相关关系，在QUANTISEQ算法中rho=0.262（P<0.001），在EPIC算法中rho=0.135（P=0.012）。PAQR3表达与活化的NK细胞浸润呈正相关关系，在CIBERSORT-ABS算法中rho=0.209（P<0.001）；与NK细胞在MCPCOUNTER算法中rho=0.180（P=0.001）。PAQR3表达与中性粒细胞在CIBERSORT-ABS和CIBERSORT算法中呈正相关关系，rho值分别为0.169 （P=0.002） 和0.135 （P=0.012）。PAQR3表达与浆细胞样树突状细胞浸润呈负相关关系，在XCELL算法中rho=-0.157（P=0.003）。PAQR3表达与巨噬细胞M1和M2亚型在CIBERSORT算法中均呈正相关关系，rho值分别为0.151（P=0.005）和0.145（P=0.007）。

2.4　PAQR3蛋白表达与HCC患者总生存期的关联性分析

高表达的PAQR3蛋白与HCC患者总生存期降低存在关联（P=0.019），见图4。通过Kaplan-Meier生存分析，低PAQR3表达组（底部50%）与高PAQR3表达组（顶部50%）在HCC患者的总生存期上显示出显著差异（Log-Rank P=0.019），高PAQR3表达组患者累积生存率明显低于低PAQR3表达组。提示PAQR3蛋白高表达与HCC患者不良预后有关。

2.5　HCC免疫浸润与HCC患者总生存期的关联性

PAQR3与HCC患者总生存期以及肿瘤免疫浸润之间存在关联性，但HCC免疫浸润与HCC患者总生存期无关联（P>0.05）。见图5。

2.6　 PAQR3表达与免疫检查点基因相关性

PDCD1、CD274和CTLA4均与PAQR3表达呈正相关关系（P<0.05）。见图6。

3 讨 论

HCC是最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，其发病率和死亡率均呈上升趋势，给全球健康带来了沉重负担^［5-6］。尽管对HCC发病机制和治疗方案的研究已取得了一定进展，但晚期HCC患者的预后仍然较差，且有效的治疗手段仍然有限^［7］。随着肿瘤领域研究不断向免疫治疗方向转变，识别免疫相关分子标志物对HCC患者的预后判断和免疫治疗策略的指导越来越受到关注^［8-9］。目前，国内外有研究^［10-11］关注肿瘤免疫微环境在调节肿瘤发生、发展和治疗中的作用。肿瘤免疫微环境由免疫细胞、基质细胞和各种免疫相关分子的复杂相互作用组成^［12］。这一复杂的网络不仅影响肿瘤的发生和发展，而且在免疫逃逸及对免疫治疗的反应中发挥关键作用^［13］。因此，识别新的分子标志物并改变对肿瘤微环境的理解对于推动肝癌精准医学发展具有重要意义。PAQR3是脂联素受体家族的成员之一^［1-2］。研究^［1-3］显示：PAQR3在乳腺癌、胃癌和结直肠癌中可能是潜在的治疗靶点，但目前缺乏对PAQR3在HCC中作用的研究分析。本研究阐明了HCC患者HCC组织中PAQR3表达在免疫浸润、免疫治疗反应和患者生存方面的作用，通过Western blotting和免疫组织化学染色法证实了PAQR3蛋白在HCC组织中表达显著上调。本研究结果显示： PAQR3蛋白表达水平在不同癌症类型中呈现显著变化，并在HCC组织中明显上调，这与LING等^［14］的泛癌分析研究结果一致。LING等^［14］研究显示：PAQR3在神经母细胞瘤、胆管癌、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、HCC、肺腺癌和肺鳞状细胞癌中表达显著上调，而在乳腺癌、肾透明细胞肾癌、肾乳头状细胞癌、前列腺腺癌、直肠腺癌、甲状腺癌和子宫体癌中表达显著下调。但WU等^［15］研究发现：PAQR3在HCC组织中的表达显著下调，其研究结果不一致可能是由于各研究的样本选择标准不同导致。

肿瘤微环境由多种免疫细胞、基质细胞和分泌因子组成，在肿瘤的发生、发展和对治疗的反应中发挥关键作用^［16-17］。免疫细胞浸润肿瘤组织的能力被认为是机体抗肿瘤防御机制的一个重要方面^［18-19］。免疫细胞（T淋巴细胞和巨噬细胞）浸润的增强通常与各种癌症的良好预后相关，这些细胞可以直接攻击和清除肿瘤细胞^［20-21］。研究^［22］发现：免疫细胞浸润还可提高免疫治疗（包括免疫检查点抑制剂）的疗效。本研究结果显示：PAQR3蛋白表达与肿瘤微环境中不同免疫细胞的浸润，包括T淋巴细胞、巨噬细胞和其他各种免疫细胞显著相关，提示PAQR3蛋白表达在调节HCC肿瘤微环境中具有潜在作用，即PAQR3蛋白表达上调可能有助于创造免疫抑制的肿瘤微环境，潜在地促进肿瘤的生长和发展。另一方面，低PAQR3蛋白表达可能对应于免疫激活状态，有利于抗肿瘤免疫反应，可能预示着更好的预后。

本研究结果显示：PAQR3蛋白表达与HCC患者的总体生存期具有显著关联性，但免疫细胞浸润并不直接影响HCC患者的生存。提示PAQR3蛋白可能通过多种免疫细胞浸润的协同作用或潜在的其他途径，如影响肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭等恶性行为，共同影响生存。

免疫检查点阻断治疗作为一种有效的癌症治疗模式备受关注^{［10，23］}。PAQR3与免疫检查点相关基因之间的相关性对于理解HCC的免疫生物学和制定有效的免疫治疗策略具有重要意义。以PDCD1、CD274和CTLA4等分子为代表的免疫检查点在调节免疫应答中发挥着至关重要的作用^［24-25］。在正常情况下，相关检查点分子可防止免疫系统过度激活并维持免疫稳态^［26］。然而，肿瘤细胞可利用这些检查点来逃避免疫破坏，导致癌症进展和预后不良^［27］。本研究结果显示：PAQR3表达与上述免疫检查点基因的表达显著相关。提示PAQR3可能通过与这些免疫检查点通路的相互作用参与HCC免疫应答的调节。高PAQR3表达可能导致相关免疫检查点的表达增强或激活，帮助免疫逃避，而低PAQR3表达可能与更有利的免疫反应有关。提示PAQR3可能在免疫治疗反应中发挥作用，PAQR3可能成为HCC的潜在治疗靶点。

本研究揭示了PAQR3在HCC中的潜在作用，但也存在一些局限性。研究数据源自TCGA数据库，其中样本的选择性偏倚和样本质量未知。尽管PAQR3显示出作为预后标志和治疗靶点的潜力，但仍需要进一步的基础实验以阐明其具体作用机制。

综上所述，PAQR3在HCC组织中表达显著上调，且其表达水平与T淋巴细胞和巨噬细胞等多种免疫细胞浸润程度及免疫检查点基因表达有关，同时PAQR3表达与患者的总生存期显著相关，PAQR3可能作为HCC预后的潜在生物标志物，通过多种免疫细胞浸润的协同作用或潜在的其他途径共同影响生存。

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基金资助

天津市教委科研计划项目(2022KJ196)