基于急性髓系白血病患者骨髓单个核细胞中诊断候选基因筛选鉴定及其对预后影响的生物信息学分析和实验验证

Bioinformatics analysis and experimental validation based on screening and identification of diagnostic candidate genes of bone marrow mononuclear cells of acute myeloid leukemia patients and their impact on prognosis

摘要

目的 探讨急性髓系白血病（AML）患者骨髓单个核细胞中差异表达基因（DEGs）的诊断价值，阐明其临床意义及潜在功能。 方法 从基因表达数据库（GEO）获取GSE9476数据集（26例AML患者和10名健康供者骨髓样本），使用GEO2R在线工具筛选DEGs，计算差异倍数（FC），标准为|log₂ FC|≥2、P≤0.05、adj.P≤0.05。通过DAVID数据库进行基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析，STRING在线工具构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，Cytoscape软件筛选核心、关键及瓶颈基因，韦恩图获得诊断候选基因。利用GEPIA和Kaplan-Meier Plotter在线数据库进行候选基因的表达差异及与患者生存率的显著性检验。采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法验证临床标本初诊非急性早幼粒细胞白血病（APL）型AML患者及健康供者骨髓单个核细胞相关基因mRNA表达水平。通过重组质粒构建、慢病毒包被和感染建立血小板因子4（PF4）和促血小板碱性蛋白（PPBP）过表达的AML细胞模型，细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测各组细胞增殖活性，Western blotting法检测各组细胞中凋亡相关蛋白表达情况。 结果 共筛选出496个DEGs，其中表达上调基因69个，表达下调基因427个。富集分析，DEGs主要参与免疫应答、细胞周期和趋化因子信号通路等。PPI网络分析筛选出10个候选基因，分别为细胞周期蛋白依赖激酶1（CDK1）、CD36分子（CD36）、RUNX家族转录因子1（RUNX1）、T细胞受体复合物的CD3 δ亚基（CD3D）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、细胞周期蛋白B（CCNB1）、β-淀粉样蛋白前体蛋白（APP）、Src家族酪氨酸激酶（FYN）、PPBP和PF4。GEPIA和Kaplan-Meier Plotter在线数据库，与对照组比较，AML组患者骨髓穿刺液中APP、CD36、FYN、RUNX1、PF4和PPBP mRNA表达水平升高（P<0.05），CCNB1、CD3D、CDK1和VEGFA mRNA表达水平降低（P<0.05）；显著性检验，APP、CD36、PF4、PPBP、RUNX1高表达及CD3D、VEGFA低表达与不良预后存在显著性差异（P<0.05）。RT-qPCR法，与对照组比较，AML组患者骨髓穿刺液中PF4和PPBP mRNA表达水平明显升高（P<0.01）。CCK-8法和Western blotting法，与对照组比较，过表达PF4或PPBP后OE-PF4组和OE-PPBP组THP-1细胞增殖活性明显增强（P<0.05），THP-1细胞中B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）蛋白表达水平明显升高（P<0.05），Bcl-2相关X蛋白（Bax）表达水平明显降低（P<0.05）。 结论 筛选出的PPBP和PF4在AML中异常表达，且与患者预后有关联，其可能通过促进细胞增殖和抑制凋亡参与AML进展，具备作为诊断和预后生物标志物的潜力。

Abstract

Objective To discuss the diagnostic value of differentially expressed genes （DEGs） in bone marrow mononuclear cells of the patients with acute myeloid leukemia （AML）， and to clarify their clinical significance and potential functions. Methods The GSE9476 dataset （bone marrow samples from 26 AML patients and 10 healthy donors） was obtained from the Gene Expression Omnibus （GEO） database； GEO2R was used to screen the DEGs the fold change （FC） was calculated， and |log₂ FC|≥2， P≤0.05， and adj.P≤0.05 were the criteria； the DAVID database was used to perform Gene Ontology （GO） functional enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） signaling pathway enrichment analysis； STRING was used to construct a protein-protein interaction（PPI） network； Cytoscape was used to screen core， key， and bottleneck genes； the Venn diagram was used to obtain diagnostic candidate genes by intersection； the GEPIA and Kaplan-Meier Plotter online databases were used to test the expression differences of the candidate genes and their significance with patient survival； real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） was used to validate the related mRNA expression levels in bone marrow mononuclear cells from clinical specimens of newly diagnosed non-acute promyelocytic leukemia （APL） type AML patients and healthy donors； through recombinant plasmid construction， lentiviral packaging and infection， AML cell models overexpressing platelet factor 4 （PF4） and pro-platelet basic protein （PPBP） were established； CCK-8 method was used to detect the proliferation activities of the cells in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of apoptosis-related proteins in the cells in various groups. Results A total of 496 DEGs were screened， including 69 up-regulated genes and 427 down-regulated genes. The enrichment analysis results showed that the DEGs were mainly involved in immune response， cell cycle， and chemokine signaling pathways. The PPI network analysis identified 10 candidate genes， which were cyclin-dependent kinase 1 （CDK1）， CD36 molecule （CD36）， Runt-related transcription factor 1 （RUNX1）， CD3 delta subunit of T-cell receptor complex （CD3D）， vascular endothelial growth factor A （VEGFA）， cyclin B1 （CCNB1）， amyloid beta precursor protein （APP）， Src family tyrosine kinase （FYN）， PPBP， and PF4. The results from GEPIA and Kaplan-Meier Plotter online databases showed that compared with control group， the expression levels of APP， CD36， FYN， RUNX1， PF4， and PPBP mRNA in bone marrow aspirate fluid of the patients in AML group were increased （P<0.05）， while the expression levels of CCNB1， CD3D， CDK1， and VEGFA mRNA were decreased （P<0.05）； high expression of APP， CD36， PF4， PPBP， and RUNX1， as well as low expression of CD3D and VEGFA， were significantly associated with poor prognosis （P<0.05）. The real-time fluorescence quantitative PCR results showed that compared with control group， the expression levels of PF4 and PPBP mRNA in bone marrow aspirate fluid of the patients in AML group were significantly increased （P<0.01）. The CCK-8 assay results showed that compared with control group， after overexpression of PF4 or PPBP， the proliferation activities of THP-1 cells in OE-PF4 group and OE-PPBP group significantly increased （P<0.05）. The Western blotting method results showed that compared with control group， after overexpression of PF4 or PPBP， the expression levels of B-cell lymphoma 2 （Bcl-2） protein in THP-1 cells in OE-PF4 group and OE-PPBP group were significantly increased （P<0.05）， while the expression levels of Bcl-2-associated X protein （Bax） protein were significantly decreased （P<0.05）. Conclusion The screened PPBP and PF4 are abnormally expressed in AML and are correlated with the patient prognosis； they may participate in AML progression by promoting cell proliferation and inhibiting apoptosis， and have the potential to serve as the diagnostic and prognostic biomarkers.

Graphical abstract

关键词

急性髓系白血病 / 差异表达基因 / 诊断候选基因 / 生物标志物 / 生物信息学

Key words

Acute myeloid leukemia / Differentially expressed genes / Diagnostic candidate genes / Biomarkers / Bioinformatics

急性髓性白血病（acute myeloid leukemia，AML）是成人发病率最高的白血病类型，具有高度异质性和临床预后差异大的特点^［1］。尽管目前通过联合化学治疗、靶向治疗和造血干细胞移植等手段，部分患者可获得长期缓解，但仍有约30%的患者对初始治疗无反应或早期复发，总体生存率仍不理想^［2］。

近年来，随着高通量测序技术的发展，多项研究^［3-4］已揭示AML中存在大量基因突变和表达异常，如FMS相关受体酪氨酸激酶3（FMS related receptor tyrosine kinase 3，FLT3）、核磷蛋白1（nucleophosmin 1，NPM1）和CCAAT增强子结合蛋白α（CCAAT enhancer binding protein alpha，CEBPA）等常见突变基因已被纳入AML的分子分型体系。然而，上述已知标志物仍无法完全解释AML的异质性，尤其在不同年龄、遗传背景及微环境背景下，其分子调控网络尚未完全明确。免疫微环境异常、细胞周期调控失调和表观遗传学改变在AML发生发展中扮演关键角色^［5］。因此，系统筛选与AML诊断和预后相关的候选基因，并深入分析其功能机制，对于实现AML的精准分型、预后评估及个体化治疗具有重要意义。生物信息学分析为大规模筛选疾病相关基因提供了高效手段。通过整合基因表达数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）等公共数据库中的表达谱数据，可识别出在AML中稳定差异表达的基因，并结合功能富集分析揭示其参与的生物学过程^［6-7］。然而，大部分筛选结果尚未经过临床样本验证和功能实验确认，其临床转化价值仍有待进一步验证。

本研究通过生物信息学方法筛选AML骨髓单个核细胞中的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），结合多种在线工具（STRING在线工具、DAVID数据库和Cytoscape软件等）进行功能注释和蛋白互作网络分析，筛选出候选诊断基因；进一步利用GEPIA和Kaplan-Meier Plotter等数据库验证其表达与预后相关性；最后利用临床样本采用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法及细胞功能实验初步验证其生物学功能，旨在为AML的分子机制研究提供新的线索，并为临床诊断和预后评估提供潜在生物标志物。

1 资料与方法

1.1　临床骨髓穿刺液样本和数据

本研究中临床骨髓穿刺液样本来源于2025年1-12月福建医科大学附属协和医院血液科，共纳入21例初诊非急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）型AML患者作为AML组，13名健康供者作为对照组。所有患者均参照2016年WHO诊断标准。本研究符合《赫尔辛基宣言》（2013）关于人体实验的规定，并获得福建医科大学伦理审查委员会的批准（福医伦理审字〔2024〕第121号），每位入组的患者均签署知情同意书。对照组标本购自美国Cyagen Biosciences有限公司。患者纳入标准：①年龄18~65岁；②初诊非APL型AML患者；③骨髓原始细胞≥20%；④患者知情同意并签署同意书。排除标准：①并发其他恶性肿瘤；②并发严重心、肝和肾功能不全；③妊娠或哺乳期妇女；④既往有造血干细胞移植史。分离AML患者骨髓单个核细胞备用，AML患者及健康供者的临床资料见表1。

在GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）中根据以下3条标准检索AML芯片数据：①初诊AML临床患者标本，且样本量不少于10例；②样本总量不少于20例；③原始芯片数据。本研究最终选用由STIREWALT等^［8］于2007年10月上传的基于GPL96芯片分析平台（Affymetrix Human Genome U133A Array）的GSE9476数据集，最终数据分析选择该芯片数据中26例AML样本（AML组）和10名正常骨髓样本（HD组）。送检样本为患者骨髓穿刺液。

1.2　细胞、主要试剂和仪器

人单核细胞白血病细胞株（THP-1细胞）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自美国Sigma公司，1%青-链霉素混合液购自北京索莱宝生物科技有限公司，细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司，一抗兔抗β-actin和兔抗B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）购自美国Abcam公司，一抗兔抗促血小板碱性蛋白（pro-platelet basic protein，PPBP）和血小板因子4（platelet factor 4，PF4）单克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG二抗、RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自长沙鼎国生物技术有限公司，BeyoECL Star化学发光试剂盒购自美国Bio-Rad公司，Ficoll外周血淋巴细胞分离液购自美国TBD公司，SYBR Green PCR Master mix购自瑞士Roche公司；所用引物及重组质粒由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成。7500RT-qPCR仪购自美国ABI公司，ChemiDoc Touch 全自动化学发光图像分析仪购自美国Bio-Rad公司，酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司。

1.3　DEGs集的筛选及共表达分析

利用GEO在线生物信息学分析工具GEO2R（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）^［7］分析GSE9476芯片数据中10名健康供者（healthy donor，HD）和26例AML患者骨髓标本数据的DEGs。计算差异倍数（fold change，FC），筛选标准为│log₂（FC）│≥2、P≤0.05、adj.P≤0.05。将筛选得到的DEG提交DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）^［10］，进行基因本体论（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析。富集标准为最小交集数Count≤2和改良版Firher精确检验P值EASE Score≤0.05，其余选择默认值。

1.4　诊断候选基因的筛选

为挖掘DEGs中的诊断候选基因，将筛选得到的DEGs提交STRING在线工具（https：//cn.string-db.org/cgi/input.pl）^［9］，分析DEGs对应编码蛋白之间的相互作用关系，并构 建 可 视 化 网 络 结 构，参 数 设 置：meaning of network edges：confidence，active interaction sources：Textmining、Experiments、Databases，minimum required interaction score：high confidence（0.700），同时选择hide disconnected nodes in the network，其余选择默认值，构建可视化网络。将具有相互作用关系的基因集导入Cytoscape，利用MCODE插件筛选出构成网络稳定结构的核心（Core）基因，参数设置：Degree Cutoff≥3，K-Core≥4，其余选择默认值。利用CentiScape插件筛选关键（hub）基因和瓶颈（bottlenede）基因。将上述3类基因提交韦恩图在线绘制工具，取交集即为诊断候选基因。

1.5　诊断候选基因的在线数据库验证

基于基因表达水平值的交互式分析平台GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/）检索分析待测基因的表达水平。GEPIA在线数据库已处理数据来自癌症基因组图谱计划（The Cancer Genome Atlas Program，TCGA）和基因型-组织表达（The Genotype-Tissue Expression，GTEx）项目的9 736个肿瘤样本和8 587个标准样本的RNA测序表达数据^［11］。利用GEPIA针对前期研究筛选得到的10个AML诊断候选基因进行检索各基因在疾病中表达水平。

Kaplan-Meier Plotter（http：//kmplot.com/analysis/index.php p=background）数据库用于生存分析，其数据来源于GEO、EGA和TCGA数据库，能够评估来自21种肿瘤约30 000个样本中所有基因的表达与患者生存率之间的相关性，从而发现和验证与生存相关的生物标志物^［12］。利用Kaplan-Meier Plotter数据库针对前期研究筛选得到的10个AML诊断候选基因进行检索，分析各基因水平与患者生存率之间的相关性。

1.6　RT-qPCR法检测2组患者穿刺液样本和各组细胞中诊断候选基因mRNA表达水平

利用Ficoll外周血淋巴细胞分离液提取骨髓单个核细胞；提取骨髓单个核细胞中的总RNA，随后逆转录合成cDNA后，采用SYBR Green PCR Master mix进行RT-qPCR法检测。反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s、60 ℃退火30 s，共45个循环。以β-actin作为内参，采用2^-△△Ct法计算目的基因mRNA表达水平。每个检测指标均进行3次独立生物学重复实验。引物序列见表2。

1.7　Western blotting法检测各组细胞中诊断候选基因相关蛋白和凋亡相关蛋白表达水平

提取细胞总蛋白，后经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）电泳、转膜，用脱脂牛奶封闭，孵育一抗，兔源PPBP单克隆抗体（1∶1 000）、兔源PF4单克隆抗体（1∶1 000）、兔源Bax单克隆抗体（1∶1 000）、兔源Bcl-2单克隆抗体（1∶1 000）和鼠源β-actin单克隆抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG二抗（1∶5 000）、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000），室温孵育1 h。ECL曝光显色，化学发光成像系统进行化学发光，保存图像，采用 Image J 软件进行蛋白条带灰度值分析，以β-actin为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。每个检测指标均进行3次独立生物学重复实验。

1.8　重组质粒构建、慢病毒包装和稳转细胞建立

将人PF4基因全长编码区和PPBP基因全长编码区分别克隆至pLJM1-EGFP哺乳动物表达载体。将重组质粒与病毒包装质粒psPAX2和PMD2.G共转染293T细胞，制备慢病毒颗粒。所得病毒颗粒感染AML细胞（THP-1细胞），并使用嘌呤霉素进行稳转细胞的筛选培养建立。使用荧光显微镜观察PPBP和PF4的绿色荧光蛋白（green Fluorescent protein，GFP）表达情况。

1.9　细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8，CCK-8）法检测各组细胞增殖活性

将PF4和PPBP稳转THP-1细胞（作为OE-PF4组和OE-PPBP组）及对照组细胞分别接种于96孔细胞培养板中，每个实验组设置6个平行实验，每孔接种5×10³个细胞，并设置不含细胞的空白对照孔，在培养板的边缘孔加入磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）防止蒸发。分别于培养后24、48和72 h进行检测。向每孔中加入10 μL CCK-8试剂，在5% CO₂培养箱中37 ℃恒温避光孵育1 h，采用酶标仪检测各组细胞在450 nm处的吸光度（A）值，以A值表示细胞增殖活性，并绘制细胞增殖活性变化曲线。每个检测指标均进行3次独立生物学重复实验。

1.10　统计学分析

采用SPSS 26.0和GriphPad Prims 8.0软件进行统计学分析。各组细胞增殖活性和细胞中诊断候选基因mRNA及蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用SNK-q检验，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　DEGs筛选结果

一致流形近似与投影（Uniform Manifold Approximation and Projection，UMAP）图像分析结果显示：2组数据均具有较好的相似性（图1A），箱图中HD组和AML组的箱体均较为紧凑，且须线较短，表明2组内部样本间的表达值变异较小，数据分布较为集中（图1B）。按照筛选条件，共筛选得到496个DEGs，其中表达上调基因69个，表达下调基因427个（图1C）。按照|Log₂（FC）|≥2大小排序，上调表达基因和下调表达基因排名前10位的基因相关信息见表3。

2.2　DEGs集共表达分析

GO功能富集分析结果显示：DEGs主要富集于抗原结合和免疫球蛋白受体结合等分子功能，体液免疫反应和先天免疫反应等生物学过程，T淋巴细胞受体对免疫应答的信号转导和调节B淋巴细胞受体信号转导T淋巴细胞活化等细胞组分（图2）。KEGG信号通路富集分析结果显示：DEGs主要富集于趋化因子信号通路、细胞周期、T淋巴细胞受体信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用和癌症中的转录调控异常等通路（图3）。将DEGs上传至STRING在线工具，设置参数标准筛选后，去除重复及无相互作用孤立的基因，构建了331节点蛋白共计165条关系对的蛋白质相互作用网络（图4）。

2.3　蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction， PPI）网络诊断候选基因筛选

将上述蛋白质相互作用网络导入Cytoscape软件中进行可视化，利用该软件MCODE插件对该网络进行分析，按设置参数标准筛选后，共获得该网络的5个稳定结构的核心基因集（图5），共67个核心基因；利用Cytoscape软件CentiScape插件计算网络及各个节点的拓扑特征，Degree为节点连接的边的总数目，最大值为36，最小值为1，平均值为5.784 0；Betweenness为网络中所有的最短路径中经过该节点的数目比例，最大值为10 893.349 0，最小值为0，平均值为523.990 6，按设置参数标准筛选后，获得35个关键基因和18个瓶颈基因（表4）。同时为核心基因、关键基因和瓶颈基因者对网络至关重要。应用Veen分析最终获得10个对网络至关重要的诊断候选基因（图6），分别为细胞周期蛋白依赖激酶1（cyclin dependent kinase 1，CDK1）、CD36分子（CD36 molecule，CD36）、RUNX家族转录因子1（RUNX family transcription factor 1，RUNX1）、T淋巴细胞受体复合物的CD3 δ亚基（CD3 delta subunit of T-lymphocyte receptor complex， CD3D）、 血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、细胞周期蛋白B（cyclin B1，CCNB1）、β-淀粉样蛋白前体蛋白（amyloid beta precursor protein，APP）、Src家族酪氨酸激酶（Src family tyrosine kinase，FYN）、PPBP和PF4。

2.4　2组受试者骨髓穿刺液样本中诊断候选基因mRNA表达水平

与对照组比较，AML组患者骨髓穿刺液样本中APP、CD36、FYN、RUNX1、PF4和PPBP mRNA表达水平升高（P<0.05），CCNB1、CD3D、CDK1和VEGFA mRNA表达水平降低（P<0.05）。图中红色模块代表AML患者标本，灰色模块代表对照组标本（图7）。

利用Kaplan-Meier Plotter数据集中1 608例AML患者数据分析各差异表达诊断候选基因对AML患者生存期的影响。结果显示：与APP、CD36、PF4、PPBP和RUNX1低表达组比较，APP、CD36、PF4、PPBP和RUNX1高表达组AML患者生存时间明显降低（P<0.05）；与CD3D和VEGFA低表达组比较，CD3D和VEGFA高表达组AML患者生存期明显升高（P<0.05）；CCNB1、CDK1和FYN高表达组与低表达组AML患者生存期比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图8。提示APP、CD36、PF4、PPBP、RUNX1、CD3D和VEGFA可能具有成为AML患者诊断和预后分析的重要生物标志物的潜力。

与对照组比较，AML组患者骨髓穿刺液中PPBP和PF4 mRNA表达水平均明显升高（P<0.01）；APP、CD36、RUNX1和FYN mRNA表达水平升高，但差异无统计学意义（P>0.05）；CCNB1、CDK1、VEGFA和CD3D mRNA表达水平降低， 但差异无统计学意义（P>0.05）。见图9。

2.5　各组细胞中PF4和PPBP mRNA及蛋白表达水平和细胞增殖活性

各组细胞中PF4和PPBP GFP绿色荧光蛋白表达明显（图10）。PPBP mRNA过表达（63.32±2.45）倍，PF4 mRNA过表达（65.73±4.92）倍。与对照组比较，OE-PF4组和OE-PPBP组在48和72 h时细胞增殖活性明显升高（P<0.05）（图11）。过表达PF4或PPBP后，细胞内凋亡相关蛋白表现为Bcl-2表达上调，Bax表达下调，抑制凋亡活性显著（图12）。

3 讨 论

AML的分子异质性和复杂发病机制一直是临床诊疗的挑战。本研究通过整合生物信息学和实验验证，首次系统筛选出CDK1、CD36、RUNX1、CD3D、VEGFA、CCNB1、APP、FYN、PPBP和PF4等10个AML诊断候选基因，并深入揭示了PF4和PPBP在AML恶性进展中的功能。初步基因功能探索实验结果显示PF4和PPBP过表达可显著促进AML细胞增殖并抑制凋亡，提示其可能通过调控细胞存活信号通路参与AML进展。上述研究不仅为AML的分子分型提供了新依据，也为靶向治疗策略的开发奠定了基础。

本研究初步筛选阶段选用GSE9476数据集，因其样本来源一致、平台统一，更适合用于DEGs的初步识别。尽管其样本量有限，但后续本研究通过GEPIA（基于TCGA和GTEx数据库）和Kaplan-Meier Plotter等大样本数据库对候选基因进行独立验证，确保结果的稳健性与泛化能力。从GSE9476数据集筛选出的496个DEGs显著富集于免疫应答调控（T或B淋巴细胞活化、中性粒细胞趋化）和细胞周期通路。这一结果与AML的病理特征高度吻合，免疫微环境失调可促进白血病细胞逃避免疫监视，而细胞周期紊乱则驱动肿瘤细胞异常增殖。PPI网络分析进一步突显了10个核心基因的网络中心性，其中多个基因已被证实与白血病发生有关。在筛选出的10个候选基因中，每个基因都具有独特的生物学意义。RUNX1作为造血系统发育的关键转录因子，其异常表达与多种造血系统恶性肿瘤密切相关^［13］。本研究结果显示：RUNX1在AML患者中高表达且与不良预后有关，进一步支持了其作为AML预后评估标志物的潜力，可能机制是由于RUNX1的异常表达干扰了正常的造血分化程序，导致髓系细胞分化受阻，从而促进白血病的发生。CDK1和CCNB1是细胞周期调控的核心分子，二者形成的复合物在细胞从G₂期向M期转换过程中发挥关键作用^［14］。本研究结果显示：CDK1和CCNB1在AML中低表达，提示AML细胞周期调控具有复杂性。研究^［15］显示：细胞周期检查点的异常可能导致肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性，CDK1和CCNB1在AML中低表达，可能与细胞周期检查点异常和化学治疗耐药有关。CD3D作为T淋巴细胞受体复合物的重要组成部分，其低表达提示AML患者可能存在T淋巴细胞功能缺陷，这与AML免疫微环境的异常密切相关。T淋巴细胞功能受损会削弱机体对白血病细胞的免疫监视和清除能力，促进白血病细胞的逃逸和增殖。研究^［16］发现：APP基因在阿尔茨海默病中异常表达，提示APP可能通过一种跨疾病的共同机制参与细胞的病理生理过程，但其在AML中的具体作用机制仍需进一步探索。VEGFA是血管生成的关键调控因子，本研究中其在AML中低表达，可能是由于AML的独特病理特征所致。尽管VEGFA低表达，但AML骨髓微环境中的血管新生仍然活跃，提示可能存在其他代偿性的血管生成调控机制，需要进一步研究阐明。

本研究结果显示：血小板源性因子PF4和PPBP在AML中异常高表达并有促癌功能。尽管二者被认为参与血栓形成和炎症反应，但其在AML骨髓单个核细胞中特异性高表达，且高表达患者的总生存期明显缩短。细胞功能实验进一步证实：过表达PF4或PPBP可显著促进AML细胞的增殖并抑制凋亡。从分子机制上看，可能由于其具备的趋化因子特性。PF4和PPBP属于CXC家族，可通过激活CXCR2受体下游的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kiase B，AKT）或丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinese，MAPK）信号通路，直接增强白血病细胞的存活能力。PF4和PPBP还可能通过调节骨髓微环境来影响AML的进展^［17］。研究^［18］发现：骨髓微环境中的基质细胞和细胞因子等对白血病细胞的存活和增殖至关重要，PF4和PPBP可能通过改变上述微环境成分，为白血病细胞提供有利的生存条件。

从诊断价值看，筛选出的10个候选基因在GEPIA数据库及独立临床标本中均呈现一致的异常表达模式。其中PF4和PPBP在临床样本中的表达差异最为显著，显示出作为辅助诊断标志物的高特 异 性。在 预 后 层 面，APP、CD36、RUNX1、PF4和PPBP的高表达及CD3D和VEGFA的低表达与患者生存期缩短存在明显关联。上述基因可构成多基因预后评分模型，为AML的风险分层提供更精准的工具。CD3D（T淋巴细胞受体复合物关键组分）的低表达提示AML微环境中T淋巴细胞功能耗竭，与近年关于免疫逃逸机制的研究^［19］结果一致。在临床转化方面，10个候选基因不仅可以作为AML诊断的生物标志物，提高诊断的准确性，还能为预后评估提供更精准的指标。特别是PF4和PPBP，其在临床标本中表达差异显著，有望成为AML诊断和预后判断的潜在指标。

综上所述，本研究筛选出10个诊断候选基因为AML的研究提供了新的切入点，PF4和PPBP作为新型预后标志物的价值及其直接促癌功能为精准诊疗体系的建立提供了实验依据。

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基金资助

福建省科技厅自然科学基金项目(2022J01282)

福建医科大学高层次人才项目(XRCZX2021031)