TPX2沉默通过调节Wnt/β-catenin信号通路对非小细胞肺癌A549细胞免疫逃逸的抑制作用

Inhibitory effect of TPX2 silencing on immune escape in non-small cell lung cancer A549 cells by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway

摘要

目的 探讨非洲爪蟾驱动蛋白样蛋白2靶向蛋白（TPX2）对非小细胞肺癌A549细胞免疫逃逸的影响，并阐明其作用机制。 方法 采用脂质体转染法将TPX2小干扰RNA干扰质粒（si-TPX2）及其阴性对照质粒（si-NC）转染至A549细胞中，分为空白对照组、si-TPX2组和si-NC组。收集A549细胞条件培养基（CM）处理CD8⁺ T淋巴细胞，分为CD8⁺ T组、CD8⁺ T+CM/blank组、CD8⁺ T+CM/si-NC组和CD8⁺ T+CM/si-TPX2组。采用②无翅型MMTV整合位点家族蛋白（Wnt）/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路激活剂CHIR-99021预处理转染后的A549细胞，分为si-NC组、si-TPX2组、si-NC+CHIR-99021组和si-TPX2+CHIR-99021组。采用Transwell小室建立A549细胞与CD8⁺ T淋巴细胞共培养体系，分为A549组、A549si-NC组、A549si-TPX2组、A549/T组、A549si-NC/T组、A549si-TPX2/T组、A549si-NC+CHIR-99021/T组和A549si-TPX2+CHIR-99021/T组。细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测各组细胞存活率，流式细胞术检测各组细胞中人白细胞抗原DR（HLA-DR）、程序性死亡配体1（PD-L1）水平及细胞凋亡率，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组细胞上清液中干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素2（IL）-2、转化生长因子β（TGF-β）和IL-10水平，乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测CD8⁺ T淋巴细胞对各组A549细胞的杀伤作用，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组细胞中TPX2 mRNA表达水平；Western blotting法检测各组细胞中β-catenin蛋白表达水平。 结果 与CD8⁺ T+CM/blank组比较，CD8⁺ T+CM/si-TPX2组CD8⁺ T淋巴细胞存活率、细胞表面分子HLA-DR水平及细胞上清液中IFN-γ、TNF-α和IL-2水平均明显升高（P<0.05）。与A549si-TPX2组比较，A549si-TPX2/T组细胞存活率明显降低（P<0.05）。与A549/T组比较，A549si-TPX2/T组A549细胞存活率明显降低（P<0.05），A549细胞凋亡率和细胞死亡率均明显升高（P<0.05）。与空白组比较，si-TPX2组A549细胞中β-catenin总蛋白和核蛋白表达水平、细胞表面分子PD-L1水平及细胞上清液中TGF-β和IL-10水平均明显降低（P<0.05）。与si-TPX2组比较，si-TPX2+CHIR-99021组A549细胞表面分子PD-L1水平及细胞上清液中TGF-β和IL-10水平均明显升高（P<0.05）。与A549si-TPX2/T组比较，A549si-TPX2+CHIR-99021/T组A549细胞存活率明显升高（P<0.05），细胞凋亡率和细胞死亡率均明显降低（P<0.05）。 结论 TPX2基因沉默可抑制非小细胞肺癌A549细胞免疫逃逸，其机制与阻断Wnt/β-catenin信号通路活化有关。

Abstract

Objective To investigate the effect of targeting protein for targeting protein for xenopus kinesin-like protein 2 （TPX2） on immune escape in the non-small cell lung cancer A549 cells， and to clarify its mechanism. Methods The TPX2 small interfering RNA plasmid （si-TPX2） and its negative control plasmid （si-NC） were transfected into the A549 cells using the liposome transfection method； the cells were divided into blank control group， si-TPX2 group， and si-NC group. The conditioned medium （CM） from A549 cells was collected and used to treat the CD8⁺ T lymphocytes； the cells were divided into CD8⁺ T group， CD8⁺ T+CM/blank group， CD8⁺ T+CM/si-NC group， and CD8⁺ T+CM/si-TPX2 group. The transfected A549 cells were pretreated with the wingless-type MMTV integration site family（Wnt）/β-catenin signaling pathway activator CHIR-99021； the cells were divided into si-NC group， si-TPX2 group， si-NC+CHIR-99021 group， and si-TPX2+CHIR-99021 group. A co-culture system of A549 cells and CD8⁺ T lymphocytes was established using Transwell chambers； the cells were divided into A549 group， A549si-NC group， A549si-TPX2 group， A549/T group， A549si-NC/T group， A549si-TPX2/T group， A549si-NC+CHIR-99021/T group， and A549si-TPX2+CHIR-99021/T group. Cell counting kit-8（CCK-8） method was used to detect the survival rates of the cells in various groups； flow cytometry was used to detect the levels of human leukocyte antigen DR （HLA-DR）， and programmed death-ligand 1 （PD-L1） and apoptotic rate in the cells in various groups； enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） method was used to detect the levels of interferon-γ （IFN-γ）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-2 （IL-2）， transforming growth factor-β （TGF-β）， and IL-10 in supernatant of the cells in various groups； lactate dehydrogenase （LDH） release assay was used to detect the killing effect of CD8⁺ T lymphocytes on A549 cells； real-time fluorescence quantitative PCR（PT-qPCR） method was used to detect the expression levels of TPX2 mRNA in the cells in various groups； Western blotting method was used to detect the expression level of β-catenin protein in the cells in various groups. Results Compared with CD8⁺ T+CM/blank group， the survival rate of CD8⁺ T cells， the level of HLA-DR on cell surface， and the levels of IFN-γ， TNF-α， and IL-2 in the supernatant in CD8⁺ T+CM/si-TPX2 group were significantly increased （P<0.05）. Compared with A549si-TPX2 group， the survival rate of A549 cells in A549si-TPX2/T group was significantly decreased （P<0.05）. Compared with A549/T group， the survival rate of A549 cells in A549si-TPX2/T group was further decreased （P<0.05）， while the apoptotic rate and mortality rate of A549 cells were significantly increased （P<0.05）. Compared with blank group， the expression levels of total and nuclear β-catenin protein， the level of PD-L1 on cell surface， and the levels of TGF-β and IL-10 in the supernatant of A549 cells in si-TPX2 group were significantly decreased （P<0.05）. Compared with si-TPX2 group， the level of PD-L1 on A549 cell surface and the levels of TGF-β and IL-10 in the supernatant in si-TPX2+CHIR-99021 group were significantly increased （P<0.05）. Compared with A549si-TPX2/T group， the survival rate of A549 cells in A549si-TPX2+CHIR-99021/T group was significantly increased （P<0.05）， while the apoptotic rate and mortality rate of A549 cells on A549 cells were significantly decreased （P<0.05）. Conclusion TPX2 gene silencing inhibits immune escape in non-small cell lung cancer A549 cells， and its mechanism is related to blocking the activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

肺肿瘤 / 癌，非小细胞肺 / 免疫逃逸 / Xklp2靶向蛋白 / Wnt/β-catenin信号通路 / 杀伤作用

Key words

Lung neoplasms / Carcinoma， non-small-cell lung / Immune escape / Targeting protein for Xklp2 / Wnt/β-catenin signaling pathway / Killing effect

肺癌的发病率和疾病负担高居所有恶性肿瘤之首，其中以非小细胞肺癌 （non-small cell lung cancer，NSCLC）为主。尽管免疫治疗显著改善了部分NSCLC患者的预后，但仍面临耐药性和免疫逃逸等重大挑战，导致患者应答率低，5年生存率低于20%^［1］，亟需开发更有效的治疗策略。程序性死亡受体1（programmed death receptor 1，PD-1）及其配体程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）是抑制性免疫检查点分子，在肿瘤微环境中PD-L1表达上调可抑制T淋巴细胞活性，促进免疫逃逸^［2］。PD-1/PD-L1轴检查点阻断的免疫疗法可激活CD8⁺ T淋巴细胞免疫杀伤功能^［3］，其在肿瘤内浸润程度与肺腺癌患者良好预后相关^［4-5］。但CD8⁺ T淋巴细胞耗竭可引起PD-1等抑制性受体高表达及细胞毒性因子分泌能力降低，从而介导肿瘤细胞免疫逃逸^［6］和NSCLC患者的抗PD-1治疗耐药^［7］。

近年研究^［8］显示：无翅型MMTV整合位点家族蛋白（wingless-type MMTV integration site family，Wnt）/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路在调控肿瘤免疫微环境中发挥重要作用，其异常激活可介导NSCLC免疫逃逸和免疫治疗耐药。DU等^［9］研究显示：敲低β-catenin可通过下调胶质母细胞瘤细胞中PD-L1表达，进而促进CD8⁺ T淋巴细胞的活化与肿瘤浸润，从而抑制肿瘤生长。因此，靶向调控Wnt/β-catenin信号通路可能为逆转NSCLC免疫抑制提供新策略。Xklp2靶向蛋白（targeting protein for Xklp2，TPX2）作为一种微管相关蛋白，在NSCLC、胰腺癌、肝癌和乳腺癌等恶性肿瘤中高表达，与肿瘤增殖、侵袭及不良预后密切相关^［10-11］。研究^［11］显示：TPX2通过激活下游Wnt/β-catenin信号通路促进NSCLC转移和化疗耐药，且其表达与PD-L1呈正相关关系^［12］。因此，靶向TPX2疗法可能会改善肿瘤免疫抑制，但其是否通过调控Wnt/β-catenin通路影响NSCLC免疫逃逸尚不明确。本研究以人NSCLC A549细胞为研究对象，探讨TPX2基因沉默对A549细胞免疫逃逸的影响，并进一步研究其作用机制是否与调控Wnt/β-catenin信号通路有关，旨在为克服NSCLC免疫治疗耐受提供潜在干预靶点。

1 材料与方法

1.1　细胞、主要试剂和仪器

人NSCLC A549细胞购自美国ATCC公司，人外周血CD8⁺ T淋巴细胞购自上海富衡生物科技有限公司。小干扰TPX2 RNA （small intervention RNA-TPX2， si-TPX2） 干扰质粒及其阴性对照质粒（si-NC）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）高糖培养基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国HyClone公司；1%青-链霉素溶液（双抗）、1%青-链霉素-两性霉素B溶液（三抗）和增强型细胞计数剂盒8（cell counting kit-8，CCK-8）溶液购自武汉普诺赛生命科技有限公司，Lipo8000^TM转 染 试 剂、乳 酸 脱 氢 酶（lactate dehydrogenase，LDH）细胞毒性检测试剂盒和Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，Wnt/β-catenin信号通路激活剂CHIR-99021（纯度：99.46%）购自美国MCE公司，0.4 μm聚碳酸酯膜的Transwell小室购自美国Corning公司，兔抗TPX2单克隆抗体（ab252945）、兔抗β-catenin单克隆抗体（ab305261）、小鼠抗GAPDH单克隆抗体（ab8245）和兔抗组蛋白H3（phospho Ser10）单克隆抗体（ab308373）购自英国Abcam公司，FITC标记的抗人白细胞抗原DR（human leukocyte antigen DR，HLA-DR）抗体和PE标记的抗人PD-L1抗体购自美国BioLegend公司，干扰素γ（interferon-gamma，IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-alpha， TNF-α）、 白细胞介素（interleukin，IL）-2、 转化生长因子β（transforming growth factor-beta，TGF-β）和IL-10酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒购自美国R&D公司，PrimeScript^TM RT Master Mix（Perfect Real Time）和TB Green^® Premix Ex Taq^TM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）购自日本TaKaRa公司。Applied Biosystems^TM 7500 Fast型实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR， RT-qPCR）仪、iBright^TM FL1500型凝胶成像系统、Varioskan LUX型多功能酶标仪和Vios iDx 255型CO₂培养箱购自美国Thermo Fisher Scientific公司，CytoFLEX型流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司。

1.2　细胞培养、转染和条件培养基（conditioned medium，CM）制备

使用含有10% FBS和1%双抗的DMEM高糖培养基贴壁培养A549细胞，使用含有10% FBS和1%三抗的DMEM高糖培养基悬浮培养CD8⁺ T淋巴细胞。培养条件：37 ℃、5% CO₂，当细胞密度>80%时进行1∶2传代。将A549细胞接种至6孔细胞培养板中（每孔2×10⁵个细胞），过夜培养后，使用Lipo8000^TM转染试剂将si-TPX2和si-NC质粒分别转染至A549细胞中，分为si-TPX2组和si-NC组，另设立空白对照组。采用RT-qPCR法和Western blotting法检测转染细胞中TPX2 mRNA和蛋白表达水平。将转染后的A549细胞置于无血清DMEM高糖培养基中培养24 h，收集上清，经0.45 μm滤膜过滤得到CM，分别命名为CM/blank、CM/si-NC和CM/si-TPX2。

1.3　A549细胞与CD8⁺ T淋巴细胞共培养体系建立

将Transwell小室置于24孔细胞培养板中，于上室接种CD8⁺ T淋巴细胞（每孔1×10⁶个细胞），下室接种预先贴壁处理的A549细胞（每孔2×10⁵个细胞）^［13］，共培养24 h用于后续实验。

1.4　实验分组和给药

①为研究TPX2基因对A549细胞免疫逃逸的影响，使用不同CM培养CD8⁺ T淋巴细胞24 h，分为CD8⁺ T+CM/blank组、CD8⁺ T+CM/si-NC组和CD8⁺ T+CM/si-TPX2组，另设不经任何处理的CD8⁺ T淋巴细胞作为CD8⁺ T组。采用Transwell小室建立A549细胞与CD8⁺ T淋巴细胞共培养体系，分为A549/T组、A549si-NC/T组和A549si-TPX2/T组，另设单独培养的A549细胞为A549组，以及已转染si-TPX2、si-NC的A549细胞为A549si-TPX2组和A549si-NC组。②为研究TPX2基因是否通过调控Wnt/β-catenin通路影响A549细胞免疫逃逸，采用10 μmol·L^-1 Wnt/β-catenin通路激活剂CHIR-99021［溶媒：5%DMSO+40% 聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）300+5% Tween-80+50%生理盐水］处理转染后的A549细胞48 h^［14］，分为空白组si-NC组、si-TPX2组、si-NC+CHIR-99021组和si-TPX2+CHIR-99021组。再采用Transwell小室建立A549细胞与CD8⁺ T淋巴细胞共培养体系，分为A549/T组、A549si-NC/T组、A549si-TPX2/T组、A549si-NC+ CHIR-99021/T组和A549si-TPX2+CHIR-99021/T组。

1.5　RT-qPCR法检测各组细胞中TPX2 mRNA 表达水平

收集各组细胞提取总RNA，取1 μg RNA进行反转录反应，RT-qPCR反应体系按试剂盒说明书配制。引物序列：TPX2正向引物5'-AC-CTTGCCCTACTAAGATT-3'，TPX2反向引物5'-AATGTGGCACAGGTTGAGC-3'；β-肌动蛋白（β-actin）正向引物5'-TCACCCACACTGTGCC-CATCTACGA-3'，β-actin反向引物5'-CAGCGG-AACCGCTCATTGCCAATGG-3'。两步法PCR扩增程序：预变性95 ℃、30 s；PCR反应：95 ℃、5 s，60 ℃、20 s，共40个循环；熔解曲线分析：95 ℃、5 s，60 ℃、1 min，每5 ℃采集1次信号；50 ℃冷却30 s。采用2^-△△Ct法计算各组细胞中TPX2 mRNA表达水平。

1.6　Western blotting法检测各组细胞中TPX2

蛋白表达水平　收集各组细胞提取总蛋白和核蛋白。取20 μg总蛋白和核蛋白样品经变性处理，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），以溴酚蓝指示迁移终点。随后将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，用5%脱脂牛奶封闭1 h。膜经含吐温的Tris缓冲盐溶液（Tris-buffered saline with Tween，TBST）洗涤后，分别与TPX2（总蛋白）、β-catenin（总蛋白+核蛋白）、组蛋白H3（Histone H3，核蛋白内参）和GAPDH（总蛋白内参）（稀释比例均为1∶1 000）一抗4 ℃孵育过夜，再与辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的二抗（1∶10 000）室温孵育1 h。增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）法显影后，通过化学发光成像系统捕获信号，采用Image J软件分析目的条带与对应内参条带灰度值，计算细胞中TPX2和β-catenin蛋白表达水平。β-catenin蛋白表达水平=β-catenin（总蛋白）/GAPDH+β-catenin（核蛋白）/Histone H3。

1.7　CCK-8法检测各组细胞存活率

将各组细胞（每孔2×10³个细胞）接种于96孔细胞培养板中，并按分组要求进行培养和处理，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育3 h，采用酶标仪于450 nm波长处检测各孔吸光度（A）值。细胞存活率=（实验孔A值-空白孔A值）/（对照孔A值-空白孔A值）×100%。

1.8　流式细胞术检测各组细胞表面HLA-DR和PD-L1水平及各组细胞凋亡率

收集各组细胞（每管5×10⁵个细胞），CD8⁺ T淋巴细胞加入5 μL FITC荧光标记的抗HLA-DR抗体，A549细胞加入5 μL PE荧光标记的抗PD-L1抗体，轻轻混匀避光孵育30 min，去除细胞聚集体，采用流式细胞仪在488 nm激发光和530 nm发射光处检测各组细胞表面HLA-DR和PD-L1水平。收集各组A549细胞（每管5×10⁵个细胞），用195 μL Annexin Ⅴ-FITC结合液重悬细胞，依次加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液轻轻混匀，25℃避光孵育15 min。检测Annexin Ⅴ- FITC，FL2通道检测PI信号。采用FlowJo软件分析细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.9　ELISA法检测各组细胞上清液中IFN-γ、TNF-α、IL-2、TGF-β和IL-10水平

将各组细胞离心，收集上清液，按照ELISA试剂盒说明书操作，检测CD8⁺ T淋巴细胞上清液中IFN-γ、TNF-α和IL-2水平，以及A549细胞上清液中TGF-β和IL-10水平。

1.10　LDH释放法检测CD8⁺ T淋巴细胞对A549细胞的杀伤作用

收集各组细胞上清液加样于样品孔中，另设置空白孔和总LDH孔，每孔加入100 μL LDH检测工作液，混匀，室温避光孵育20 min，加入20 μL终止液，混匀。于酶标仪450 nm处测定A值，计算细胞死亡率。细胞死亡率=（样品孔A值-空白孔A值）/（LDH孔A值-空白孔A值）×100%。以细胞死亡率代表CD8⁺ T淋巴细胞对A549细胞的杀伤能力。

1.11　统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。各组细胞中TPX2 mRNA表达水平、TPX2和β-catenin蛋白表达水平、细胞存活率、HLA-DR和PD-L1水平、细胞凋亡率、细胞死亡率以及细胞上清液中IFN-γ、TNF-α、IL-2、TGF-β和IL-10水平均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，两组间样本均数比较采用两独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　各组A549细胞中TPX2 mRNA和蛋白表达水平

与空白对照组或si-NC组比较，si-TPX2组A549细胞中TPX2 mRNA和TPX2蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。见图1。

2.2　各组CD8⁺ T淋巴细胞存活率、HLA-DR水平及细胞上清液中IFN-γ、TNF-α和IL-2水平

与CD8⁺ T组比较，CD8⁺ T+CM/blank组CD8⁺ T淋巴细胞存活率、HLA-DR水平及细胞上清液中IFN-γ、TNF-α和IL-2水平均明显升高（P<0.05）。与CD8⁺ T+CM/blank组比较，CD8⁺ T+CM/si-TPX2组CD8+ T淋巴细胞存活率、HLA-DR水平及细胞上清液中IFN-γ、TNF-α和IL-2水平均明显升高（P<0.05），而CD8⁺ T+CM/si-NC组上述指标差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。

2.3　各组A549细胞存活率

与A549组比较，A549si-TPX2组和A549/T组A549细胞存活率明显降低（P<0.05），而A549si-NC组A549细胞存活率差异无统计学意义（P>0.05）。与A549si-TPX2组比较，A549si-TPX2/T组A549细胞存活率明显降低（P<0.05）。见图3。

2.4　各组A549细胞存活率、凋亡率和死亡率

与A549组比较，A549/T组A549细胞存活率明显降低（P<0.05），而A549细胞凋亡率和细胞死亡率均明显升高（P<0.05）。与A549/T组比较，A549si-TPX2/T组A549细胞存活率进一步降低（P<0.05），而A549细胞凋亡率及细胞死亡率均明显升高（P<0.05）；A549si-NC/T组上述指标差异无统计学意义（P>0.05）。见图4。

2.5　各组A549细胞中β-catenin蛋白表达水平和TGF-β、 IL-10 及 PD-L1 水 平

与空白组比较，si-TPX2组A549细胞中β-catenin总蛋白和核蛋白表达水平、细胞表面分子PD-L1水平及细胞上清液中TGF-β和IL-10水平均明显降低（P<0.05），而si-NC组上述指标差异无统计学意义（P>0.05）。见图5。

2.6　各组A549细胞中PD-L1水平及细胞上清液中TGF-β和IL-10水平

与si-NC组比较，si-TPX2组A549细胞表面PD-L1水平及细胞上清液中TGF-β和IL-10水平均明显降低（P<0.05），而si-NC+CHIR-99021组PD-L1水平及细胞上清液中TGF-β和IL-10水平均明显升高（P<0.05）。与si-TPX2组比较，si-TPX2+CHIR-99021组A549细胞表面PD-L1水平及细胞上清液中TGF-β和IL-10水平均明显升高（P<0.05）。见图6。

2.7　各组A549细胞存活率、细胞凋亡率和细胞死亡率

与A549/T组比较，A549si-TPX2/T组A549细胞存活率明显降低（P<0.05），细胞凋亡率及细胞死亡率均明显升高（P<0.05），A549si-NC/T组A549细胞存活率、细胞凋亡率和细胞死亡率差异无统计学意义（P>0.05）。与A549si-NC/T组比较，A549si-NC+CHIR-99021/T组A549细胞存活率明显升高（P<0.05），细胞凋亡率及细胞死亡率明显降低（P<0.05）。与A549si-TPX2/T组比较，A549si-TPX2+CHIR-99021/T组A549细胞存活率明显升高（P<0.05），细胞凋亡率和细胞死亡率均明显降低（P<0.05）。见图7。

3 讨 论

NSCLC的发生发展与机体免疫监视功能失衡密切相关。在生理状态下，免疫系统能够识别并清除恶性转化的细胞，然而，NSCLC细胞可通过多种机制逃避免疫攻击，形成免疫逃逸。例如，肿瘤细胞可分泌免疫抑制因子如TGF-β和IL-10，强烈抑制效应免疫细胞的功能，从而形成免疫抑制性微环境^［15］。此外，细胞表面免疫检查点分子的上调以及多种免疫抑制因子的分泌，已被广泛认为是NSCLC实现免疫逃逸的重要途径^［16-17］。CD8⁺ T淋巴细胞是抗肿瘤免疫的核心效应细胞，其主要通过T淋巴细胞受体识别肿瘤抗原，并在共刺激信号作用下活化、增殖和分化为细胞毒性T淋巴细胞，进而通过释放IFN-γ、TNF-α、IL-2及颗粒酶等效应分子直接杀伤肿瘤细胞^［18-19］。WEN等^［20］研究显示：CD8⁺ T淋巴细胞耗竭引起IFN-γ水平降低，PD-1水平升高，从而促进NSCLC的免疫逃逸和治疗耐药性。导致这一耗竭状态的因素多样，包括持续性抗原刺激、多种抑制性受体的持续表达、表观遗传学改变、转录因子调控、代谢失调以及细胞因子谱的改变^［21］。因此，恢复CD8⁺ T淋巴细胞的细胞毒性功能、逆转其耗竭状态，已成为改善NSCLC免疫治疗响应的潜在策略。

TPX2在NSCLC中高表达，可促进NSCLC转移和恶性进展，与预后不良有关^［22］。ZHU等^［23］研究显示：TPX2在肺腺癌中与免疫抑制因子IL-10呈正相关关系，且TPX2沉默可抑制A549细胞增殖和迁移。目前，关于TPX2在NSCLC中的研究主要集中于恶性生物学行为的调控，然而，该分子在NSCLC免疫逃逸中的作用鲜有报道。本研究通过沉默TPX2基因，发现其可显著增强CD8⁺ T淋巴细胞的毒性功能，表现为CD8⁺ T淋巴细胞表面活化标志物HLA-DR表达上调，细胞存活率升高，且细胞上清液中IFN-γ、TNF-α和IL-2水平明显升高。进一步研究显示：A549细胞进行单独的TPX2基因沉默或与CD8⁺ T淋巴细胞共培养均能显著抑制细胞增殖，但TPX2沉默的A549细胞与CD8⁺ T淋巴细胞共培养时，其增殖活性显著低于单独TPX2沉默的A549细胞。另一方面，与CD8⁺ T淋巴细胞共培养时，TPX2基因沉默可显著抑制A549细胞的增殖并诱导其凋亡，同时提高CD8⁺ T淋巴细胞对A549细胞的杀伤敏感性，从而有效抑制A549细胞的免疫逃逸。该结果与ZHANG等^［24］报道的TPX2在调控胰腺癌中免疫细胞功能及恶性进展中的作用一致。提示TPX2基因沉默与CD8⁺ T淋巴细胞共培养在抑制A549细胞增殖上表现出显著的协同作用。尽管单独TPX2沉默能一定程度抑制细胞活力，但其主要效应在于显著增强CD8⁺ T淋巴细胞对A549细胞的杀伤功能，从而发挥更强的抗增殖作用。

在机制层面，本研究证实TPX2基因沉默可下调A549细胞内β-catenin的蛋白表达水平。Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤发生发展及免疫调节中具有多重生物学功能。DING等^［25］研究表明：TPX2沉默可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路诱导人肝癌细胞凋亡。WANG等^［26］研究显示：脂肪非典型钙粘蛋白4（FAT atypical cadherin 4，FAT4）过表达通过β-catenin依赖性机制诱导PD-L1发生异常糖基化并促进其降解，从而在宫颈癌免疫活性小鼠模型中显著增强细胞毒性T淋巴细胞的抗肿瘤免疫活性。此外，研究^［27］已证实Wnt/β-catenin信号通路异常激活与免疫逃逸和免疫检查点抑制剂耐药显著相关，该现象在膀胱癌^［28］、腺样囊性癌^［29］和NSCLC^［30］等肿瘤中均有报道。本研究结果显示：TPX2基因沉默导致A549细胞上清液中TGF-β和IL-10分泌减少，同时细胞表面分子PD-L1表达下调；而使用CHIR-99021激活Wnt/β-catenin信号通路后，可逆转TPX2基因沉默对免疫抑制因子释放、PD-L1表达及免疫逃逸的抑制效应；表明TPX2基因可能通过正向调控Wnt/β-catenin通路促进NSCLC的免疫逃逸。

由于本研究采用的共培养体系为Transwell非接触式，A549细胞与CD8⁺ T淋巴细胞被物理隔开，二者无法直接接触，因此A549细胞表面PD-L1与CD8⁺ T淋巴细胞表面PD-1之间可能难以发生直接相互作用，从而削弱了该信号轴在介导免疫逃逸中的主导作用。PEURA等^［30］研究显示：免疫抑制因子TGF-β和IL-10上调可引起CD8⁺ T淋巴细胞耗竭。XIONG等^［31］研究在宫颈癌细胞与CD8⁺ T淋巴细胞的共培养模型中也发现：YTHDF1过表达可通过促进TGF-β和IL-10分泌，显著抑制CD8⁺ T淋巴细胞的杀伤活性，且该效应并不依赖于PD-L1信号。结合上述研究与本研究结果，推测在TPX2基因调控A549细胞免疫逃逸的过程中，更倾向于促进TGF-β和IL-10等免疫抑制因子的分泌，进而导致CD8⁺ T淋巴细胞耗竭；而PD-L1/PD-1通路在本实验条件下可能仅起次要作用，其作用程度低于可溶性免疫抑制因子。

综上所述，TPX2基因沉默通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，进而抑制免疫抑制因子分泌及降低PD-L1表达，导致CD8⁺ T淋巴细胞对A549细胞杀伤活性增强，达到抑制免疫逃逸的作用。本研究不仅明确了TPX2在NSCLC免疫逃逸中的功能，还阐明了Wnt/β-catenin通路在其间的关键介导作用，为深入解析NSCLC免疫微环境调控提供了新视角。然而，本研究仍存在一定局限，未来需进一步探讨TPX2调控Wnt/β-catenin信号通路的具体分子机制，以及在体内环境下该机制对肿瘤免疫逃逸的影响，为NSCLC的免疫治疗提供更坚实的理论基础和潜在靶点。

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