温肾通络止痛方抑制巨噬细胞衰老改善BMSC成骨分化和老年性骨质疏松模型小鼠骨丢失的研究

摘要

目的 探讨温肾通络止痛方调控巨噬细胞衰老对老年性骨质疏松症（Senile osteoporosis, SOP）的干预作用。方法 利用过氧化氢制备衰老巨噬细胞模型并随机分为对照组、模型组、含药血清低剂量组、含药血清高剂量组。β-半乳糖苷酶染色以及qPCR、Western blot检测衰老指标p21和p53的mRNA及蛋白表达水平，探讨含药血清对巨噬细胞衰老的影响。使用活性氧（Reactive oxygen species, ROS）染色和线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）检测巨噬细胞线粒体功能。qPCR检测巨噬细胞极化相关分子白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）、白细胞介素-10（Interleukin-10,IL-10）、CD206、一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase, iNOS）的mRNA水平，免疫荧光检测巨噬细胞极化相关分子精氨酸酶（Arginase, ARG1）和iNOS的蛋白表达，评估含药血清对巨噬细胞极化的影响。qPCR检测成骨相关指标骨钙蛋白（Osteocalcin, OCN）、Ⅰ型胶原蛋白（Collagen typeⅠα 1,Col1a1）、Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2,Runx2）的mRNA水平以及ALP染色和茜素红染色，评估含药血清处理的巨噬细胞条件培养基对骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC）成骨分化的影响。将C57BL/6J小鼠随机分为对照组、模型组、温肾通络止痛方低剂量组、温肾通络止痛方高剂量组，D-半乳糖制备SOP小鼠模型。Micro-CT分析小鼠股骨微结构，HE染色检测小鼠股骨病理变化，Western blot检测小鼠胫骨衰老相关分子p21、p53和成骨相关指标OCN、Runx2蛋白表达水平，qPCR检测小鼠胫骨衰老相关分子p21、p53 mRNA和巨噬细胞极化相关分子IL-6、iNOS、CD206、IL-10 mRNA的表达水平，评估温肾通络止痛方对小鼠SOP模型的影响。结果 与模型组相比，温肾通络止痛方含药血清干预后，衰老阳性细胞数量明显减少，p21和p53 mRNA和蛋白表达均显著降低（P<0.05,P<0.01,P<0.001）。此外，含药血清可显著抑制H₂O₂诱导的巨噬细胞ROS的产生（P<0.05,P<0.001）、线粒体膜电位下降（P<0.05）。含药血清处理后，巨噬细胞M1相关基因iNOS的mRNA表达下调（P<0.01）,M2相关基因CD163和CD206 mRNA表达上调（P<0.05）,iNOS荧光强度显著降低（P<0.01）,ARG1的荧光强度显著增加（P<0.05）。含药血清处理的巨噬细胞条件培养基可增加ALP阳性细胞数（P<0.01,P<0.001）、茜素红阳性面积（P<0.05）,以及升高成骨相关基因Runx2、Col1a1和OCN mRNA表达（P<0.05,P<0.01）。Micro-CT结果显示，与模型组相比，温肾通络止痛方组小鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N显著增加（P<0.05,P<0.01,P<0.001）,Tb.Sp显著降低（P<0.05,P<0.01）;HE结果显示，骨小梁明显改善，数量增多变宽。此外，温肾通络止痛方可显著抑制D-半乳糖诱导的小鼠胫骨衰老相关基因p21和p53 mRNA和蛋白上调（P<0.05,P<0.001,P<0.000 1）,促进成骨相关指标OCN、Runx2蛋白表达（P<0.01,P<0.000 1）,促进M1相关基因IL-6和iNOS下调（P<0.05）,同时可促进M2相关基因IL-10和CD206表达（P<0.05,P<0.01）。结论 温肾通络止痛方可能通过抑制巨噬细胞衰老，促进BMSC成骨分化，从而发挥抗骨质疏松效应。

关键词

老年性骨质疏松 / 温肾通络止痛方 / 巨噬细胞 / 骨髓间充质干细胞 / 衰老