基于miR-665/DRAM1信号介导的自噬探讨补阳还五汤延缓血管衰老的作用

摘要

目的 研究补阳还五汤对血管衰老的延缓作用，探讨其机制是否与microRNA-665（miR-665）/DNA损伤调节自噬调控因子1（DNA damage-regulated autophagy modulator 1,DRAM1）信号介导的自噬有关。方法 将自然衰老雄性SD大鼠随机分为衰老组，补阳还五汤低、中、高(9.25、18.5、37.0 g·kg^-1)剂量组和白藜芦醇组(80 mg·kg^-1),同时设立年轻组。分离胸主动脉，ELISA法测定血管组织衰老相关β-半乳糖苷酶（Senescence associated β-galactosidase, SA-β-Gal）活性和晚期糖基化终末产物（Advanced glycation end products, AGEs）水平；HE、Masson和EVG染色观察血管组织形态结构；qPCR检测血管组织miR-665表达；生物信息学分析和双荧光素酶报告基因实验验证miR-665与DRAM1靶向关系；透射电镜观察血管内自噬小体；Western blot法检测血管组织p16、DRAM1蛋白及自噬相关蛋白LC3、Beclin1和p62的表达；免疫组织化学法检测血管组织DRAM1的蛋白表达。结果 与年轻组相比，衰老组大鼠血管中SA-β-Gal活性、AGEs水平和p16蛋白表达增加（P<0.01）;血管组织排列紊乱，中膜增厚，胶原纤维增加，弹力纤维出现断裂、紊乱；miR-665基因表达上调（P<0.01）;自噬小体数量减少，Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达降低（P<0.01）,p62蛋白表达升高（P<0.01）;DRAM1蛋白表达降低（P<0.01）。与衰老组相比，补阳还五汤和白藜芦醇干预能够降低衰老大鼠血管中SA-β-Gal活性（P<0.01）、AGEs水平和p16蛋白表达（P<0.05,P<0.01）;改善血管形态和弹力纤维结构，降低血管组织胶原纤维含量。高剂量补阳还五汤明显下调miR-665基因表达（P<0.01）,增加血管内自噬小体数量；不同剂量补阳还五汤明显上调Beclin1蛋白表达（P<0.05,P<0.01）,中剂量和高剂量补阳还五汤显著上调LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达（P<0.01）,下调p62蛋白表达（P<0.01）;高剂量补阳还五汤明显上调DRAM1蛋白表达（P<0.05）。生物信息学分析显示，miR-665与DRAM1基因序列存在特异性互补结合位点，双荧光素酶报告实验证实miR-665靶向DRAM1基因并负调控DRAM1蛋白表达。结论 补阳还五汤可能通过靶向抑制miR-665促进DRAM1蛋白表达，进而促进血管自噬，延缓血管衰老。

关键词

补阳还五汤 / miR-665 / DRAM1 / 自噬 / 转录后调控 / 血管衰老