UHPLC-MS/MS-网络药理学联合实验验证探讨通络沐足散改善软骨损伤的作用机制

摘要

目的 分析通络沐足散透皮吸收液的主要成分，研究其治疗膝骨关节炎的作用机制。方法 通过Franz垂直扩散池提取通络沐足散透皮吸收液药，并使用UHPLC-MS/MS对其进行成分分析。利用TCMSP、Swiss Target Prediction及Gene Cards等数据库预测透皮吸收液有效成分防治膝骨关节炎的可能靶点，Cytoscape软件构建“药物-成分-疾病-靶点”可视化网络，通过STRING数据库获取蛋白互作网络，并寻找核心靶点。运用AutoDock及PyMOL对主要有效成分及靶点进行分子对接验证，以及核心基因的基因本体(GO)功能分析与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。提取小鼠原代软骨细胞，利用ELISA、Western blot、qPCR等方法验证网络药理学的预测靶点。结果 共筛选出48种通络沐足散透皮吸收液的有效成分及88个治疗膝骨关节炎的可能靶点。富集分析结果提示其主要涉及凋亡过程、氧化应激等。分子对接提示主要有效成分及靶点均具有良好的结合能力。实验结果表明，通络沐足散透皮吸收液冻干粉可剂量依赖性地减少LPS干预后软骨细胞上清液中炎症因子的浓度(P<0.05,P<0.01)。降低细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、MMP13及p53的蛋白表达，增加CollagenⅡ的蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。同时降低其MMP13及p53的mRNA表达和增加CollagenⅡ的mRNA表达(P<0.05,P<0.01)。此外，其降低了细胞中TUNEL染色荧光强度(P<0.01)。结论 通过UHPLC-MS/MS技术结合网络药理学，初步认识了通络沐足散透皮吸收液的药物主要有效成分及预测了其治疗膝骨关节炎的潜在作用机制。

关键词

通络沐足散 / 膝骨关节炎 / p-PI3K/PI3K / p-AKT/AKT / MMP13 / p53 / Collagen Ⅱ