人参源性囊泡负载栀子苷纳米粒的构建及其体外抗缺血作用研究

摘要

目的 构建一种兼具协同增效、优异生物相容性、经济可行性及高血脑屏障（Blood-brain barrier, BBB）穿透能力的人参源性囊泡（Ginseng-derived extracellular vesicle-like particles, G-EVLPs）负载栀子苷（Geniposide, Gen）的纳米递送系统（GEVLPs/Gen），并系统评价其体外抗脑缺血再灌注损伤作用。方法 采用差速离心联合超滤法从人参中提取G-EVLPs，并通过流式细胞术检测其表面标志物以验证囊泡特性；利用超声破碎法制备G-EVLPs/Gen纳米粒，采用动态光散射仪测定其粒径和电位，高效液相色谱法（HPLC）测定载药量与包封率。建立hCMEC/D3细胞单层Transwell体外BBB模型，评估G-EVLPs/Gen的跨BBB能力；采用氧糖剥夺/复氧（Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R）构建PC12神经元样细胞体外损伤模型，通过MTT法、Calcein-AM/PI双染、线粒体膜电位检测、免疫荧光染色及ELISA等技术，综合评价G-EVLPs/Gen的细胞毒性、抗凋亡、线粒体功能修复及抗炎效应。结果 提取的G-EVLPs高表达外泌体特征性膜蛋白CD9与CD63，证实其成功分离。优化所得G-EVLPs/Gen的最佳质量比2∶1，其载药量为（9.08±0.07）%，包封率为（85.67±0.75）%，平均粒径为（120.26±1.22） nm,Zeta电位为（-9.64±0.35） mV。MTT实验表明，G-EVLPs/Gen在浓度≤24μg·mL^-1时无明显细胞毒性；3μg·mL^-1的G-EVLPs/Gen可显著逆转OGD/R所致的PC12细胞活力下降（P<0.01）。机制研究表明，G-EVLPs/Gen主要通过小窝蛋白介导的内吞及巨胞饮途径被hCMEC/D3细胞摄取，从而高效穿越体外BBB模型。进一步实验证实，G-EVLPs/Gen能显著抑制OGD/R诱导的细胞凋亡，恢复线粒体膜电位并改善能量代谢；同时促进BV2小胶质细胞向抗炎M2表型极化，上调IL-4与IL-10分泌，下调IL-6与TNF-α水平，发挥显著抗神经炎症作用。结论 成功构建了理化性质稳定、载药效率高、BBB穿透能力强的G-EVLPs/Gen纳米递送系统，该系统通过抗神经元凋亡、改善线粒体功能及调控小胶质细胞极化等多靶点机制发挥神经保护作用，为缺血性脑卒中的治疗提供了潜在的新策略。

关键词

栀子苷 / 人参源性囊泡 / 缺血性脑卒中 / 纳米递送系统 / 再灌注损伤 / 血脑屏障

基金资助

国家重大人才工程青年项目; 国家自然科学基金（82374042,82274104）; 中药制药过程控制与智能制造技术国家重点实验室创新项目（NZYSKL240103）; 江苏省优秀青年基金项目（BK20240144）; 大学生创新创业项目（S202510315029,202510315022）