miR - 153 - 3p调控AEG - 1抑制子宫内膜癌细胞上皮间质转化

miR-153-3p regulates AEG-1 to inhibit the epithelial-mesenchymal transformation of endometrial cancer cells

摘要

为探讨miR - 153 - 3p调控星形胶质细胞升高基因1（AEG - 1）对子宫内膜癌细胞上皮间质转化（EMT）的影响，体外培养人子宫内膜癌细胞Ishikawa，分为对照组、mimic NC组（转染mimic NC）、miR - 153 - 3p mimic组（转染miR - 153 - 3p mimic）、pcDNA3.1组（转染miR - 153 - 3p mimic、pcDNA3.1）和pcDNA3.1 - AEG - 1组（转染miR - 153 - 3p mimic、pcDNA3.1 - AEG - 1）.结果显示，上调miR - 153 - 3p表达可显著提高Ishikawa细胞凋亡率、细胞中miR - 153 - 3p水平及Caspase - 3、E - 钙黏蛋白蛋白水平（P < 0.05），降低细胞侵袭数、细胞中AEG - 1 mRNA及AEG - 1、MMP - 9、N - 钙黏蛋白、波形蛋白、纤连蛋白蛋白水平（P < 0.05）；在此基础上，上调AEG - 1表达可显著逆转上调miR - 153 - 3p表达的影响.miR - 153 - 3p与AEG - 1存在靶向关系.综上，miR - 153 - 3p可靶向抑制AEG - 1表达，抑制Ishikawa细胞EMT、侵袭行为，并诱导细胞凋亡.

Abstract

To investigate the effect of miR - 153 - 3p regulating astrocyte elevated gene - 1 （AEG - 1） on the epithelial - mesenchymal transition （EMT） of endometrial cancer cells. Ishikawa human endometrial cancer cells were cultured in vitro and divided into control group， mimic NC group （transfected with mimic NC）， miR - 153 - 3p mimic group （transfected with miR - 153 - 3p mimic）， pcDNA3.1 group （transfected with mimic and pcDNA3.1） and pcDNA3.1 - AEG - 1 group （transfected with miR - 153 - 3p mimic and pcDNA3.1 - AEG - 1）. The increase of miR - 153 - 3p expression significantly increased the apoptotic rate of Ishikawa cells， the level of miR - 153 - 3p and the levels of Caspase - 3 and E - cadherin proteins （P < 0.05）， and decreased the number of cell invasion and the levels of AEG - 1 mRNA and AEG - 1， MMP - 9， N - cadherin， Vimentin and Fibronectin proteins（P < 0.05）. On this basis， the increase of AEG - 1 expression can significantly reverse the effect of the increase of miR - 153 - 3p expression. miR - 153 - 3p and AEG - 1 had a targeting relationship in Ishikawa cells. In conclusion， miR - 153 - 3p can target and inhibit the expression of AEG - 1， inhibit the EMT and invasion behavior of Ishikawa cells， and induce cell apoptosis.

Graphical abstract

关键词

miR - 153 - 3p / 星形胶质细胞升高基因1 / 子宫内膜癌 / 上皮间质转化

Key words

miR - 153 - 3p / astrocyte elevated gene - 1 / endometrial cancer / epithelial - mesenchymal transition

子宫内膜癌是全球最常见的妇科恶性肿瘤之一，仅次于乳腺癌和宫颈癌，起源于子宫内膜，发病率、死亡率近几年来逐年上升，即便是早期阶段的子宫内膜癌患者预后亦可能不乐观，严重威胁女性生命健康^［1］.肿瘤转移是导致子宫内膜癌患者预后不良的主要因素，研究数据显示，子宫内膜癌患者的5年生存率随着肿瘤局部复发及远方转移而逐渐降低^［2］.上皮间质转化（epithelial - mesenchymal transition，EMT）是指在内在或外在因素调控下，具有细胞紧密连接、黏附功能的上皮来源细胞逐渐转变成梭形，进入细胞基质间运动的过程，其发生会大大增强肿瘤细胞的侵袭转移能力^［3-4］.因此，挖掘子宫内膜癌EMT的发病机制，有助于寻找新的治疗靶点.

微小RNA（microRNA，miRNA）是一种非蛋白质编码的内源性小RNA分子，能结合靶基因mRNA的3'非翻译区，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、EMT过程^［5-6］.研究^［7-8］显示，miR - 153 - 3p在胶质瘤、骨肉瘤等肿瘤中低表达，发挥抑癌基因作用，但在子宫内膜癌尚未有研究.星形胶质细胞升高基因1（astrocyte elevated gene - 1，AEG - 1）编码的蛋白又称异黏蛋白（Metadherin，MTDH），在子宫内膜癌等癌症中发挥癌基因作用，且与癌细胞的凋亡、侵袭、EMT过程有关^［9-10］.本文将通过上调miR - 153 - 3p在人子宫内膜癌细胞系Ishikawa中表达，探讨其调控AEG - 1对Ishikawa细胞凋亡、侵袭、EMT过程的影响，以期为临床改善子宫内膜癌患者预后提供新靶点.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 癌组织标本来源

收集2018年9月—2020年6月在邯郸市妇幼保健院实施切除手术的子宫内膜癌患者的子宫内膜癌组织及癌旁子宫内膜组织各32例，每例标本均经过病理学鉴定，并在离体后迅速用液氮速冻、冷冻保存.所有纳入的子宫内膜癌患者术前均未进行放化疗或免疫治疗.所有纳入患者知情同意，且获得邯郸市妇幼保健院医院伦理委员会批准（批准号：HDFY20180907）.

1.1.2 细胞系

人子宫内膜癌细胞系Ishikawa（货号：HTX2325C）购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司，接种于RPMI 1640培养基（培养基中加体积分数10%胎牛血清），放细胞培养箱中37 ℃、体积分数为5%的CO₂常规培养.传代后取对数生长期细胞用于实验研究.

1.1.3 主要试剂与仪器

Lipofectamine 2000购于美国Life公司；mimic NC、miR - 153 - 3p mimic、pcDNA3.1、pcDNA3.1 - AEG - 1及miR - 153 - 3p、AEG - 1、U6、β - actin引物购于广州锐博生物科技有限公司；实时荧光定量（quantitative real - time，qRT） - PCR试剂盒购于美国Promega公司；AnnexinV - FITC/碘化丙啶（PI）凋亡检测试剂盒购自上海弗元生；兔抗AEG - 1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase - 3）、基质金属蛋白酶 - 9（matrix metalloproteinase - 9，MMP - 9）、E - 钙黏蛋白、N - 钙黏蛋白、波形蛋白、纤连蛋白、β - actin及羊抗兔二抗购于英国Abcam；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于江苏凯基；Rotor - Gene^® Q实时荧光定量PCR仪购于美国QIAGEN公司；CytoFLEX流式细胞仪购于美国Beckman coulter公司；GX21显微镜购于日本Olympus；IS2000MM多功能成像系统购自美国KODAK.

1.2 实验方法

1.2.1 细胞分组与转染

将Ishikawa细胞以2 × 10⁵个/孔接种6孔板，分为对照组、mimic NC组、miR - 153 - 3p mimic组、pcDNA3.1组和pcDNA3.1 - AEG - 1组.当细胞密度达80%左右时，使用Lipofectamine 2000试剂，向mimic NC组、miR - 153 - 3p mimic组细胞分别转染mimic NC、miR - 153 - 3p mimic；向pcDNA3.1组细胞转染miR - 153 - 3p mimic和pcDNA3.1；向pcDNA3.1 - AEG - 1组细胞转染miR - 153 - 3p mimic和pcDNA3.1 - AEG - 1；对照组不进行转染.细胞在转染培养基中培养6 h后，更换新鲜培养基培养18 h，qRT - PCR法确定转染效率.

1.2.2 qRT - PCR法检测组织及各组Ishikawa细胞中miR - 153 - 3p、AEG - 1 mRNA表达

子宫内膜癌组织、癌旁子宫内膜组织及转染后的各组Ishikawa细胞用TRIzol试剂抽提总RNA，用cDNA反转录试剂盒对总RNA反转录获得cDNA样本.在实时荧光定量PCR仪上进行qRT - PCR反应测定miR - 153 - 3p和AEG - 1 mRNA表达水平，U6为miR - 153 - 3p内参，β - actin为AEG - 1内参，引物序列见表1.

1.2.3 流式细胞仪检测各组Ishikawa细胞凋亡情况

转染后的各组Ishikawa细胞培养24 h收集，加结合缓冲液重悬为1 × 10⁶ 个/mL，加5 μL AnnexinV - FITC 4 ℃避光孵育0.5 h，加5 μL PI孵育5 min，立刻使用流式细胞仪检测细胞凋亡率.

1.2.4 Transwell法检测各组Ishikawa细胞侵袭情况

Matrigel基质胶用RPMI 1640培养基（无血清）按1∶5混匀，包被Transwell上室，室温放置1 h.转染后的各组Ishikawa细胞用RPMI 1640培养基（无血清）重悬为2 × 10⁵个/mL，按200 μL/孔加于Transwell上室，下室加500 μL RPMI 1640培养基（含血清），培养24 h.除去未侵袭细胞，对侵袭细胞用甲醛固定10 min，然后用结晶紫染色0.5 h，显微镜下取5个视野计数，计算均值（Ishikawa细胞侵袭数）.

1.2.5 蛋白印迹法检测组织中AEG - 1、各组Ishikawa细胞中AEG - 1及凋亡、侵袭、EMT相关蛋白表达

子宫内膜癌组织、癌旁子宫内膜组织、转染后并培养24 h的各组Ishikawa细胞用蛋白裂解液提取总蛋白，蛋白定量并各取30 μg进行SDS-PAGE电泳，转膜后放入质量分数5%脱脂奶粉的TBST中室温下封闭1 h，分别对应加不同的一抗（兔抗AEG - 1、Caspase - 3、MMP - 9、E - 钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白、纤连蛋白、β - actin）4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，加羊抗兔二抗室温孵育1 h，TBST洗膜，显色，拍照，分析条带灰度值.

1.2.6 双荧光素酶报告基因实验验证miR - 153 - 3p与AEG - 1的靶向作用关系

使用TargetScan预测miR - 153 - 3p的潜在靶标，发现miR - 153 - 3p与AEG - 1存在互补配对的序列，并构建含有miR - 153 - 3p假定互补配对位点的野生型（wild - type，WT）及突变型（mutant，MUT）AEG - 1 3'UTR片段，分别与mimic NC、miR - 153 - 3p mimic转染进Ishikawa细胞，48 h后收集细胞，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测Ishikawa细胞中萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性，细胞的荧光素酶相对活性以两者比值表示.

1.3 统计学分析

应用SPSS 24.0软件对所得数据进行统计学分析，数据以（\overline{x}\pm s）表示.两组间比较采用t检验，多组间比较进行单因素方差分析，多组间两两比较进行SNK - q检验，P < 0.05为差异有统计学意义.

2 结果与分析

2.1 子宫内膜癌组织、癌旁子宫内膜组织中miR - 153 - 3p、AEG - 1 mRNA、AEG - 1蛋白表达情况

与癌旁子宫内膜组织相比，子宫内膜癌组织中miR - 153 - 3p水平显著降低（P < 0.05），AEG - 1 mRNA、AEG - 1蛋白表达水平显著升高（P < 0.05）（图1，表2）.

2.2 各组Ishikawa细胞中miR - 153 - 3p、AEG - 1 mRNA、AEG - 1蛋白表达情况

对照组与mimic NC组、miR - 153 - 3p mimic组与pcDNA3.1组的Ishikawa细胞中，miR - 153 - 3p、AEG - 1 mRNA、AEG - 1蛋白水平的差异无统计学意义（P > 0.05）；与mimic NC组相比，miR - 153 - 3p mimic组的Ishikawa细胞中，miR - 153 - 3p水平显著升高（P < 0.05），AEG - 1 mRNA、AEG - 1蛋白水平显著降低（P < 0.05）；与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1 - AEG - 1组的Ishikawa细胞中，miR - 153 - 3p水平变化无统计学意义（P > 0.05），AEG - 1 mRNA、AEG - 1蛋白水平显著升高（P < 0.05）（图2，表3）.

2.3 各组Ishikawa细胞中凋亡、侵袭、EMT相关蛋白表达情况

对照组与mimic NC组、miR - 153 - 3p mimic组与pcDNA3.1组的Ishikawa细胞中，Caspase - 3、MMP - 9、E - 钙黏蛋白、N - 钙黏蛋白、波形蛋白、纤连蛋白蛋白水平的差异无统计学意义（P > 0.05）；与mimic NC组相比，miR - 153 - 3p mimic组的Ishikawa细胞中，Caspase - 3、E-钙黏蛋白蛋白水平显著升高（P < 0.05），MMP - 9、N - 钙黏蛋白、波形蛋白、纤连蛋白蛋白水平显著降低（P < 0.05）；与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1 - AEG - 1组的Ishikawa细胞中，Caspase - 3、E - 钙黏蛋白蛋白水平显著降低（P < 0.05），MMP - 9、N - 钙黏蛋白、波形蛋白、纤连蛋白蛋白水平显著升高（P < 0.05）（图3，表4）.

2.4 各组Ishikawa细胞凋亡情况

在Ishikawa细胞凋亡率方面，对照组（5.26 ± 0.45）%与mimic NC组（5.48 ± 0.49）%、miR - 153 - 3p mimic组（20.42 ± 1.62）%与pcDNA3.1组（20.13 ± 1.57）%之间的差异无统计学意义（P > 0.05）；与mimic NC组相比，miR - 153 - 3p mimic组Ishikawa细胞凋亡率显著升高（P < 0.05）；pcDNA3.1 - AEG - 1组细胞凋亡率为（5.08 ± 0.40）%，与pcDNA3.1组相比显著降低（P < 0.05）（图4）.

2.5 各组Ishikawa细胞侵袭情况

在Ishikawa细胞侵袭方面，对照组（218.56 ± 18.67）与mimic NC组（206.75 ± 20.13）、miR - 153 - 3p mimic组（123.05 ± 13.44）与pcDNA3.1组（133.62 ± 13.86）Ishikawa细胞侵袭数的差异无统计学意义（P > 0.05）；与mimic NC组相比，miR - 153 - 3p mimic组Ishikawa细胞侵袭数显著降低（P < 0.05）；pcDNA3.1 - AEG - 1组侵袭细胞数为（225.90 ± 20.25），与pcDNA3.1组相比显著升高（P < 0.05）（图5）.

2.6 双荧光素酶实验验证miR - 153 - 3p与AEG - 1的靶向关系

TargetScan在线网站预测显示，miR - 153 - 3p与AEG - 1基因存在互补配对位点，可能靶向结合.双荧光素酶实验结果显示，共转染MUT AEG - 1、miR - 153 - 3p mimic的Ishikawa细胞相对荧光素酶活性为（1.00 ± 0.00），与共转染MUT AEG - 1、mimic NC（1.04 ± 0.06）之间差异无统计学意义（t = 1.633，P = 0.134）；共转染WT AEG - 1、miR - 153 - 3p mimic的Ishikawa细胞相对荧光素酶活性为0.52 ± 0.06，与共转染WT AEG - 1、mimic NC（1.00 ± 0.00）相比显著降低（t = 19.596，P = 0.000）（图6）.

3 讨论

miR - 153 - 3p是miRNA家族成员，其抑癌作用已在众多研究得到证实.赵亚培等^［11］研究显示miR - 153 - 3p可靶向KLF7抑制食管癌细胞增殖和转移；崔文洁等^［12］研究发现miR - 153 - 3p上调后可减弱A549细胞的增殖、迁移和侵袭行为；孙容花等^［13］研究表明miR - 153 - 3p在胃癌细胞的迁移、侵袭及细胞周期中发挥抑癌作用；Chang等^［14］研究发现，抑制miR - 153 - 3p表达可通过激活Snail通路促进口腔鳞状细胞癌细胞的EMT过程.本文检测miR - 153 - 3p在子宫内膜癌与癌旁子宫内膜组织中的表达，发现其在子宫内膜癌组织中异常低表达；使用miR - 153 - 3p模拟物上调Ishikawa细胞中miR - 153 - 3p表达，发现Ishikawa细胞凋亡率及Ishikawa细胞中上皮标志物E - 钙黏蛋白、细胞凋亡蛋白Caspase - 3水平显著提高，Ishikawa细胞侵袭数、侵袭蛋白MMP - 9及间充质细胞标志物N - 钙黏蛋白、波形蛋白、纤连蛋白蛋白水平显著降低，表明上调miR - 153 - 3p可抑制Ishikawa细胞的EMT、侵袭能力，并促进细胞凋亡，即在子宫内膜癌中亦发挥抑癌作用.

既往研究^［15-16］显示，AEG - 1在肝癌、肺癌等多种癌症中发挥癌基因作用.Wang等^［17］研究显示，靶向抑制AEG - 1可抑制视网膜母细胞瘤细胞的增殖和侵袭能力.黄仕灵等^［18］研究表明，AEG - 1可通过诱导细胞自噬及EMT促进甲状腺乳头状癌细胞的增殖和转移能力.本文在TargetScan网站上搜索发现，AEG - 1是miR - 153 - 3p的潜在靶基因，二者存在互补配对位点，双荧光素酶实验可验证miR - 153 - 3p、AEG - 1在Ishikawa细胞中的靶向关系.临床实验显示，子宫内膜癌组织中AEG - 1 mRNA、AEG - 1蛋白表达水平较癌旁子宫内膜组织显著升高，表明AEG - 1参与子宫内膜癌发生并可能发挥癌基因作用.上调miR - 153 - 3p表达可显著降低AEG - 1 mRNA、AEG - 1蛋白水平，表明miR - 153 - 3p在Ishikawa细胞中可靶向抑制AEG - 1转录后水平.而在上调miR - 153 - 3p基础上上调AEG - 1表达可显著降低Ishikawa细胞凋亡率及细胞中Caspase - 3、E - 钙黏蛋白蛋白水平（P < 0.05），提高细胞侵袭数及细胞中MMP - 9、N - 钙黏蛋白、波形蛋白、纤连蛋白蛋白水平，表明上调AEG - 1可逆转上调miR - 153 - 3p对Ishikawa细胞EMT、侵袭、凋亡及相关蛋白的影响，即miR - 153 - 3p可能通过靶向抑制AEG - 1转录后水平，发挥在Ishikawa细胞中的作用.

4 结语

通过改变miR - 153 - 3p、AEG - 1在Ishikawa细胞中的表达水平，结果表明miR - 153 - 3p对Ishikawa细胞的EMT、侵袭行为具有抑制作用，对细胞凋亡具有促进作用，其作用机制是通过靶向抑制AEG - 1转录后水平实现的，miR - 153 - 3p有望成为改善子宫内膜癌患者临床预后的新靶点.

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基金资助

河北省卫健委计划项目(20200441)