基于网络药理学研究人参抗辐射损伤的作用机制

The mechanism of ginseng against radiation damage based on network pharmacology

摘要

利用网络药理学与分子对接技术，探究人参抗辐射损伤的活性成分及防护机制.通过TCMSP筛选出人参22个活性成分及对应靶点，结合GeneCards等数据库的辐射损伤靶点，得到51个共同关键靶点.利用Cytoscape构建调控网络，经String数据库构建PPI网络，根据度值筛选关键活性成分4个，包括蛋白激酶B1、半胱天冬氨酸蛋白酶 - 3、白细胞介素 - 1β、前列腺素合成酶2；通过R软件富集分析显示，人参活性成分主要参与肿瘤坏死因子、IL - 17、MAPK和凋亡等信号通路.分子对接显示4个活性成分与靶蛋白结合能力较强.研究初步表明，人参可能通过kaempferol、inermin、beta - sitosterol和fumarine，调节上述通路及Toll样受体、PI3K/AKT等信号通路发挥抗辐射损伤作用.

Abstract

This study explored the active ingredients and protective mechanisms of ginseng against radiation damage using network pharmacology and molecular docking techniques. Through TCMSP， 22 active ingredients of ginseng and their corresponding targets were screened out. Combined with radiation damage targets from databases such as GeneCards， 51 common key targets were obtained. Cytoscape was used to construct a regulatory network， and the String database was used to build a PPI network. According to the degree value， 4 key active ingredients were screened out， including protein kinase B1， Caspase - 3， interleukin - 1β， and prostaglandin synthase 2. Enrichment analysis via R software showed that the active ingredients of ginseng are mainly involved in signaling pathways such as tumor necrosis factor， IL - 17， MAPK， and apoptosis. Molecular docking indicated that the 4 active ingredients have strong binding ability to the target proteins. The study preliminarily showed that ginseng may exert anti - radiation damage effects through kaempferol， inermin， beta - sitosterol， and stigmasterol by regulating the aforementioned pathways as well as signaling pathways such as Toll - like receptors and PI3K/Akt.

Graphical abstract

关键词

人参 / 辐射损伤 / 辐射防护 / 网络药理学 / 分子对接

Key words

ginseng / radiation damage / radiation protection / network pharmacology / molecular docking

辐射损伤可导致机体造血和免疫系统受到抑制或破坏，如干细胞衰竭、细胞间信号传递异常、线粒体功能障碍、免疫功能受损等，并显著增加癌症、白血病、心血管等疾病的发生.其中，辐射诱导的免疫损伤的特征是早期严重损伤，后期恢复周期较长，因此，辐射诱发免疫细胞死亡并损害免疫系统，是目前治疗的难题^［1-3］.辐射防护剂的研发对预防辐射损伤、减少和有效治疗机体短期和长期损伤相关的整体健康风险有重要的意义.

古代医书中鲜有对辐射的记载，因放射医学是现代开展的.近年来，中医学界对放射损伤进行了一系列探索，在病因学、治疗学等方面都取得了一定进展.中医认为射线为一种火热毒邪，造成机体气血两亏，常用补虚和益气解毒的治疗原则.并且中草药以其安全、方便口服、吸收迅速、价格低廉等特点，被认为是辐射防护剂研究的新热点^［4］.人参作为我国传统的药食两用名贵中药，被视为“百草之王”，有着极为显著的临床研究和药用价值.人参具有复杂的化学成分和广泛的生物活性，研究^［5-7］表明，人参中的磷酸多糖和人参三醇皂苷等化合物，在抗氧化、提高机体免疫力方面效果显著，可以用于预防或治疗的辐射防护剂，能够减轻辐射对机体的影响，具有开发和应用的前景.网络药理学通过建立“药物 - 成分 - 疾病 - 靶点”的网络关系并对信号通路进行分析，从而系统预测药物作用的靶点及作用机制.本研究采用网络药理学及分子对接技术探究人参抗辐射损伤的活性成分和潜在的辐射防护作用机制，为人参抗辐射损伤的进一步研究及临床应用提供参考.

1 材料与方法

1.1 人参活性成分、相应靶点筛选

以口服利用度（OB） ≥ 30%和类药性（DL） ≥ 0.18作为筛选条件，在中药系统药理学分析平台（TCMSP，http： //tcmspw.com/tcmsp.php），检索人参活性成分、相应靶点，利用UniProt数据库（http： //www.uniprot.org/）将所得靶点转化为基因Symbol.

1.2 辐射损伤相关靶点获取

以“irradiation damage”“irradiation protection”“radiation damage”“radiation protection”为关键词.通过基因名片数据库（Genecards，http： //www.genecards.org）、在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM，http： //www.omim.org），挖掘辐射损伤的潜在靶点.将所有筛选结果合并去重后得到辐射损伤的相关基因.使用R软件中的“VennDiagram”包对人参靶基因和辐射损伤靶基因取交集得到人参抗辐射损伤的靶基因进行可视化，用于后续研究.

2 方法

2.1 药物 - 活性成分 - 基因靶点 - 疾病网络的构建

将上述获得的人参抗辐射损伤的活性成分以及相关靶点通过Cytoscape 软件构建人参 - 活性成分 - 靶点 - 辐射损伤网络图，初步研究人参抗辐射损伤的药理作用及作用机制.

2.2 蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络构建

为了研究靶点蛋白的相互作用，确定人参作用靶点群，将药物靶点基因上传至在线String 11.5（http： //string - db.org），导入基因表达产物，构建PPI网络互作图.根据度值，筛选关键核心靶点.

2.3 人参 - 辐射损伤靶点功能与通路的富集分析

获得人参抗辐射损伤的靶点后，用R软件（包括“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”等3个packages）进行GO生物过程富集分析和KEGG通路富集分析，并对数据进行可视化.

2.4 分子对接

基于“2.1”的分析结果选取4个人参核心化合物，导入TCMSP数据库中得到化合物分子结构，以mol2的格式导出，通过Chem3D进行转换.根据化合物选取相应高自由度的靶蛋白，通过蛋白结构数据库（PDB）得到3D结构.使用PyMol 2.2对核心蛋白进行去除水分子、盐离子及其小分子.并使用PyMol定义对接盒子的中心，并使对接盒子包裹蛋白活性位点.此外，使用AutoDock Tools将所有处理好后的小分子以及受体蛋白转换为PDBQT格式.利用AutoDock Vina 1.1.2软件进行分子对接，对接时，全局搜索的详尽度设为20，能量为5.最后使用PyMol 2.2对结果进行可视化分析.

3 结果

3.1 人参活性成分及对应靶点的获取

对人参的活性成分进行检索，共得到86个化合物，设置OB ≥ 30%和DL ≥ 0.18为筛选条件，获得22个活性化学成分（见表1）.利用TCMSP数据库得到22个活性成分所对应的潜在靶点蛋白，并在Uniprot数据库中对靶点蛋白进行校正和去重后，共筛选出92个靶点.

3.2 辐射损伤作用靶点及人参活性成分关键靶点筛选

利用Genecards数据库和OMIM数据库检索辐射损伤靶蛋白，整合去重后得到辐射损伤相关蛋白1 440个.将22个活性成分对应的潜在靶蛋白与辐射损伤相关蛋白匹配后取交集，得到51个重复靶点对应22个人参活性成分，表明这些靶点与人参抗辐射损伤密切相关（图1）.

3.3 人参活性成分 - 靶点 - 辐射损伤的网络构建

利用Cytoscapes软件，构建人参活性成分 - 靶点 - 辐射损伤网络图.结果显示，人参通过22个活性成分作用于51个人参 - 辐射损伤共同靶点，这51个蛋白靶点可能与人参抗辐射损伤相关，该网络由75个节点和167条边构成，表明人参抗辐射损伤多成分、多靶点的特征.图中绿色菱形代表辐射损伤，红色四边形代表人参，天蓝色椭圆形代表人参活性成分，黄色长方形代表人参 - 辐射损伤共同靶点（图2）.一般而言，一个网络中只有少数的节点具有较大的degree值，degree值大的节点在网络中具有重要的地位.网络分析结果显示kaempferol、inermin、beta - sitosterol和fumarine的degree值较大，表明为人参抗辐射损伤的重要活性成分.

3.4 PPI网络构建

将51个与人参抗辐射损伤关键靶点导入String数据库中，隐藏1个无相互作用的节点，得到PPI网络（图3）.将PPI网络图导入Cytoscape 3.8.0软件中，结果显示50个蛋白有相互作用.根据Degree值筛选出排名前20的核心靶蛋白，Y轴为蛋白名，X轴为相应基因邻接节点数目（图4）.网络分析结果显示，有51个节点，369条边，平均每个节点的degree值为14.5，平均局部聚集系数为0.643.关联性较强的蛋白有AKT1、PTGS2、CASP3、IL - 1β、JUN、PPARG、HMOX1和NFKBIA等，选取了前20个关联性强的蛋白，结果见图2.在前20个关联性较强的蛋白里选取degree值大于30的为核心靶蛋白，包括AKT1、CASP3、IL - 1β、PTGS2，这些蛋白质可能是人参抗辐射损伤的关键靶点.

3.5 GO功能富集分析

利用R软件对人参抗辐射损伤的51个核心蛋白靶点进行在线GO富集分析，设定筛选标准P < 0.01.GO功能富集分析结果显示，51个核心蛋白富集主要涉及酰胺结合（9个靶点）、肽结合（9个靶点）、血红素结合（8个靶点）、四吡咯结合（8个靶点）、氧化酶的活性（8个靶点）、内肽酶活性（7个靶点）、泛素样蛋白连接酶结合（6个靶点）、DNA结合转录因子结合（6个靶点）、单加氧酶活性（5个靶点）等多个靶点（见表2和图5）.人参抗辐射损伤的作用可能通过参与多种机体内多种位点的结合和调控酶的活性等过程，这些都与辐射损伤引起细胞损伤、代谢紊乱密切相关.

3.6 KEGG信号通路富集分析

为了揭示人参抗辐射损伤的相关通路，对51个靶点通过R软件进行KEGG分析，得到与人参抗辐射损伤的137条相关通路.根据基因富集数筛选前20条通路途径绘制气泡图（见图5），其通路包括肿瘤坏死因子（14个靶点）、糖尿病并发症中的AGE - RAGE（13个靶点）、IL - 17（11个靶点）、C型凝集素受体（11个靶点）、凋亡（11个靶点）、MAPK（11个靶点）、Toll样受体（10个靶点）、NOD样受体（10个靶点）、NF - κB（9个靶点）、松弛素（9个靶点）、HIF - 1（8个靶点）、PI3K/AKT（8个靶点）、cAMP（5个靶点）、VEGF（5个靶点）等.

3.7 人参活性成分与辐射损伤相关核心蛋白的分子对接

利用分子对接技术对结果进一步分析.根据人参活性成分 - 基因靶点 - 辐射损伤网络筛选得到4个活性成分，分别为kaempferol、inermin、β - sitosterol和Fumarine.根据PPI网络，选取排名前4个靶点AKT11、PTGS2、CASP3、IL - 1β，作为对接靶蛋白（表3）.结果显示，活性成分与靶点蛋白的结合能介于-5.9 ~ -10.5 kcal/mol之间，结合能越低，表明活性成分与辐射损伤核心蛋白靶点之间亲和力越高（表3，图6）.对结果进一步分析发现，kaempferol、inermin、β - sitosterol和fumarine 4个活性成分与核心靶蛋白都有很好的结合能力，且与PTGS2结合能力较强.

4 讨论

随着核能的发展和核技术的广泛应用，人类受到电离辐射机会越来越多.核医学上辐射损伤常见于肿瘤患者放疗后，临床上主要表现为白细胞减少、免疫功能低下、肠道出血等^［8-9］.目前现有的辐射防护剂存在着诸如毒副作用大、价格昂贵、效果不稳定或治疗窗小等问题，一定程度上限制了其在临床的普及推广，例如氨磷汀，其防护的有效剂量与中毒剂量非常的接近，且副作用大.所以，研发新型有效、毒副反应小、稳定性高的防护剂是必要的.中医认为放射线为一种火热毒邪，造成机体气血两亏，常用补虚和益气解毒的治疗原则.近年来中药起到了积极治疗的作用，且中药以其安全、方便口服、吸收迅速、价格低廉等特点，被认为是辐射防护剂研究的新热点^［10-11］.

人参，被誉为“百草之王”.张洪长等^［12］研究表明人参中的人参皂苷Re能够通过减少短波紫外线辐射引起的早期细胞凋亡，提高了细胞内超氧化物歧化酶的活性，从而有效提高人胚胎纤维芽细胞的生存率.以人参为君药的四君子汤，能够有效促进单次3.5 Gy⁶⁰Coγ射线照射3 d后小鼠体重的恢复，显著提高照射7 d后的胸腺、脾脏的脏器系数，显著降低照射后脾脏细胞的凋亡率及骨髓嗜多染红细胞微核率^［13］.Bing等^［14］研究表明，辐射对肠隐窝细胞较敏感，照射前给予小鼠酸性人参多糖，通过调节抗凋亡蛋白（Bcl - 2和Bcl - XS/L）和促凋亡蛋白（p53、BAX、细胞色素c和Caspase - 3）的表达水平，保护辐射诱导小肠的凋亡.近些年，研究表明人参对预防辐射损伤起到了积极的作用，但对于人参抗辐射损伤的机制尚不明确.

本文通过网络药理学对人参抗辐射损伤的机制进行研究，构建人参活性成分 - 关键蛋白靶点网络图，发现kaempferol、inermin、β - sitosterol和fumarine这4种活性物质的节点Degree值较高，推测这些活性成分在抗辐射损伤作用上发挥了重要的作用.通过对51个潜在蛋白靶点进行GO功能富集和KEGG通路分析，推测人参活性成分可能通过调控肿瘤坏死因子、IL - 17、MAPK、Toll样受体、凋亡和PI3K/AKT等信号通路，从而起到抗辐射损伤的作用.

通过PPI网络分析得到的核心蛋白有AKT1、CASP3、IL - 1β、PTGS2.其中AKT1是AKT的亚型之一，AKT作用是通过AKT/蛋白激酶B信号作用通道，调节包括代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成在内的许多过程.DU等^［15］研究表明AKT在NF - κB依赖性基因转录的调节中起重要作用，AKT可以通过调节CREB（环腺苷酸（cAMP） - 反应元件结合蛋白）的活性，促进细胞存活.AKT是磷脂酰肌醇3 - 激酶（PI3K）下游的信号，有着调节各种生长因子的作用，如血小板衍生生长因子（PDGF）、表皮生长因子（EGF）、胰岛素和胰岛素样生长因子1（IGF - 1）等，辐射损伤可能导致磷酸化PI3K蛋白表达，通过级联反应活化下游AKT磷酸化和mTOR蛋白，迅速激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，人参活性成分可能通过此通路调节细胞的凋亡和生长等^［16-19］.

半胱天冬氨酸特异性蛋白酶（Caspases，CASP）在细胞凋亡的调控中起到至关重要的作用，以非活性酶原形式存在，参与响应促凋亡信号而触发级联反应.其中，CASP3是CASP中的一种主要的执行蛋白，凋亡现象存在于任何细胞，可以通过物理、化学等分子调控细胞生长和死亡的动态平衡.CASP3参与了辐射引起机体损伤的凋亡过程，通过中草药人参中的活性成分调控CASP3蛋白，从而抑制细胞凋亡，使细胞保持在生长与死亡的动态平衡状态^［20-21］.

白细胞介素1和前列腺素内环氧化物合成酶2，两者在保护细胞方面都起着至关重要的作用，可以通过调控IL - 1β和PTGS2蛋白靶点，改善机体的炎症水平.辐射可引起机体细胞死亡、产生大量的自由基等，导致炎症的发生，人参可能通过调控IL - 1β和PTGS2蛋白靶点，降低机体的炎症水平，减少机体的炎症反应，促进细胞的恢复^［22-26］.

5 结语

利用网络药理学、分子对接技术，对人参进行了多方面、多角度的研究，初步预测了人参抗辐射损伤的作用机理.通过人参活性成分 - 基因靶点-辐射损伤网络预测人参抗辐射损伤的药效物质基础可能是kaempferol、inermin、β - sitosterol和fumarine，通过关键靶点AKT1、CASP3、IL - 1β、PTGS2调节肿瘤坏死因子、IL - 17、MAPK、Toll样受体、凋亡和PI3K/AKT等信号通路发挥抗辐射损伤的作用，表明人参是通过“多成分”“多靶点”“多通路”发挥抗辐射损伤的作用，可为后期的作用机制研究及临床应用提供一定的参考依据.

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基金资助

山西省自然科学研究面上项目(202103021224447)