基于SIE - 荧光素酶细胞系IL - 6/JAK/STAT3通路抑制剂的发现

SIE - luciferase reporter gene stably expressed cell line and inhibitors of IL - 6/JAK/STAT3 signaling pathway

摘要

IL-6/JAK/STAT3信号通路与癌症和炎症密切相关，是药物研发的重要靶点.基于SIE-荧光素酶基因稳定表达的细胞系，建立了通路抑制剂筛选模型，对从中药香附中分离出的倍半萜类化合物进行了活性筛选，首次发现4种化合物（1 ~ 4）可抑制IL - 6诱导的JAK/STAT3信号通路活化，其IC₅₀值为58.18 ~ 170.06 μmol/L.进一步研究显示，这些化合物通过下调磷酸化JAK2蛋白水平，阻止STAT3蛋白进入细胞核，从而抑制信号通路.本研究为香附的功效物质研究及抗炎或抗癌药物开发提供了理论依据.

Abstract

The IL - 6/JAK/STAT3 signaling pathway plays a critical role in cancer and inflammatory diseases， making it an important target for drug discovery. In this study， a screening model for pathway inhibitors was established using a cell line stably expressing the SIE - luciferase gene. Activity screening of sesquiterpenoids isolated from the traditional Chinese medicine Cyperus rotundus L. identified four compounds （1 - 4） that exhibited inhibitory effects on IL - 6 - induced JAK/STAT3 signaling activation for the first time， with IC₅₀ values ranging from 58.18 to 170.06 μmol/L. Further mechanistic studies revealed that these compounds suppress the signaling pathway by downregulating phosphorylated JAK2 levels and inhibiting the nuclear translocation of STAT3 protein. This research provides valuable theoretical insights into the functional substances of C. rotundus and supports the development of novel anti-inflammatory or anti-cancer agents.

Graphical abstract

关键词

IL - 6/JAK/STAT3信号通路 / 抑制剂 / 中药香附 / 倍半萜 / 抗癌

Key words

IL - 6/JAK/STAT3 signaling pathway / inhibitors / Cyperus rotundus L. / sesquiterpenoids / anti-cancer

信号转导和转录激活因子（signal transducers and activators of transcription， STATs）家族是一类能与DNA结合的蛋白质^［1］，具有信号转导和转录调节的双重功能^［2］，能对多种胞外的细胞因子、生长因子和激素等信号应答^［3-4］，介导胞内信号传递并进入核内影响包括细胞分化、增殖、发育、凋亡和炎症等相关基因的表达^［5］.STATs蛋白家族共有7个成员（STATs 1 - 4， 5A， 5B和6）^［6］，其中STAT3与肿瘤生长和免疫抑制关系最为密切，在人类大多数肿瘤中都发现STAT3信号过度活化^［7］，且其激活程度与预后呈负相关^［8］.多种细胞因子或生长因子信号能诱导STAT3的活化^［9］，其中IL - 6是能调控STAT3作用的重要影响因素.IL - 6是一种多效性细胞因子，在调节免疫应答和炎症反应过程中发挥了重要作用^［10］，其作为细胞因子网络中的重要成员，在急性炎症反应中处于中心地位，同时IL - 6也可以通过激活STAT3信号在慢性炎症中发挥重要作用.IL - 6在细胞表面与其受体IL - 6R结合并与其信号链gp130结合形成同源二聚体^［8］，招募并激活Janus激酶（Janus kinases， JAKs），JAKs 将gp130胞内段的酪氨酸残基磷酸化，进而结合并导致STAT3第705位酪氨酸残基的磷酸化及活化，活化的STAT3形成二聚体并转位进入细胞核调控相关基因的转录.

炎症反应是机体组织对损伤因子所发生的防御反应，急性炎症往往是自限性的，但是当体内促炎因子和抗炎因子失衡时，炎症会持续性存在而表现为慢性炎症，引起多种器官和组织的病变，进而引发包括癌症在内的多种严重疾病^［11］.研究^［12］发现，IL - 6在恶性肿瘤微环境中高表达，是肿瘤微环境中调控炎症反应的主要因素，其通过调控JAK/STAT3信号通路能够促进肿瘤细胞的增殖、抑制其凋亡、促进肿瘤血管生成并维持免疫抑制的肿瘤微环境^［7］.临床上已经在多种肿瘤中发现了IL - 6/JAK/STAT3信号通路的异常活化^［8］，因此IL - 6/JAK2/STAT3通路已成为相关药物的治疗靶点，靶向该信号通路的抑制剂被认为能够通过抑制肿瘤细胞生长并刺激抗肿瘤免疫而发挥抗癌作用^［13］.目前靶向IL - 6及其受体和JAKs的药物已获得FDA批准用于炎症性疾病的治疗，并已有相关药物进入临床用于血液系统肿瘤和实体肿瘤的治疗研究^［8］.

为了发现IL - 6/JAK/STAT3信号通路抑制剂，本文用sis诱导元件（SIE） - 荧光素酶报告基因质粒转染HEK293T细胞，并利用潮霉素筛选单克隆细胞，构建了稳定表达该基因的细胞系，利用该细胞系建立了适用于IL - 6/JAK/STAT3信号通路抑制剂筛选的体外筛选模型，并对我们从传统中药香附中分离得到的天然化合物进行了筛选，发现了4个倍半萜类化合物能够抑制IL - 6诱导的JAK/STAT3信号通路的活化.进一步通过免疫荧光及蛋白免疫印迹法考察了活性化合物对JAK/STAT3相关蛋白的表达，发现香附中倍半萜能够通过抑制IL - 6诱导的JAK2和STAT3蛋白的磷酸化，进而抑制STAT3蛋白的转位入核，产生对IL - 6/JAK/STAT3信号通路的抑制作用.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞

人肝癌细胞（HepG2）和人胚肾上皮细胞（HEK293T）细胞购自中国科学院上海细胞库.

1.1.2 主要试剂

DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、谷氨酰胺均购自Biological Industries公司；Opti - MEM购自Gibco公司；胰蛋白酶购自Invitrogen公司；Human IL - 6购自Peprotech公司；Lipofectamine 2000购自Thermo Fisher公司；pGL4.47［luc2P/SIE/Hygro］质粒和ONE - Glo荧光素酶检测系统购自Promega公司；氯硝柳胺（Niclosamide）购自Selleck公司；潮霉素B购自上海翊圣生物科技有限公司；Triton X - 100购自biosharps公司；DAPI Fluoromount - GTM抗荧光淬灭封片剂购自上海翊圣公司；TEMED和Tween 20购自BBI life sciences公司；STAT3、JAK2抗体购自protentech公司；STAT3（Phospho - Tyr705）购自Signalway Antibody公司、Phospho - JAK2（Tyr1007/1008）购自Cell Signaling公司；24孔板专用细胞爬片购自索莱宝公司；ECL显影液购自美仑公司；PVDF膜购自Millipore公司；其他常用分析纯试剂购自致远化学有限公司；实验所测的所有样品均来源于实验室从中药香附，即莎草（Cyperus rotundus L.）的干燥根茎中分离提取得到的单体化合物.

1.1.3 主要仪器

微孔板检测器（SpectraMax i3x型，Molecular Devices公司）；二氧化碳细胞培养箱（3425型，ThermoFisher公司）；激光共聚焦显微镜（DMI8，徕卡公司）；低温高速离心机（5424 R型，Eppendrof公司）；蛋白电泳仪（BioRad公司）；化学发光成像仪（Tanon 5200型，上海天能）.

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

HepG2和HEK293T细胞使用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基培养在37 ℃，含体积分数5% CO₂的细胞培养箱内.

1.2.2 细胞转染

将处于对数生长期的HEK293T细胞接种于24孔板中，用Lipofectamine 2000将pGL4.47［luc2P/SIE/Hygro］质粒转染细胞，24 h后加入含有0.6 mg/mL潮霉素B的DMEM完全培养基筛选阳性克隆的细胞.将阳性克隆细胞制成单细胞悬液，以体积比2∶1的比例多次并接种于96孔板，并加入含有潮霉素B的完全培养基继续培养，挑选生长状态良好的单细胞克隆进行培养，得到一系列稳定表达SIE质粒的HEK293T - SIE细胞克隆.取处于对数生长期的HEK293T - SIE细胞接种于96孔板中培养24 h后，换液加入无血清的DMEM培养24 h，之后每孔加入终质量浓度为50 ng/mL的IL - 6继续培养12 h，最后用ONE - Glo荧光素酶检测系统检测其荧光值，挑选转染效率最高的单克隆细胞并用于后续实验.

1.2.3 IL - 6/JAK/STAT3信号通路抑制剂筛选模型建立及活性筛选

取处于对数生长期的HEK293T - SIE细胞接种于96孔板中培养24 h后，分别用含体积分数0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%和10%灭活FBS的DMEM以及无血清培养基（Opti - MEM）进行换液后继续培养24 h.之后每孔加入终质量浓度为50 ng/mL的IL - 6继续培养12 h，培养结束后用ONE - Glo荧光素酶检测系统检测其荧光值，确定换液用培养基中FBS的质量浓度为1%.将处于对数生长期的HEK293T - SIE细胞接种于96孔板中培养24 h后，用含有体积分数1%灭活FBS的换液后继续培养24 h，之后分别加入不同浓度的化合物继续作用12 h后，每孔加入终质量浓度为50 ng/mL的IL - 6，继续培养12 h，最后用ONE - Glo荧光素酶检测系统检测荧光值.

1.2.4 细胞毒实验

采用磺酰罗丹明B（SRB）法评价在IL - 6/JAK/STAT3信号通路抑制剂活性筛选的同等条件下，样品对293T - SIE细胞的细胞毒性作用，具体方法同文献［14］.

1.2.5 细胞免疫荧光实验

将HepG2细胞接种于细胞爬片上培养12 h后换液含体积分数0.5% FBS的DMEM培养基继续培养24 h，之后加入200 μmol/L的香附化合物作用12 h，再用50 ng/mL的IL - 6刺激30 min.将细胞置于体积分数4%多聚甲醛中固定20 min，用含体积分数0.25% Triton X - 100的PBS溶液通透处理15 min，之后用含体积分数3% BSA的PBS溶液封闭1 h，加入STAT3特异性一抗在4 ℃下孵育过夜，之后用Aexa Fluor TM 488标记的二抗室温孵育1 h.用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片后在激光扫描共聚焦显微镜下成像.

1.2.6 蛋白免疫印迹（Western Blotting）实验

将处于对数生长期的HepG2细胞接种于12孔板中培养24 h后，用含体积分数1%灭活FBS的培养基换液后继续培养24 h，加入化合物作用12 h后再加入终质量分数为50 ng/mL的IL - 6作用15 min.弃上清后，加入蛋白裂解液（72 mmol/L Tris - HCl、质量分数2% SDS、体积分数10%丙三醇、体积分数0.1%溴酚蓝）在冰上裂解10 min，超声10 min，随后煮沸加热10 min，12 000 r/min条件下离心10 min后取上清用于SDS - PAGE，之后将电泳分离的蛋白转移到PVDF膜上，在室温下用含体积分数5%脱脂奶粉的TBST（20 mmol/L Tris - HCl， pH = 7.4， 150 mmol/L NaCl，体积分数0.1% Tween - 20）溶液封闭1 h后，加入特异性一抗在4 ℃下孵育过夜，洗膜后用HRP标记的二抗室温孵育1 h后，加入ECL显影液，用化学发光成像仪进行曝光检测并进行灰度分析.

1.2.7 实时荧光定量PCR实验

将处于对数生长期的HepG2细胞接种于12孔板中培养24 h后，加入化合物作用12 h.弃上清液后，加入PBS清洗3次，使用Trizol法提取细胞中的总mRNA，按照HIScript Ⅲ RTsuperMix for pcr反转录试剂盒说明书操作得到cDNA.使用SYBR Green PCR试剂盒配制体系进行RT - PCR，扩增条件：95 ℃变性30 s预热，40个循环（95 ℃，5 s和60 ℃，34 s），使用2^-ΔΔCt法计算mRNA表达水平，引物信息见表1.

1.2.8 统计分析

使用Image j、Prism 8软件进行数据处理，数据均采用Mean ± SED表示，组间差异分析采用Two - way ANOVA，P < 0.05被认为差异具有统计学意义.

2 实验结果

2.1 SIE稳定表达细胞系的构建及IL - 6/JAK/STAT3信号通路抑制剂筛选模型的建立

用脂质体将pGL4.47［luc2P/SIE/Hygro］质粒转染至HEK293T细胞，并用潮霉素B筛选阳性单克隆细胞，共成功挑选出13株单克隆细胞，用荧光素酶报告基因检测后发现，相对于没有IL - 6刺激的细胞，13株阳性克隆细胞在IL - 6刺激后其荧光素酶的表达明显增强，尤其是T9号单克隆细胞，其激活倍数为16.45倍（图1a），故选择该单克隆细胞进行扩大培养并用于后续试验.

FBS中含有的多种细胞因子和激素等会导致JAK2/STAT3通路的活化，为了排除其影响，我们对换液培养基中的FBS浓度进行了优化，考察了含不同浓度FBS培养基对IL - 6激活的JAK/STAT3信号通路活化的影响.结果显示，培养基中FBS体积分数在0 ~ 1%之间时，随着FBS体积分数的升高，细胞对IL - 6所致的通路活化效应逐渐增强，但之后随着浓度的升高，其效应逐渐降低（图1b）.究其原因可能是因为FBS体积分数过低使得细胞粘附生长能力减弱，而浓度过高又会导致其中的生长因子提前活化了JAK/STAT3信号通路，从而使得IL - 6的激活作用减弱.因此我们选择含体积分数1% FBS的培养基进行后续的活性筛选试验，在此体积分数下细胞能够正常生长并对IL - 6诱导的JAK/STAT3信号通路活化效应最强.

利用以上条件建立了IL - 6/JAK/STAT3信号通路抑制剂的活性筛选模型，以STAT3抑制剂niclosamide为阳性对照，对筛选模型进行了结果验证.结果表明，niclosamide能够剂量依赖性地抑制IL - 6诱导的JAK/STAT3信号通路的活化，半数抑制浓度（IC₅₀）值为（543.94 ± 4.56）nmol/L（图1c）.

2.2 香附倍半萜抑制IL - 6诱导的JAK/STAT3信号通路活化

利用IL - 6/JAK/STAT3信号通路抑制剂筛选模型对提取得到的化合物进行了活性筛选，结果显示在200 μmol/L浓度下，从香附中分离得到的4个倍半萜类化合物（1 ~ 4，图2）对IL - 6诱导的JAK/STAT3信号通路有明显抑制作用，其IC₅₀值在58.18 ~ 170.06 μmol/L之间（表2）.且在200 μmol/L浓度下，化合物1 ~ 4对细胞生长没有显示明显毒性，表明其对信号通路的抑制作用并非由其细胞毒性作用所致.

2.3 香附倍半萜抑制IL - 6诱导的STAT3蛋白的转位入核

STAT3蛋白活化后从细胞质转位进入细胞核并启动下游基因的转录表达是IL - 6/JAK/STAT3信号通路活化的重要事件，为了考察化合物对IL - 6/JAK/STAT3通路的抑制作用，用免疫荧光法检测了化合物1 ~ 4对STAT3核转位的抑制作用.结果显示，IL - 6能够明显诱导细胞质中STAT3蛋白的转位入核，但在200 μmol/L化合物1 ~ 4的作用下，其诱导的STAT3蛋白转位入核作用受到明显抑制（图3）.

2.4 香附倍半萜能够调控IL - 6活化的JAK/STAT3通路相关蛋白的表达

采用蛋白免疫印迹法考察香附倍半萜类化合物1 ~ 4对IL - 6诱导活化的JAK/STAT3通路中关键蛋白的表达情况，结果显示，IL - 6作用后细胞内磷酸化JA2K和磷酸化STAT3蛋白表达量明显增加，化合物1 ~ 4不影响STAT3总蛋白的表达，但是能影响IL - 6诱导的磷酸化STAT3的表达，尤其是化合物3，能够明显下调磷酸化STAT3蛋白的表达.除此之外，化合物1 ~ 4能够下调JAK2总蛋白的表达，同时也能显著下调IL - 6诱导的磷酸化JAK2蛋白的表达（图4）.

2.5 香附倍半萜能够调控JAK/STAT3通路下游炎症因子的表达

采用RT - PCR考察香附倍半萜类化合物1 ~ 4对JAK/STAT3通路下游炎症因子mRNA表达水平的影响.结果显示，化合物1 ~ 4能显著抑制HepG2细胞中炎症因子IL - 1β的mRNA表达，化合物1 ~ 3能够显著抑制IL - 6的mRNA表达，化合物4对IL - 6的mRNA表达没有抑制作用（图5）.

3 讨论与结语

由于IL - 6/JAK/STAT3信号通路与癌症和炎症性疾病的密切关系，其已成为相关药物研发的重要靶点，其抑制剂也已进入临床用于炎症性疾病和癌症的治疗.在细胞内，受IL - 6信号激活的STAT3蛋白磷酸化后形成二聚体并转位进入细胞核，与c - fos启动子上的SIE结合，从而启动下游基因的表达^［15］.为了快速发现IL - 6/JAK/STAT3信号通路抑制剂，用脂质体转染和报告基因检测法构建了SIE - 荧光素酶报告基因稳定表达的细胞系并建立了相应的通路抑制剂筛选模型.相对于瞬时转染后的双报告基因检测法，稳定表达细胞系用于筛选，可以不使用内参基因，且适用于96孔板培养检测，所需样品量更少，具有方便、快速、经济、重现性好等特点，更适用于微量天然产物的活性筛选.

通过活性筛选，发现了4个对IL - 6诱导的JAK/STAT3信号通路活化有抑制作用的倍半萜类化合物，这些化合物皆是从我国传统中药香附中分离得到.临床上，香附可用于肝郁气滞，疝气疼痛，腕腹痞闷，月经不调等症，药理活性及化学成分研究^［16］表明，香附具有镇痛、抗炎、抗菌、抗癌等多种生物活性，倍半萜类化合物为其主要活性成分.研究组前期对香附及其同属植物纸莎草的化学成分开展了研究，从中分离得到60多个倍半萜类化合物，部分化合物具有较好的体外抗炎活性，对炎症相关信号通路NF - κB具有较好的抑制作用^［17-19］.在此基础之上，考察了这些倍半萜化合物对IL - 6诱导的JAK/STAT3信号通路活化的抑制作用，发现从香附中分离得到的一个具有6/6/5新颖骨架结构的倍半萜Cyperensol A对该通路具有较好的抑制活性^［20］.进一步的活性筛选发现，香附中的倍半萜大多无明显细胞毒性，在200 μmol/L浓度下对IL - 6活化的JAK/STAT3通路有一定抑制作用，尤其是化合物1 ~ 4.香附中倍半萜成分含量高，种类繁多，化合物1 ~ 4分别为广霍香型倍半萜cyperen - 6 - ol，桉烷型倍半萜14 - hydroxy - α - cyperone，丁香烷型倍半萜α - gurjunene和愈创木烷型倍半萜Cyperusol A2，为其同类型化合物中的代表性活性化合物.哺乳动物细胞中共存在4种JAKs激酶（JAK1、2、3和TYK2），其中JAK2与STAT3组成的JAK2/STAT3通路与肿瘤和免疫抑制关系最为密切^［21］，通过对IL - 6活化的JAK2/STAT3信号通路调控机制研究发现，化合物1 ~ 4主要通过下调磷酸化JAK2蛋白的表达，影响STAT3蛋白的转位入核，从而发挥其对IL - 6/JAK/STAT3信号通路的抑制作用.此外，通过对JAK2/STAT3信号通路下游炎症因子的mRNA表达检测发现，化合物1 ~ 3能够显著抑制IL - 6和IL - 1β的mRNA表达，而化合物4仅能显著抑制IL - 1β表达，但对IL - 6的表达没有抑制作用，表明化合物1 ~ 3相对于化合物4对JAK/STAT3信号通路具有更好的抑制作用.结合报告基因、蛋白免疫印迹实验结果和RT-PCR实验结果分析表明，相对于5/7环结构的广霍香型、丁香烷型和愈创木烷型倍半萜，具有6/6环结构的桉烷型倍半萜对与炎症密切相关的JAK2/STAT3信号通路具有更好的抑制作用.这与前期关于香附倍半萜类化合物体外抗炎活性的研究结果相一致^{［17，19］}.本文从一定程度上解释了中药香附发挥临床功效的物质基础，也为中药香附倍半萜作为抗炎或抗癌药物的研究与开发提供了理论基础.

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基金资助

国家自然科学基金(31760095)

云南省科技厅项目(202205AC160084)