物理化学综合实验设计

Comprehensive experimental design for the Physical Chemistry——preparation of mulberry flower glycoside hydrogel and its antioxidant resistance

摘要

在“双一流”建设的背景下，物理化学实验教学结合中药学专业特点开展了创新综合实验，以进一步提高中药学专业学生的创新思维能力与科研素养.受中药研磨过程启发，将桑葚花色素苷协同辣根过氧化物酶（HRP）催化与羧甲基纤维素（CMC）在机械力下共组装，制备葚花色素苷水凝胶.通过流变学测试考察所制备的水凝胶的机械性能、自愈合性、可注射性，采用1，1 - 二苯基 - 2 - 三硝基苯肼（1 - diphenyl - 2 - picrylhydrazyl，DPPH）法考察水凝胶的抗氧化性.该实验操作简单，可巩固加深理解物理化学中胶体与界面化学相关的知识内容，也可用于中药学等医药类大学化学综合实验教学.

Abstract

In the context of "double first - class" construction， innovative comprehensive experiments in Physical Chemistry have been conducted in the field of Chinese medicine to enhance the innovative thinking and scientific research skills of students studying Chinese medicine. Taking inspiration from the traditional Chinese medicine grinding process， a hydrogel was prepared by co - assembling mulberry flower extract with horseradish peroxidase （HRP） and carboxymethyl cellulose （CMC） under mechanical forces. The mechanical properties， self - healing abilities， injectability， and antioxidant activity of the hydrogels were studied through rheological testing and 1 - diphenyl - 2 - picrylhydrazyl （DPPH） method. This experiment， which simplifies the understanding of colloid and interface chemistry in physical chemistry， can be utilized in comprehensive experimental teaching in chemistry for Chinese medicine and other pharmaceutical universities.

Graphical abstract

关键词

中药 / 物理化学 / 水凝胶 / 抗氧化性 / 综合实验

Key words

Chinese Medicine / Physical Chemistry / hydrogel / oxidative resistance / comprehensive experiments

为响应国家“双一流”建设战略对创新人才培养的迫切需求^［1-2］，物理化学课程作为融合物理理论和化学现象的核心基础学科^［3］，其教学改革尤其是实践环节的创新显得尤为重要.对于中药学专业而言，该课程不仅是连接化学基础与专业课程之间的桥梁，更是培养具备扎实理论基础和创新能力的现代中药研发人才的关键支撑.实验教学作为物理化学课程不可或缺的组成部分，在深化理论理解、培养科学思维及提升实践创新能力方面具有不可替代的作用.

在此背景下，安徽中医药大学物理化学课程组积极探索实践教学改革路径.本文聚焦于2022级中药学专业开设的一项综合性实验设计案例.该案例紧密契合中药学特色与前言应用，创新性地引入中药桑葚的核心活性成分——花色素苷.花色素苷因其显著的抗氧化等生物活性^［4-9］，成为中药现代化研究的关注点之一.同时，结合现代材料科学热点——水凝胶技术.水凝胶以其高含水率、良好生物相容性和可设计的物理化学性能，在生物医药领域展现出巨大潜力^［10-12］.

本文巧妙将二者结合，模拟中药研磨工艺，利用桑葚花色素苷与辣根过氧化物酶（HRP）协同催化，并与羧甲纤维素（CMC）在机械力作用下共同组装，制备具有潜在医用价值的桑葚花色素苷水凝胶敷料，并评估了所制备水凝胶的机械性能、自愈合性、可注射性和抗氧化性.这一实验可以作为中药学及相关医药类专业的物理化学实验教学内容，培养其跨学科思维，提高学生的专业兴趣和创新思维能力，为中药学及相关专业物理化学实验教学改革提供实践范例.

1 实验目的

（1） 了解花色素苷的来源、药理作用及提取方法；

（2） 了解水凝胶的类型、制备及在医药中的应用；

（3） 掌握桑葚花色素苷水凝胶的制备方法及水凝胶抗氧化性评价的原理与方法.

2 实验原理

凝胶是由2种或2种以上组分所形成的半固态物质，是交联聚合物的溶胀体.水凝胶是以水为分散介质的凝胶，可吸收并保持水分，具有在水中溶胀且不溶于水特性的三维网络状高分子.桑葚花色素苷作为花色苷的一种，具有多个酚羟基的天然黄酮类化合物.鉴于其具备丰富的酚羟基特征，以HRP作为酶催化剂可催化桑葚花色素苷的苯酚基团发生氧化偶联，同时再与CMC行共组装，协同高分子链间丰富的氢键作用，在研磨机械力作用下形成三维网络水凝胶，如图1所示.

3 试剂与仪器

实验所用主要试剂：桑葚花色素苷（西安首禾生物科技有限公司）、辣根过氧化物酶（南京建成生物工程研究所）、羧甲基纤维素（CMC，麦克林生化科技股份有限公司）、2，2 - 联苯基 - 1 - 苦基肼基（DPPH，麦克林生化科技股份有限公司）.

实验所用仪器：电子分析天平（AB135 - S型，德国METTLER TOLEDO公司）、天然玛瑙研钵（Ф 7 CM，上海力辰邦西仪器科技有限公司）、紫外分光光度计（UV - 1900，上海元析分析仪器有限公司）、流变仪（DHR - 2，美国TA仪器沃特斯公司）、扫描电子显微镜（QUATTRO S，美国赛默飞）.

4 实验步骤

4.1 水凝胶的制备

使用分析天平精准称量50.00 mg的桑葚花色素苷和1.00 mg HRP置于干净的模具中，并加入5.00 mL超纯水后超声5 min以实现完全溶解，形成澄清透明溶液.将此混合溶液转移至玛瑙研钵中，并称取0.30 g的CMC少量多次地加入到研钵中，同时进行顺时针研磨，确保混合物均匀且具有黏性，即可制备出桑葚花色素苷水凝胶（CAH）.

4.2 水凝胶的性能测试

4.2.1 流变学测试

将凝胶滴加在样品台中央，37 ℃下稳定30 min，再在该温度下进行振幅扫描、剪切速率扫描.

4.2.2 自愈合性测试

将该凝胶滴加至样品台中央，并在该温度下环境下，以10 rad/s的频率实施时间阶跃应变扫描.针对1%和1 000%应力交替阶跃应变循环条件下的水凝胶，测量储存模量（G'）和损耗模量（G"），评估其自愈合性.

4.2.3 可注射性测试

在37 ℃下保持30 min后，将水凝胶在相同温度下，从0.1 ~ 1 000 s^-1以1 Hz的频率开始剪切速率扫描.在此过程中，记录G'和G"随剪切速率而变化的曲线.此外，为评估其可注射性将装入注射器中的凝胶挤出至培养皿考察其可注射流畅性.

4.3 水凝胶的抗氧化性评价

采用DPPH抗氧化清除实验测试桑葚花色素苷的抗氧化性^［8］.作为对比，采用上述实验方法制备含有0.3 g CMC的空白水凝胶.称取3.94 mg DPPH粉末，用无水乙醇溶液定容至100 mL，配制成浓度为0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，室温避光下保存.取3 mL的DPPH乙醇溶液，分别加入到含有0.5 mL水凝胶样品1和样品2的2个棕色EP管中.将混合物置于暗处孵育，以DPPH乙醇溶液为空白对照.使用紫外分光光度计在517 nm处测定溶液在0.5、1、2、4、6、8、10、15 min后的吸光值，并记录结果.所有实验均重复3次.水凝胶自由基清除率意为自由基被样品抑制的百分比，见公式（1）.

自由基清除率 = （A₀- A_i ）/A₀ × 100%.（1）

其中，A₀为未加入样品时DPPH自由基的吸光值；A_i 为加入样品后DPPH自由基的吸光值.

5 结果与讨论

5.1 水凝胶制备前后外观变化

如图2所示，桑葚花色素苷、HRP、CMC 3种试剂全部加入并完全溶解后，倾斜瓶身，样品呈现流体样，还未成胶；经过充分研磨，在机械力下的共组装作用后形成水凝胶，倾斜瓶身，样品能稳定在瓶底，未呈现流动状态，证明了桑葚花色素苷水凝胶制备完成.

5.2 水凝胶的性能表征

为了评估CAH凝胶的力学性能，采用流变仪进行测试.图3为CAH的应变 - 模量曲线，在剪切应变逐渐增加的进程中，CAH水凝胶的G'和G"首先呈现一段稳定阶段，且G'大于G"，这表明水凝胶具有良好的黏弹性，呈现为凝胶态.在较大变形下也能保持完整的三维网络结构.当剪切应变接近50%时，G'开始下降，并随应变增加逐渐降低，最终与G"相交，表明其已达到凝胶 - 溶液转变的临界点，网络结构逐渐被破坏.当G'小于G"时，其三维结构显著畸变，由于高分子链间的物理作用力如氢键在高剪切作用下被破坏，水凝胶转变为溶胶状态.

水凝胶三维网络中丰富的氢键作用赋予其优秀的自愈合特性，其网络结构可在较大外力影响下遭受破坏，若除去外力，能恢复形状及力学性能.如图4所示，本研究采用流变仪进行测试验证CAH水凝胶的自愈合行为.在时间阶跃应变扫描中，对其交替施加1%和1 000%的应力.施加1 000%应力时，G'急剧下降，且G"远高于G'，表明其处于溶胶状态，原有结构已被破坏；当应力降至1%时，G'立即恢复.多次循环后，G'仍可恢复至初始值，表明该过程可逆，证明了其愈合特性.

图5为CAH的应变 - 黏度曲线，将剪切频率从0.1 s^-1增加到1 000 s^-1，水凝胶的黏度呈现下降趋势，表明在剪切力作用下，凝胶中的动态共价键被破坏，使其流动性增加，最终接近液体状态.这种剪切稀化特性表明样品具有可注射性.将CAH水凝胶装入带活塞的注射器中，推动活塞，通过针头将其挤出以更直观地展示其剪切稀化行为.结果显示，该水凝胶可形成完整的英文字母“A”和“B”（图6），进一步验证了其具有良好的可注射性.

5.3 水凝胶的抗氧化性

DPPH作为稳定的自由基，与奇数电子产生相互作用，在517 nm处产生吸收峰.然而，当存在抗氧化性质的物质时，其孤对电子得以饱和，进而导致517 nm处的吸收峰消失或减弱.自由基清除率越高，样品抗氧化力越强，可分析DPPH在517 nm吸收峰的变化来检测样品抗氧化能力.本实验通过DPPH清除率测定桑葚花色素苷的抗氧化活性，结果如图7所示.与空白水凝胶相比，CAH水凝胶中的桑葚花色素苷对DPPH自由基具有较高的清除率，15 min内清除率可超过60%.只含有CMC的空白水凝胶也表现出一定的清除率，这可能是由于羧甲基纤维素中的羟基能够为DPPH自由基提供电子，具有微弱的清除作用.

6 实验关键操作与课后思考

在实验过程中需注意，桑葚花色素苷应避光保存，以防止其因光照而降解；同时在研磨过程中应做到快速且均匀，尽可能减少气泡的产生，以确保实验材料的均匀性和稳定性.

思考题部分要求从机理和应用2个角度展开分析.其一需阐述桑葚花色素苷水凝胶的自修复机制，其二需结合抗氧化性能的重要性，探讨该类水凝胶在生物医学、食品保鲜或柔性电子等领域的潜在应用.

7 教学设计与学生反馈

本创新综合实验在安徽中医药大学2022级中药学专业开展教学实践，具体安排包括：学生首先通过中国知网、Web of Science等文献数据库预习中药基水凝胶的背景与制备原理；教学过程中，教师重点讲解水凝胶的制备原理与操作流程，将学生按5 ~ 8人分组，指导制备水凝胶，并介绍流变仪使用及数据处理方法；实验总计8学时，各组制备的凝胶安排在同一时间段进行测试，便于统一评估；课后学生需撰写实验报告并进行数据分析，同时鼓励其通过文献查阅完成思考题，展望所制备水凝胶的应用前景.

通过调研学生的课后反馈，发现学生对该创新实验表现出浓厚的兴趣.多数学生认为，桑葚花色素苷水凝胶制备实验兼具新颖性和趣味性.该实验不仅使学生深入了解理论知识，还将其应用于实践操作.部分学生表示，享受接触凝胶制备原料的实验过程.该综合创新实验在拓宽知识面的同时，提供了与其他同学交流实验心得的机会.调研结果表明，将专业特点与实验教学相结合至关重要，有助于激发学生对中药学专业的兴趣，并逐步提升其综合素养.

8 结语

本创新综合实验通过制备桑葚花色素苷水凝胶，测试并分析其力学性能、自修复性能、可注射性及抗氧化性，发现其力学性能优良，弹性模量超过1 000 Pa，同时表现出良好的自愈合性和可注射性.桑葚花色素苷的引入赋予水凝胶良好的抗氧化活性.在实验教学过程中，教师应鼓励学生探索桑葚花色素苷含量对水凝胶抗氧化活性的影响，激发学生的好奇心和探究欲.受到中药研磨的启发，该实验通过机械力诱导桑葚花色素苷和羧甲基纤维素组装形成水凝胶，过程简便，利用研磨操作即可完成.该综合实验结合了中药学专业特点和物理化学理论，并涉及水凝胶这一热门生物医用材料.该实验不仅提升了学生对中药学的兴趣，还有助于其创新思维的激发与科学素质的培养.

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基金资助

安徽省教育厅质量工程项目(2023jyxm0358)