当归贝母苦参丸治疗慢性尿路感染的作用机制研究

Action mechanism of Angelica Fritilaria Sophorae Pill in the treatment of chronic urinary tract infection

摘要

探讨当归贝母苦参丸对慢性尿路感染的作用机制，并检索数据库获取其化学成分及靶点.研究发现当归贝母苦参丸活性成分29个，活性成分对应靶点175个；慢性尿路感染疾病靶点7 600个；药物与疾病交集靶点基因167个.蛋白质互作网络（PPI）分析得出核心靶点为AKT1、TP53、TNF等.基因本体论（GO）富集分析得到5 151条生物过程，489条细胞组成，822条分子功能；京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析显示富集在TNF、IL - 17、TLRs等信号通路.分子对接验证显示，当归贝母苦参丸主要活性成分槲皮素、β - 胡萝卜素、木犀草素、芒柄花素、豆甾醇与核心蛋白AKT1、TP53、TNF、IL - 6、VEGFA有较好的结合活性.当归贝母苦参丸29个潜在活性成分可能通过AKT1、TP53、TNF等靶点调控炎症反应来治疗慢性尿路感染.

Abstract

To investigate the mechanism of Angelica Fritilaria Sophorae Pill on chronic urinary tract infection. The chemical composition and target sites were obtained by searching the database. The study found that there were 29 active ingredients and 175 corresponding targets in Angelica Fritilaria Sophorae Pill. 7 600 targets for chronic urinary tract infection； There were 167 drug - disease intersection target genes. PPI analysis showed that the core targets were AKT1， TP53， TNF， etc. GO enrichment analysis identified 5 151 biological processes， 489 cellular components and 822 molecular functions. KEGG pathway analysis showed that they were enriched in TNF， IL - 17 and TLRs signaling pathways. Molecular docking showed that quercetin， β - carotene， luteolin， formononetin， and osterol had good binding activity with core proteins AKT1， TP53， TNF， IL - 6， and VEGFA. Conclusion the 29 potential active ingredients of Angelica Fritilaria Sophorae Pill may treat chronic urinary tract infection by regulating inflammatory response by targeting AKT1， TP53， TNF and other targets.

Graphical abstract

关键词

当归贝母苦参丸 / 慢性尿路感染 / 网络药理学 / 分子对接 / 作用机制

Key words

Angelica Fritilaria Sophorae Pill / chronic urinary tract infection / network pharmacology / molecular docking / mechanism of action

尿路感染（UTI）是一种常见的微生物感染，见于所有年龄和性别，涉及尿路炎症.这些感染的范围从单纯的膀胱炎症，即膀胱炎，到严重的尿毒性休克.尿路感染的临床指征取决于尿路的相关部位、病原体、感染强度和患者免疫系统的反应^［1］.作为临床最为常见的一种慢性进展性泌尿系统疾病，慢性尿路感染，起病隐匿，病理类型复杂多样，病情缠绵难愈，反复发作，治愈难度大^［2］.随着年龄的增长其发病率逐渐增高，老年女性发病率可达到10%～12%^［3］.目前现代医学主要以抗生素和免疫抑制剂对症治疗，抗生素的广泛使用极其容易导致患者机体菌群失调，引发各种并发症^［4］.慢性尿路感染在中医证属劳淋范畴^［5］，以尿频、尿急、尿痛为主要表现，一般病程持续6个月以上^［6］.中药方剂治疗慢性尿路感染经历了长期的临床实践，疗效突出，效果显著.

当归贝母苦参丸源自《金匮要略》，该方主要由当归、贝母、苦参3味药物等量为末，蜜丸而成.具有活血润燥、行气解郁、清利湿热之功效.仲景在方后特意标注“男子加滑石半两”，说明本方男女小便不利均可适用^［7］.当归贝母苦参丸虽原为妇科用药，但医家们在临床用来治疗尿路感染，疗效颇佳.因此，探究当归贝母苦参丸治疗慢性尿路感染的作用机制具有重要意义.

中药成分复杂，系统庞大，研究难度大.与许多其他中药一样，当归贝母苦参丸治疗慢性尿路感染的潜在机制仍不清楚.中药的特性使得传统方法难以充分了解这些含有多种活性成分的中药如何通过多种靶点和途径在人体内发挥协同生物作用^［8-9］.网络药理学方法打破了以往单一成分、单一靶点、疾病的概念，为中药“多成分、多靶点、多生物调控功能协同”模型的研究提供了有用的方法.本文利用网络药理学方法研究预测药物治疗疾病的成分、靶点、通路，然后再用分子对接技术对网络药理学结果进行验证.本研究不仅加速了药物的发现，也为临床进一步的精准用药提供了重要的参考，而且还节省了时间、精力.当归贝母苦参丸治疗慢性尿路感染的基因预测和分析程序如图1所示.

1 方法学

1.1 当归贝母苦参丸成分及靶点收集

中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：// old.tcmsp - e.com/ tcmsp.php）是一个免费和开放的数据库，其中包含了关于药物靶标和疾病之间的关系.在搜索框中，分别输入当归、贝母、苦参3味中药名称.临床治疗时，中药多采用口服给药，一般来说，按口服生物利用度（OB）为30%，药物相似性（DL）为0.18，可视为药物的主要活性成分来进行筛选^［10］.随后在Uniprot（https：//www.Uniprot.org/）数据库中，输入蛋白质名称，将靶点蛋白转化为对应的人类基因名，去除不含靶点的活性成分，获得活性成分及相关靶点信息.

1.2 慢性尿路感染疾病靶点预测

以“慢性尿路感染（chronic urinary tract infection）”为关键词，分别在OMIM数据库（https：//www.omim.org/）、GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）、Drugbank数据库（https：//go.drugbank.com/）、PharmGKB数据库（https：//www.pharmgkb.org/）、美国生物技术信息中心（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行检索，寻找慢性尿路感染的潜在靶点，且合并5个数据库中的靶点，去重后得到相关靶点和基因.

1.3 交集靶点的筛选

药物和疾病的复合靶点是药物作用于疾病的潜在靶点.本文采用在线微生信平台将当归贝母苦参丸和慢性尿路感染的靶点进行交叉，两者的共同靶点是当归贝母苦参丸对抗慢性尿路感染的相关靶点，用于后续分析.

1.4 构建当归贝母苦参丸 - 慢性尿路感染靶点的PPI网络

利用STRING在线数据库构建PPI网络.把交集靶点输入，设定Organism选项为“Homo sapiens”.为了进行视觉分析，将获得的TSV文件导入Cytoscape 3.9.1（https：//cytoscape.org/）.

1.5 GO和KEGG通路富集分析

使用Metascape（http：//metascape.org/）基因功能分析数据库，把成分与疾病共有的靶点上传，分析当归贝母苦参丸治疗慢性尿路感染主要的生物学过程与代谢通路并进行富集分析，物种选择“H.sapiens”“P - value < 0.01”，得到结果后，并绘制柱状图和气泡图.

1.6 分子对接

配体小分子准备：首先在TCMSP数据库中获取化合物，然后在PubChem数据库下载小分子结构文件，使用Chem3D软件进行分子力学能量最优化处理，得到最低能量小分子构象.受体蛋白准备：通过PDB数据库（https： //www.rcsb.org /）下载核心目标蛋白的晶体结构，然后在使用PyMOL软件删除蛋白质结构中的溶剂分子、原配体以及杂质分子.对接预处理：使用Auto Dock1.5.7软件对受体蛋白进行加氢处理，对配体小分子进行加氢和判定扭转键处理.分子对接：将处理好的受体和配体在Auto Dock中进行分子对接，根据蛋白库下载的蛋白质结构中自带小分子位置、以及通过pocasa蛋白活性位点在线预测网站所预测的结果确定对接口袋，并设置对接类型为半柔性对接，对接算法为拉马克遗传算法，运行Auto Dock得到对接结果.最后使用PyMOL等软件构建完整的2D和3D分子对接图.

2 结果

2.1 当归贝母苦参丸有效成分与靶点筛选

通过TCMSP数据库搜索，根据设定的OB、DL筛选标准，收集当归有效成分2个，浙贝母有效成分5个，苦参有效成分23个，筛除重复项后，当归贝母苦参丸有效成分共29个.与UniProt数据库相对比，共获得了175个药物靶点.见表1.

2.2 疾病靶点收集

以“慢性尿路感染”为检索词，在GeneCards数据库中检索到7 642个相关疾病靶点，OMIM数据库中检索到80个相关疾病靶点，PharmGKB数据库中检索到117个相关疾病靶点，美国生物技术信息中心数据库中检索到33个相关疾病靶点，Drugbank中检索到2个相关疾病靶点.将5个数据库的结果合并，去除重复，共得到7 600个与慢性尿路感染相关的靶点.

2.3 药物 - 有效成分 - 靶点网络的构建

将药物化合物靶点和药物的活性成分导入Cytoscape 3.9.1软件，构建当归贝母苦参丸可视化网络模型，包含207个节点，477条边.其中三角形代表当归贝母苦参丸的三味中药，蓝色六边形代表29个有效成分，绿色三角形代表175个药物靶点（见图２）.

2.4 交集靶点筛选

当归贝母苦参丸靶点175个和慢性尿路感染靶点7 600个，取交集获得167个共同靶点（见图3）.

2.5 PPI网络的构建与分析

在STRING平台（167个节点，2 701条边）上传“2.4”项所得到的167个交集靶点基因，设置置信度 > 0.40，构建PPI网络.将PPI网络图导入Cytoscape 3.9.1（163个节点，2 701条边）软件可视化处理，然后在使用CytoNCA插件计算网络的拓扑属性.经过筛选得到核心靶点为AKT1、TP53、TNF、IL - 6、VEGFA、CASP3、ESR1、MYC、EGFR、IL - 1β等（见图4和表2）.

2.6 当归贝母苦参丸治疗慢性尿路感染靶点的富集分析

借助 Metascape数据库，将当归贝母苦参丸治疗慢性尿路感染的的共有167个靶点进行GO富集分析，共筛选到5 151条生物过程（BP），BP类靶蛋白主要参与对激素的反应、细胞对有机环状化合物的反应、对异种生物刺激的反应等；共筛选出489条细胞组成（CC），主要包括膜筏、转录调节剂复合物、受体复合物等；共获得822条分子功能（MF），主要涉及核受体活性、DNA结合转录因子结合、蛋白结构域特异性结合等，柱状图见图5.

KEGG分析显示，关键靶基因富集于257个生物信号通路.对p值排序后分析前20个通路，绘制KEGG功能富集泡图（图6）.其中高度富集的通路主要包括TNF、IL - 17、TLRs信号通路等.

2.7 分子对接结果

为进一步证实当归贝母苦参丸的生物活性化合物是否能直接与核心靶点相互作用，通过分子对接的方式评估与关键靶点化合物之间的结合能和优势模式进行验证.根据之前“2.3”项排名前5核心成分为槲皮素（quercetin）、β - 胡萝卜素（beta - carotene）、木犀草素（luteolin）、芒柄花素（formononetin）、豆甾醇（stigmasterol），“2.5”项排名前5的靶点基因为AKT1、TP53、TNF、IL - 6、VEGFA，分别对它们进行分子对接.分子对接结果表明，关键成分与核心靶点AKT1、TP53、TNF、IL - 6、VEGFA的结合能均小于-5.0 kcal/mol，说明两者之间结合活性较好，并且VEGFA核心靶点与关键成分之间结合能均小于-7.0 kcal/mol，说明两者结合活性强烈，分子对接结果见图7.

AKT1组靶点蛋白AKT1与化合物Luteolin形成4条氢键，其中化合物与蛋白质A链的氨基酸残基GLN43和ALA50形成2条常规氢键（绿色虚线），氢键键长分别为2.2和1.8 Å（1 Å = 0.1 nm），与A链的GLN47形成2条π - 供体氢键（淡蓝色虚线），键长分别为3.5和3.7 Å，结合作用强烈.IL - 6组靶点蛋白IL - 6与化合物Formononetin形成3条氢键，其中化合物与蛋白质A链的氨基酸残基LEU63形成2条常规氢键，键长分别为2.8和3.3 Å.与A链的PRO66和GLU173形成2条碳氢键（淡蓝色虚线），键长分别为2.0和2.5 Å，结合作用优异.TNF组靶点蛋白TNF与化合物luteolin形成6条氢键，其中化合物与蛋白质A链的氨基酸残基GLY24、TRP28、ASN46以及ALA134形成5条常规氢键，键长分别为1.9、3.1、2.1、2.4和2.6 Å，与A链的LEU26形成一条π - 供体氢键，键长为3.1 Å，结合作用强烈.TP53组靶点蛋白TP53与化合物luteolin形成4条氢键，其中化合物与蛋白质A链的氨基酸残基ALA138和ASN200形成3条常规氢键，键长分别为2.3、2.4和2.5 Å，与A链的ASN235形成一条π - 供体氢键，键长为3.7 Å，结合作用强烈.VEGFA组靶点蛋白VEGFA与化合物β - sitosterol形成2条氢键，其中化合物与蛋白质L链的氨基酸残基THR85和LYS103形成2条常规氢键，键长分别为2.2和3.2 Å，结合作用优异.VEGFA组靶点蛋白VEGFA与化合物stigmasterol形成1条氢键，化合物与蛋白质L链氨基酸残基GLN38形成1条常规氢键，键长为3.3 Å，结合作用良好（图8a～f）.

3 讨论

现代药理学研究表明，当归中的阿魏酸等化学成分能增强前列腺素活性，发挥利尿通淋和行瘀散结的功效^［11］；浙贝母具有抗炎作用^［12］；苦参中含苦参碱、羟基苦参碱、黄酮类化合物等，有利尿、抗炎等作用^［13］.

3.1 当归贝母苦参丸富集分析

根据GO富集分析，靶点提示主要映射到对激素的反应、对有机环状化合物的反应、对异种生物刺激的反应.雌激素水平影响慢性尿路感染，它在慢性尿路感染中发挥着重要作用^［14］，当归贝母苦参丸可以提升雌激素，改善患者的生活质量.

KEGG富集分析结果提示，当归贝母苦参丸可能通过以下3条炎症相关通路发挥作用：

（1） IL - 17信号通路是最重要的通路之一.是由记忆性CD4⁺和CD8⁺T细胞产生的T细胞来源的细胞因子.IL - 17的促炎特性是其宿主保护能力的关键，但无限制的IL - 17信号传导与免疫病理、自身免疫性疾病有关^［15］.相关实验研究表明，IL - 17在膀胱内使炎症细胞因子促进细菌清除^［16］.IL - 17家族成员包括IL - 17A～IL - 17F.Sivick等^［17］证明IL - 17A在小鼠模型中对实验性UTI的先天免疫反应中发挥作用.

（2） KEGG富集结果显示TNF信号通路是最重要的信号通路，TNF有两种类型：肿瘤坏死因子α （TNF - α）和肿瘤坏死因子β （TNF - β）；TNF - α，主要由活化的巨噬细胞产生，是一种已知的促炎症细胞因子，在宿主对感染的初始反应和各种慢性免疫介导疾病的发病过程中起着重要作用^［18］.有研究^［19］表明，宫颈癌术后尿路感染，TNF - α炎性因子发挥抗感染的作用.

（3） TOLL样受体（TLRs）信号通路是一种跨膜模式识别受体，众多的先天免疫反应中，它们反应迅速，能够在人体的不同部位表达.是先天免疫网络反应的重要组成部分^［20］，在泌尿道防御系统和尿路感染预防中发挥关键作用^［21］.对于尿路感染，TLRs有不同的类型，它们可以保护宿主的泌尿道免受细菌、真菌和病毒等病原微生物的侵害，其介质、复合物和信号通路多种多样.其中，TLR2、TLR4和TLR5是尿路防御系统中最有效的分子^［22］.EL - Achkar等^［23］证实TLR4在防御泌尿系感染中发挥重要作用.尿路感染的致病性大肠杆菌菌株可通过TLR4连接蛋白的磷酸化激活TLR4信号级联反应，调控尿路感染小鼠的抗菌防御和炎症反应^［24］.

3.2 关键靶点的分析

通过PPI网络分析，结果提示当归贝母苦参丸的有效成分主要作用于AKT1、TP53、TNF、IL - 6、VEGFA等靶点发挥抗慢性尿路感染的作用，分子对接结果显示这些核心靶点与关键活性成分有较好的结合力.

AKT1是AKT激酶之一，AKT1主要参与细胞的生存通路和生长控制^［25］.AKT通过PI3K激活，即PI3K/AKT信号通路^［26］，在炎症疾病中发挥着重要作用^［27］.TP53是位于染色体17p13上的一个基因，它编码参与细胞周期调控的核蛋白（p53），调控细胞增殖、分化、凋亡、DNA修复、血管生成等环节^［28］.IL - 6属于白细胞介素家族的一种，在免疫、组织再生和新陈代谢方面具有多种生物学功能；IL - 6是重要的炎性递质和调节因子^［29］，在宿主抗菌素对尿路感染的反应中起重要作用.研究^［30］发现UTI大鼠模型IL - 6显著升高，说明慢性尿路感染与IL - 6炎症因子有关.VEGFA是一种多功能细胞因子，参与免疫调节功能^［31］.

因此，当归贝母苦参丸可通过这些重要靶点发挥治疗慢性尿路感染的作用，调节炎症介质水平，达到改善慢性尿路感染的目的.

3.3 当归贝母苦参丸的成分分析

在当归贝母苦参丸活性成分中，主要包括槲皮素、β - 胡萝卜素、木犀草素、芒柄花素、豆甾醇等，槲皮素具有很好的抗炎、抗菌、抗病毒作用^［32］；研究^［33］表明，槲皮素可通过降低炎症因子IL - 6而达到抗炎症的效果；β - 胡萝卜素具有抗炎作用，能够抑制炎症信号传导和组织损伤，降低炎性疾病的发病风险^［34］，除此之外，还可增强人体免疫力^［35］；木犀草素具有较强的抗炎作用^［36］，对Toll样受体4（TLR4）信号通路具有调控作用^［37］；芒柄花素是一种植物雌激素，且可发挥类雌激素作用^［38］；豆甾醇抗炎症，能显著降低IL - 6水平^［39］.可见，当归贝母苦参丸中的主要活性成分均可通过不同的机制治疗慢性尿路感染，验证了本文的可靠性.

4 结语

综上所述，对当归贝母苦参丸治疗慢性尿路感染作用靶点富集分析进行了研究，并对中药成分作用靶点网络图和蛋白相互作用网络图进行了网络拓扑分析，然后用分子对接技术进行了验证，证明当归贝母苦参丸是通过作用于AKT1、TP53、TNF、IL - 6、VEGFA等关键基因治疗慢性尿路感染，富集于TNF、IL - 17、TLRs炎症反应相关通路等多种生物功能中，也更好的发挥了治疗慢性尿路感染的药理作用，这也符合中医学的整体观念，体现了中医标本兼治的理论和法则，为后续进一步基础实验提供了方向.

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基金资助

山西省自然科学基金面上项目(20210302123228)

山西中医药大学科技创新团队(2022TD1011)