美洲大蠊多肽提取工艺优化及免疫活性验证

Optimization of Periplaneta americana polypeptide extraction process and verification of immune activity for Periplaneta americana

摘要

为探究美洲大蠊多肽的最佳提取工艺并对其免疫活性进行评价，以美洲大蠊为原料，通过对比超声波细胞破碎、胰蛋白酶酶解、中性蛋白酶酶解3种不同的提取方法，发现胰蛋白酶酶解提取效率最高.进一步探究酶底比、料液比、超声时间对美洲大蠊多肽得率的影响；采用CCK - 8法和中性红吞噬实验检测美洲大蠊多肽对RAW264.7细胞增殖和吞噬活性的影响.结果表明在酶底比5 000 U/g、料液比1∶20 g/mL、超声时间5 h的工艺条件下美洲大蠊多肽得率较高，为（11.92 ± 0.31）%.CCK - 8及中性红吞噬实验结果表明以质量浓度5 ~ 40 μg/mL给药时，RAW264.7细胞具有较好的增殖以及吞噬活力.体内实验结果亦表明美洲大蠊多肽在小鼠体内表现出较好的免疫活性.

Abstract

In order to explore the optimum extraction process of Periplaneta americana polypeptide and evaluate its immune activity， three different extraction methods of ultrasonic cell disruption， trypsin digestion and neutral protease digestion were compared by using Periplaneta americana as the raw material. It was found that trypsin digestion had the highest extraction efficiency. The effects of enzyme-to - substrate ratio， solid-liquid ratio and ultrasonic time on the yield of Periplaneta americana polypeptide were further investigated. The effects of Periplaneta americana polypeptide on the proliferation and phagocytic activity of RAW264.7 cells were detected by CCK - 8 method and neutral red phagocytosis assay. The results showed that the yield of Periplaneta americana polypeptide was （11.92 ± 0.31）% under the conditions of enzyme - substrate ratio 5 000 U/g， solid-liquid ratio 1∶20 g/mL and ultrasonic time 5 h. The results of CCK - 8 and neutral red phagocytosis experiments showed that RAW264.7 cells had better proliferation and phagocytic activity when the mass concentration was 5 to 40 μg/mL. The results of in vivo experiments also showed that Periplaneta americana polypeptide showed good immune activity in mice.

Graphical abstract

关键词

美洲大蠊 / 多肽 / 提取工艺 / 免疫活性

Key words

Periplaneta americana / polypeptide / extraction process / immune activity

美洲大蠊（Periplaneta americana L.）又名蜚蠊，作为药用始载于《神农本草经》，是一种具有悠久药用历史的动物类中药，传统上被用于治疗血瘀、症坚寒热等症状.美洲大蠊主要活性成分包括氨基酸、多肽、核苷、油脂等，具有抗炎、抗肿瘤、促进组织修复等多种药理作用^［1-2］.其中多肽作为美洲大蠊中最丰富的活性成分，具有抗肿瘤、免疫调节、促进伤口愈合等功效^［3-4］.尤其在免疫调节方面，已有众多研究^［5-7］表明美洲大蠊水溶性多肽可增强荷瘤小鼠免疫力，改善免疫微环境.

目前美洲大蠊多肽的提取工艺有乙醇回流、加水煎煮、酶解等^［8-11］，但回流和煎煮均为加热提取，提取过程长时间受热可能会导致多肽空间改变从而丧失活性.利用蛋白酶进行酶解可避免提取过程中受热，且有研究^［12-13］表明利用外源蛋白酶分解可提高蛋白质水解程度，并且不破坏多肽的空间结构，最大限度地保留活性.除此之外，超声波破碎法作为新的提取方法，可起到空化、粉碎、搅拌等特殊作用，具有省时、液量损失小、条件温和等优点^［14-15］.因此，本文以所得多肽总量为指标，考察酶解、超声2种低温提取方法的优劣，以及酶底比、料液比、超声时间（t）对多肽得率的影响；采用CCK - 8法探究美洲大蠊多肽对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7增殖的影响；采用中性红实验，验证多肽对RAW264.7细胞吞噬能力的影响；通过体内实验验证美洲大蠊多肽对小鼠免疫器官及免疫应答强度的影响，以期为美洲大蠊多肽在食品和生物医药领域的进一步研究和发展提供参考.

1 材料与仪器

美洲大蠊药材（山东省聊城市阳谷县瑞特美洲大蠊养殖基地）；RAW264.7小鼠巨噬细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司）；胰酶、中性蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司）；中性红细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（neutral red cell proliferation and cytotoxicity assay kit）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（BCA protein assay kit）（碧云天生物）；细胞增殖 - 毒性检测试剂盒（cell counting kit，CCK - 8）（Biosharp）.

组织破碎匀浆机（德国IKA公司）；倒置显微镜（德国莱卡公司）；生物安全柜（济南鑫贝西生物技术有限公司）；二氧化碳培养箱、酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司）；超声波细胞清洗机（昆山杰超声仪器有限公司）；循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸易有限公司）；超声波细胞破碎仪（郑州比朗仪器有限公司）；冷冻干燥机（宁波新芝生物科技有限公司）；冷冻离心机（德国艾本德公司）；分析天平（上海花潮电器有限公司）.

2 方法

2.1 多肽提取与分离

2.1.1 样品预处理

将美洲大蠊活虫冷冻处死，每组5 g利用匀浆机制成匀浆备用.

2.1.2 提取工艺筛选

目前，低温提取多肽的方法以酶解法为主，利用蛋白酶将大分子蛋白质水解为小分子肽促进溶出，且小分子肽往往能表现出更好的功效^［16-17］，除此之外，有研究^［18］表明利用超声波细胞破碎仪也可在低温条件下促进破碎释放蛋白.

参照蛤蜊多肽制备方法，采用胰蛋白酶和中性蛋白酶进行酶解^［19］，同时采用超声辅助，促进底物流动辅助酶的扩散，从而提高提取效率^［20］.取2组美洲大蠊匀浆，一组以5 000 U/g的酶底比加入中性蛋白酶，一组以5 000 U/g的酶底比加入胰蛋白酶，均以料液比1∶20 g/mL比例加入蒸馏水，在37 ℃超声酶解4 h，4 ℃静置沉淀，将上清液进行抽滤，除去不溶性杂质与凝固的脂肪；根据超声波细胞破碎仪说明书，取一组美洲大蠊匀浆采用超声波细胞破碎仪超声30 min，4 ℃下离心分离上清，沉淀继续加水超声，重复3次（第一次超声按料液比1∶8 g/mL加入蒸馏水，第二次和第三次按料液比1∶6 g/mL加入蒸馏水），合并3次所得提取液，4 ℃静置沉淀，将上清液进行抽滤除去不溶性杂质与凝固的脂肪.

将3组所得美洲大蠊多肽水提液进行蛋白浓度测定，计算多肽得率.

2.1.3 单因素考察

1）　酶底比对多肽得率的影响：固定超声时间4 h，料液比1∶20 g/mL，取4组美洲大蠊，按3 000、5 000、8 000和10 000 U/g加入胰酶，37 ℃条件下进行酶解.酶解结束后取3组所得美洲大蠊多肽水提液进行蛋白浓度测定，并计算多肽得率.

2）　料液比对提取率的影响：固定超声时间4 h，酶底比为5 000 U/g，取4组美洲大蠊，按料液比1∶10、1∶20、1∶30和1∶40 g/mL加入蒸馏水，37 ℃条件下进行酶解.酶解结束后取3组所得美洲大蠊多肽水提液除去沉淀进行蛋白浓度测定，计算多肽得率.

3）　酶解时间对提取率的影响：固定料液比为1∶20 g/mL，取4组美洲大蠊，按5 000 U/g加入胰蛋白酶，分别酶解2、3、4和5 h，取3组所得美洲大蠊多肽水提液进行蛋白浓度测定，并计算多肽得率.

2.1.4 正交优化

根据单因素实验结果，以酶底比、料液比、超声时间为考察因素，以美洲大蠊多肽得率为指标，设计正交实验，实验中各因素水平见表1.

2.1.5 提取液中多肽质量浓度的测定

各组所得多肽提取液使用PBS稀释20倍后，参照BCA蛋白浓度检测试剂盒说明书，检测多肽质量浓度，并计算各组多肽得率，见公式（1）.

\mathrm{美洲}\mathrm{大蠊}\mathrm{多肽}\mathrm{得率}=\frac{\mathrm{美洲}\mathrm{大蠊}\mathrm{多肽}\mathrm{总质}\mathrm{量}}{\mathrm{原料}\mathrm{总质}\mathrm{量}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}.（1）

2.2 免疫活性验证

2.2.1 RAW264.7细胞的复苏、培养

将RAW264.7细胞37 ℃水浴解冻，加入完全培养基（体积分数90% DMEM高糖培养基 + 体积分数10%胎牛血清 + 体积分数1%青链霉素），混匀，1 000 r/min离心4 min，弃去上清液，再次加入完全培养基吹打均匀，转移至细胞培养瓶内，置于培养箱中培养（5% CO₂、37 ℃）.

待细胞生长密度达到70% ~ 80%，状态良好，即可进行传代，弃去培养基，PBS洗2～3次，加入完全培养基，吹打至细胞完全脱落，按1∶2 ~ 1∶3比例传代，置于培养箱中培养.

2.2.2 含药培养基的配制

将最佳提取工艺下获得的多肽水提液，抽滤后过0.8 μm PES滤膜，将所得溶液进行冻干.精密称取10.00 mg冻干粉，加入9 mL DMEM高糖培养基，完全溶解后，生物安全柜内过0.22 μm除菌滤膜，将所得培养基加入体积分数10%胎牛血清与体积分数为1%的青链霉素，制成多肽质量浓度为1 mg/mL的完全培养基，临用前稀释.

2.2.3 CCK - 8法检测美洲大蠊多肽对RAW264.7增殖的影响

选取对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞密度至1 × 10⁵个/mL，接种于96孔板，100 μL/孔，置于培养箱内培养24 h，弃上清.加入不同质量浓度的美洲大蠊多肽，每个浓度设6个复孔，同时设置空白对照组.给药后，置培养箱内继续培养24 h，每孔加入10 μL CCK - 8试剂，培养箱中避光孵育1.5 h，450 nm处检测各孔光密度值（OD值），计算细胞活力，见公式（2）.

\mathrm{细胞}\mathrm{活力}=\frac{\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{(\mathrm{加药})}-\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{(\mathrm{空白})}}{\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{(\mathrm{0}\mathrm{加药})}-\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{(\mathrm{空白})}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}.（2）

2.2.4 中性红实验检测美洲大蠊多肽对RAW264.7细胞吞噬能力的影响

取对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞密度为1.5 × 10⁵ 个/mL，接种于96孔板，100 μL/孔，培养24 h，弃上清.加入不同质量浓度的美洲大蠊多肽，每个浓度设6个复孔，同时设置空白对照组.置培养箱内继续培养24 h后，弃上清，用PBS洗3遍，每孔加入200 μL培养基以及20 μL中性红染液，继续培养30 min.弃去上清液，每孔加入200 µL细胞裂解液，置摇床上裂解15 min，酶标仪测定540 nm处OD′值，见公式（3）.

\mathrm{吞噬}\mathrm{率}=\frac{\mathrm{O}\mathrm{D}{\mathrm{\text{'}}}_{(\mathrm{加药})}-\mathrm{O}\mathrm{D}{\mathrm{\text{'}}}_{(\mathrm{空白})}}{\mathrm{O}\mathrm{D}{\mathrm{\text{'}}}_{(\mathrm{0}\mathrm{加药})}-\mathrm{O}\mathrm{D}{\mathrm{\text{'}}}_{(\mathrm{空白})}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}.（3）

2.3 体内实验验证

以细胞实验给药质量浓度为参照，设置高（160 mg/kg）、中（80 mg/kg）、低（40 mg/kg）给药质量浓度对Balb/c小鼠进行灌胃，空白组灌胃等体积蒸馏水，连续给药，在给药第11天将0.2 mL 5%（体积分数）的绵羊红细胞注射到小鼠腹腔内.使用游标卡尺测量右后足跖的厚度，4 d后，将20 μL 体积分数为20%的绵羊红细胞注入到小鼠右后足跖.在第二次注射后的24 h，测定足跖的厚度，同一部位测量3次，取平均值.以小鼠足趾厚度的增加量作为评估迟发型变态反应程度的指标，评估小鼠免疫应答强度.给药结束后，处死小鼠，取小鼠免疫器官胸腺和脾，进行称重，计算免疫器官指数，见公式（4）.

\mathrm{免疫}\mathrm{器官}\mathrm{指数}=\frac{\mathrm{免疫}\mathrm{器官}\mathrm{质量}}{\mathrm{小鼠}\mathrm{体重}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}.（4）

式中，免疫器官质量单位为mg；小鼠体重单位为g.

3 结果与分析

3.1 美洲大蠊多肽提取工艺

测定超声波破碎提取、胰蛋白酶酶解、中性蛋白酶酶解3组水提液的多肽质量浓度，并进一步计算多肽得率.结果表明，超声波破碎提取多肽得率为（6.75 ± 0.2）%，中性蛋白酶酶解法得率为（9.86 ± 0.28）%，胰蛋白酶酶解法得率为（10.68 ± 0.35）%.虽然超声法提取时间较短，但提取率过低，且并不适于大量提取，因此在生产中并不适用，而胰蛋白酶酶解法提取率较高，条件温和，操作简便，可实现大批量生产，且胰蛋白酶酶解水提液经BCA实验检测计算所得多肽总质量与冻干后所得冻干粉质量相同，表明所得多肽提取液中基本没有其余杂质，可避免杂质对后续实验的影响.

3.2 单因素考察结果分析

3.2.1 酶的活力对提取率的影响

酶作为蛋白水解过程的催化剂，增加其用量可在一定程度上提高蛋白的水解溶出率^［21］.如图1，适当增加酶用量从而提高酶底比可在一定程度上促进蛋白的水解以及多肽的溶出，但酶作为高效的生物催化剂，当其用量超过一定值后催化效果便会趋于平稳，因此8 000和10 000 U/g两组与5 000 U/g组多肽得率并无显著区别，且酶的用量增加造成浪费.

3.2.2 料液比对提取率的影响

料液比对细胞膜内外渗透速率有一定影响，扩大料液比能促进有效成分的溶出^［22］，但同时也会增加后续浓缩的成本.如图2所示，随料液比增大，多肽得率呈现上升趋势，由料液比为1∶10 g/mL时的（9.56 ± 0.56）%增加至1∶40 g/mL时的（11.68 ± 0.28）%，但当料液比超过1∶20 g/mL后多肽得率并无显著变化.兼顾料液比增加对多肽得率的影响以及后期浓缩成本，1∶20 g/mL的料液比时较为适于提取.

3.2.3 超声时间对提取率的影响

超声时间是影响多肽得率的一个重要因素，一定范围内延长超声时间，有利于有效成分的溶出^［23］.图3显示，美洲大蠊多肽得率随着超声时间的延长呈现由快至缓的上涨趋势，超声时间为2 h时，美洲大蠊多肽得率仅为（6.53 ± 0.15）%，超声时间延长至4 h后，美洲大蠊多肽得率增加至（11.3 ± 0.26）%，但继续延长超声时间至5 h，多肽得率并没有显著提高.

3.3 正交实验

根据从单因素试验得出的最佳条件，进行三因素三水平正交实验分析.正交实验结果、方差分析结果见表2和3，根据R值可知影响美洲大蠊多肽得率的因素的主次关系为：料液比 > 超声时间 > 酶底比.极差分析可得美洲大蠊多肽得率最佳因素为A₃B₂C₃，即酶底比8 000 U/g、料液比1∶20 g/mL、超声时间5 h.

3.4 最佳提取工艺确定

通过单因素考察结果可知增加酶的用量、提高料液比、延长超声时间均可在一定程度上提高美洲大蠊多肽得率.根据正交实验结果可得酶底比8 000 U/g、料液比1∶20 g/mL、超声时间5 h，且单因素考察实验结果表明继续提高料液比或增酶的用量对多肽得率的影响微乎其微.因此综合考量得到美洲大蠊多肽最优提取工艺为酶底比5 000 U/g、料液比1∶20 g/mL、超声时间5 h，在此工艺条件下重复提取3次，多肽得率分别为12.13%、11.56%、12.06%，对应的RSD为2.61%，误差较小.

3.5 美洲大蠊多肽对RAW264.7细胞增殖的影响

利用CCK - 8试剂盒检测多肽对RAW264.7细胞增殖的影响.如图4所示，多肽质量浓度在5 ~ 80 μg/mL均表现促进巨噬细胞增殖的效果，且多肽质量浓度在10 ~ 40 μg/mL时，细胞活力均在120%以上，活性较好.

3.6 不同质量浓度多肽对RAW264.7细胞吞噬能力的影响

利用中性红试剂盒检测不同质量浓度多肽对RAW264.7细胞吞噬能力的影响.如图5所示，多肽质量浓度在5 ~ 40 μg/mL均表现出促进吞噬效果，且给药质量浓度在10 μg/mL时，巨噬细胞吞噬率超过130%，效果最为显著.

3.7 体内实验

综合CCK - 8与中性红实验，多肽质量浓度为10 μg/mL可显著提高巨噬细胞吞噬能力并对巨噬细胞增殖具有较好的促进作用，取40、80和160 mg/kg 3个质量浓度为给药低、中、高剂量对小鼠进行给药.

迟发型变态反应为小鼠第二次接触抗原引起的体液免疫应答，可根据足趾肿胀程度评估小鼠免疫应答强度.如图6，给药后小鼠足趾肿胀程度显著提高，40 mg/kg组小鼠足趾厚度肿胀比例为156.53%，80 mg/kg组为174.42%，160 mg/kg组为171.46%，都远超空白组肿胀比例129.21%，表明3个给药组免疫应答强度远高于空白组，美洲大蠊可显著提高小鼠免疫应答强度.

免疫器官指数是反映机体免疫功能的一个重要指标，与免疫器官的发育状态、免疫细胞的数量和活性以及免疫应答的强度密切相关.其中胸腺和脾为主要的免疫器官，如图7所示，给药美洲大蠊多肽后小鼠胸腺指数和脾指数均有所提升.如图8所示，与空白组小鼠（图8a）相比，给药组小鼠（图8b ~ d）脾脏体积较大，由此可知美洲大蠊多肽在体内也可显著提高小鼠免疫力.

4 结语

针对美洲大蠊多肽的提取工艺进行了优化，对比了超声波细胞破碎、胰蛋白酶酶解、中性蛋白酶酶解3种不同的提取方法，结果显示胰酶酶解多肽得率最高.同时，通过单因素考察、正交实验，考察酶底比、料液比、超声时间对美洲大蠊多肽得率的影响，并筛选得到最佳提取工艺为胰酶酶解，酶底比5 000 U/g、料液比1∶20 g/mL、超声时间5 h.且美洲大蠊多肽对巨噬细胞无明显毒性并促进巨噬细胞的增殖和吞噬，体内实验的结果也进一步证实了美洲大蠊多肽的生物活性.本文进一步揭示了美洲大蠊多肽潜在的生物活性，为美洲大蠊多肽的工业化提取提供了可靠的工艺参数，也为其在生物医药领域的应用潜力奠定了坚实的基础和科学依据.

参考文献

[1] 高阳阳，耿福能，陈思敏，等.美洲大蠊的有效成分及相关药理学研究进展［J］.中国实验方剂学杂志，2021，27（4）： 240 - 250.

[2] 王钦，刘克娜，孔彩华，等.美洲大蠊有效成分的提取及药理活性研究进展［J］.中华中医药学刊，2021，39（8）：108 - 111.

[3] 廖芳，朱伟，周洁，等.大孔吸附树脂纯化美洲大蠊多肽的工艺研究［J］.中草药，2016，47（19）：3420 -3 425.

[4] 陈雅婷，兰昱，邓子贤，等.美洲大蠊多肽的药理作用研究进展［J］.现代药物与临床，2023，38（10）：2614 - 2619.

[5] 许康.美洲大蠊精制物CⅡ - 3在抗乳腺癌免疫中对T细胞及其PD - 1表达的影响［D］.大理：大理大学，2023.

[6] 欧红利，常旭，王聪，等.美洲大蠊多肽对L1210荷瘤小鼠抗肿瘤免疫的初步研究［J］.中国药学杂志，2018，53（5）：353 - 358.

[7] 欧红利.美洲大蠊多肽抗肿瘤及免疫调节作用研究［D］.大理：大理大学，2017.

[8] 耿巧玉，张晓平，丰茂秀，等.美洲大蠊药效物质提取工艺优化［J］.环球中医药，2019，12（3）：352 - 356.

[9] 耿巧玉，刘金安，范路路，等.美洲大蠊的炮制、提取工艺及药理活性的研究进展［J］.食品与药品，2019，21（2）：166 - 168.

[10] 刘颖，王彦多，曹广超，等.美洲大蠊粉酶解工艺最佳用酶初步筛选［J］.西部中医药，2019，32（9）：21 - 24.

[11] 杨华蕊，赵艳雯，杨永寿，等.美洲大蠊抗肝纤维化活性提取物的酶解制备工艺研究［J］.中国现代应用药学，2019，36（16）：1985 - 1991.

[12] MUTAMIMAH D， IBRAHIM B， TRILAKSANI W. Antioxidant activity of protein hydrolysate produced from tuna eye （Thunnus sp.） by enzymatic hydrolysis［J］. Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia，2018，21（3）：522 - 522.

[13] SIVARAMAN B， SHAKILA R J， JEYASEKARAN G， et al. Antioxidant activities of squid protein hydrolysates prepared with papain using response surface methodology. ［J］. Food science and biotechnology，2016，25（3）：665 - 672.

[14] IDA Y， TUZIUTI T， YASUI K， et al. Protein release from yeast cells as an evaluation method of physical effects in ultrasonic field［J］. Ultrasonics - Sonochemistry，2008，15（6）：995 - 1000.

[15] FAN W， DUAN H Y， REN X L， et al. Optimization of ultrasound - assisted cellulase degradation method on the extraction of mulberry leaf protein and its effect on the functional characteristics［J］. Ultrasonics Sonochemistry 2023，99：106561 - 106561.

[16] 王洪涛.海参肽的酶法制备工艺及抗疲劳活性研究［D］.烟台：烟台大学，2007.

[17] NISHANI J J， NIPUNA D W， ISURU W， et al. Holothuria atra： an underutilized marine resource for nutritionaland collagen benefits［J］. Asian Journal of Biotechnology and Bioresource Technology，2023，9（3）：41 - 51.

[18] DAN L， XINAN Z， DAWEN S， et al. Disruption and protein release by ultrasonication of yeast cells［J］. Innovative Food Science and Emerging Technologies，2013，18：132 - 137.

[19] 付雪媛，杜芬，孙呈浩，等.蛤蜊肽的制备工艺优化及其增强免疫活性［J］.食品工业科技，2023，44（9）：244 - 253.

[20] QUAISIE J， MA H， YITING G， et al. Impact of sonication on slurry shear - thinning of protein from sea cucumber （Apostichopus japonicus）： proteolytic reaction kinetics， thermodynamics， and conformational modification［J］. Innovative Food Science & Emerging Technologies，2021，70：102678.

[21] 樊芳芳，付玉状，曹泽星.酶催化过程的量子 - 经典力学研究进展［J］.科学通报，2021，66（10）：1131 - 1143.

[22] 王红，彭励，宋乐，等.银柴胡多糖超声辅助提取工艺优化及抗氧化活性分析［J］.食品工业科技，2024，45（1）：185 - 191.

[23] ARAGÃO S J J R， GUIMARÃES V M， CARLOS H P， et al. Enzymatic hydrolysis of pacific white shrimp residue （Litopenaeus vannamei） with ultrasound aid［J］. Journal of Aquatic Food Product Technology，2022，31（10）：1061 - 1071.

基金资助

山东省重点研发计划(2022TZXD0035)

日照市重点研发计划(2021ZDYF010118)